大腸菌群測定

關(guān)于大腸菌群測定大腸菌群的定義

大腸菌群：一群在37℃，經(jīng)24h能發(fā)酵乳糖，并產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧或兼性厭氧生長的革蘭氏陰性的無芽孢桿菌。

其中包括有大腸桿菌（也稱大腸埃希氏菌）、腸桿菌屬、枸櫞酸菌屬、克雷伯氏菌屬中的一部分和沙門氏菌屬的第Ⅲ亞屬。P139第2頁,共23頁，2024年2月25日，星期天大腸桿菌的定義大腸桿菌指革蘭氏陰性無芽孢桿菌、乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣、IMViC試驗（靛基質(zhì)、MR、V-P、檸檬酸鹽試驗）為++--或-+--的細(xì)菌。大腸桿菌（也稱大腸埃希氏菌），分類于腸桿菌科，歸屬于埃希氏菌屬。與人類有關(guān)的大腸桿菌統(tǒng)稱為致瀉性大腸桿菌，包括五種：腸毒素性大腸桿菌（ETEC）、致病性大腸桿菌（EPEC）、出血性大腸桿菌（EHEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、黏附性大腸桿菌（EAEC）。第3頁,共23頁，2024年2月25日，星期天大腸菌群和大腸桿菌的關(guān)系耐熱大腸菌群的定義：能在液體乳糖培養(yǎng)基中35/37℃培養(yǎng)48h產(chǎn)酸產(chǎn)氣，并在44.5℃培養(yǎng)24h產(chǎn)酸產(chǎn)氣的細(xì)菌（依據(jù)ISO標(biāo)準(zhǔn)）第4頁,共23頁，2024年2月25日，星期天衛(wèi)生學(xué)意義大腸菌群和大腸桿菌作為食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的意義在于，是評價衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)，作為食品中的糞便污染指標(biāo)。另外，腸道致病菌如沙門氏菌屬和志賀氏菌屬等，對食品安全性威脅很大。經(jīng)常檢驗致病菌有一定困難。而食品中的大腸菌群較容易檢出，腸道致病菌與大腸菌群的來源相同，而且在一般條件下大腸菌群在外環(huán)境中生存時間也與主要腸道致病菌一致．所以大腸菌群的另一重要食品衛(wèi)生意義是作為腸道致病菌污染食品的指示菌．大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小。第5頁,共23頁，2024年2月25日，星期天大腸桿菌的生物學(xué)特性基本形態(tài)：

此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般約0.5-0.8μm*1.0-3.0μm，多單獨存在或成雙，但不呈長鏈排列。約50%的菌株有周生鞭毛，但多數(shù)只有1-4根，一般不超過10根，故菌體動力弱。多數(shù)菌株有菌毛，有的有莢膜或微莢膜，不形成芽孢，對普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。第6頁,共23頁，2024年2月25日，星期天大腸桿菌的生物學(xué)特性培養(yǎng)特性：大腸桿菌合成代謝能力強(qiáng)，在含無機(jī)鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長良好。最適生長溫度為37℃，在42-44℃條件下仍能生長，生長溫度范圍15-46℃。

在普通營養(yǎng)瓊脂上有3種菌落形態(tài)：

1）光滑型：菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤、光滑、呈灰色，在生理鹽水中易分散；

2）粗糙型：菌落扁平、干澀、邊緣不整齊，易在生理鹽水中自凝；

3）黏液型：常為含有莢膜的菌株。第7頁,共23頁，2024年2月25日，星期天 食品中大腸菌群數(shù)是以每100mL（g）檢樣內(nèi)大腸菌群最近似數(shù)（MPN）表示。大腸菌群數(shù)的定義第8頁,共23頁，2024年2月25日，星期天P142第9頁,共23頁，2024年2月25日，星期天

GB/T4789.3-2010大腸菌群

初發(fā)酵復(fù)發(fā)酵24±2h~48±2h大腸菌群MPN計數(shù)法操作步驟第10頁,共23頁，2024年2月25日，星期天實驗材料檢測樣品：奶粉設(shè)備和材料：恒溫培養(yǎng)箱、天平、搖床、無菌移液管（1ml）、無菌錐形瓶、無菌試管、小倒管、精密pH試紙培養(yǎng)基和試劑：LST肉湯、BGLB肉湯、無菌生理鹽水、1mol/LNaOH、1mol/LHCl第11頁,共23頁，2024年2月25日，星期天實驗步驟：前期準(zhǔn)備每個小組準(zhǔn)備器材：移液管1mlX6、10mlX2、錐形瓶500mlX2、試管X14準(zhǔn)備試劑：配制：LST肉湯（1000ml）和BGLB肉湯生理鹽水（500ml）

第12頁,共23頁，2024年2月25日，星期天相關(guān)配方第13頁,共23頁，2024年2月25日，星期天相關(guān)配方生理鹽水：8.5g+1000ml蒸餾水（一錐形瓶瓶裝225ml，剩下的裝在另外一個錐形瓶中）第14頁,共23頁，2024年2月25日，星期天將相關(guān)玻璃儀器進(jìn)行滅菌前包裝將配制好的LST肉湯加入試管中（注意1），然后小心將小倒管放入肉湯中（注意2）（每組10支）將所有東西包扎好放入滅菌鍋中滅菌20min實驗步驟：前期準(zhǔn)備第15頁,共23頁，2024年2月25日，星期天實驗步驟：檢樣稀釋稱取25g樣品→加入225ml生理鹽水中→搖床勻質(zhì)→制成1:10樣品勻液取一支無菌試管+9ml生理鹽水→+1ml1:10樣品→制成1:100稀釋液如2方法制成1:1000稀釋液（注意3）分別標(biāo)注好標(biāo)號第16頁,共23頁，2024年2月25日，星期天實驗步驟：初發(fā)酵用1ml無菌移液管分別吸取3個稀釋度的稀釋樣品至LST肉湯發(fā)酵試管中（每一稀釋度3管）加好后塞好試管塞，放進(jìn)培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48h第17頁,共23頁，2024年2月25日，星期天實驗步驟：復(fù)發(fā)酵將LTS發(fā)酵管取出，觀察倒管是否有氣泡，將初發(fā)酵產(chǎn)氣的管數(shù)種類進(jìn)行記錄注意：在發(fā)酵試驗工作中，經(jīng)常可以看到在發(fā)酵倒管內(nèi)極微少的氣泡（有時比小米粒還?。?，有時可以遇到在初發(fā)酵時產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。實驗表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問時，可以用手輕輕打動試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進(jìn)一步試驗。

第18頁,共23頁，2024年2月25日，星期天實驗步驟：復(fù)發(fā)酵與結(jié)果準(zhǔn)備BGLB肉湯發(fā)酵管（分裝、滅菌等）用接種環(huán)接一環(huán)產(chǎn)氣的LTS發(fā)酵管至BGLB發(fā)酵管中，并記號放進(jìn)培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h取出觀察倒管是否產(chǎn)氣，如果兩種發(fā)酵管均產(chǎn)氣則證實為大腸菌群陽性，并根據(jù)管數(shù)查MPN檢測表（P142-143），得出MPN值第19頁,共23頁，2024年2月25日，星期天大腸菌群測定——MPN法檢驗幾點說明MPN檢索表：

MPN為最大可能數(shù)(MostProbableNumber)的簡稱。這種方法，對樣品進(jìn)行連續(xù)系列稀釋，加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，從規(guī)定的反應(yīng)呈陽性管數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來推算樣品中菌數(shù)最近似的數(shù)值。MPN檢索表只給了三個稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。第20頁,共23頁，2024年2月25日，星期天初發(fā)酵和證實試驗：

1）兩步法進(jìn)行了兩次乳糖發(fā)酵試驗。初發(fā)酵和證實實驗所用培養(yǎng)基不同，但都是為了證實培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義，即“在37℃分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。LST中提供了磷酸鹽緩沖體系，氯化鈉可維持滲透壓，月桂基硫酸鈉可抑制非大腸菌群的生長，這個緩沖蛋白胨乳糖肉湯允許“緩慢乳糖發(fā)酵（Slowlactosefermentations）”來促進(jìn)菌體產(chǎn)氣。BGLB中膽鹽和煌綠可以抑制革蘭氏陽性細(xì)菌和除了大腸菌群的很多革蘭氏陰性細(xì)菌。

2）初發(fā)酵陽性管，不能肯定就是大腸菌群細(xì)菌，經(jīng)過證實試驗后，有時可能成為陰性。有數(shù)據(jù)表明，食品中大腸菌群檢驗步驟的符合率，初發(fā)酵與證實試驗相差較大。因此，在實際檢測工作中，證實試驗是必需的。大腸菌群測定——MPN法檢驗幾點說明第21頁,共23頁，2024年