GB-T工業(yè)微生物菌株質(zhì)量評(píng)價(jià) 拉曼光譜法征求意見(jiàn)稿

ICS07.080

A21

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

GB/TXXXXX—201X

工業(yè)微生物菌株質(zhì)量評(píng)價(jià)拉曼光譜法

Evaluationofindustrialmicroorganismstrain——Ramanspectroscopy

（征求意見(jiàn)稿）

201X-XX-XX發(fā)布201X-XX-XX實(shí)施

中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布

中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)1化管理委員會(huì)

GB/T××××—201×

GB/T××××—201×

工業(yè)微生物菌株質(zhì)量評(píng)價(jià)拉曼光譜法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了工業(yè)微生物菌株質(zhì)量評(píng)價(jià)拉曼光譜法的原理、試劑材料、儀器設(shè)備、操作步驟、結(jié)果

分析。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于工業(yè)微生物菌株的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3原理

利用高度匯聚的激光束，囚禁溶液中的活細(xì)胞，再通過(guò)瞬時(shí)加大囚禁細(xì)胞的光束激發(fā)細(xì)胞內(nèi)分子的

拉曼散射。

4試劑材料

除特殊說(shuō)明外，本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純，水均為符合GB/T6682中規(guī)定的二級(jí)水。

4.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基

按照GB/T15818中方法配制?；蜻x用商品化的預(yù)制干燥培養(yǎng)基，嚴(yán)格按照商品說(shuō)明書(shū)加水配制。

5儀器設(shè)備

5.1單細(xì)胞拉曼光譜測(cè)試系統(tǒng)：532nm激光，輸出強(qiáng)度不低于100mW，800mm長(zhǎng)焦，600刻線光柵，100

倍物鏡，光譜分辨率不低于2cm-1，波數(shù)范圍需包含“指紋區(qū)”，即390cm-1～1800cm-1。

5.2離心機(jī)

5.3無(wú)菌EP管：容量1.5毫升。

5.4微量移液器及槍頭：1毫升，200微升，10微升。

5.5氟化鈣載玻片：尺寸25.4mm*76.2mm

6操作步驟

6.1細(xì)胞培養(yǎng)

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取活化過(guò)的表型明確的菌株及待評(píng)價(jià)菌株，以相同的濃度一式三份接種至標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中；在相同的

培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至相同的生長(zhǎng)階段。其中以表型明確的菌株作為對(duì)照組。

6.2前處理

每個(gè)樣本取1mL菌液，常溫4500rpm離心5min，取到上清，收集菌體。然后加入1mL符合GB/T6682

要求的無(wú)菌雙蒸水，用移液槍輕輕吹打重懸菌體，反復(fù)清洗3次后，再加如1mL無(wú)菌雙蒸水，重懸菌體。

用無(wú)菌雙蒸水將菌液稀釋100倍。最后用移液槍吸取2uL稀釋過(guò)的菌液，點(diǎn)樣在潔凈的CaF2載玻片上，

室溫風(fēng)干。

6.3測(cè)量

提前半小時(shí)打開(kāi)拉曼檢測(cè)系統(tǒng)的532nm激光器，設(shè)置輸出功率為100mW。

將硅片置于樣品臺(tái)，100倍物鏡聚焦硅片表面，設(shè)置光柵為600格柵；調(diào)整光柵位置將圭峰調(diào)整至

520.7cm-1。

將風(fēng)干后的CaF2載玻片，置于顯微拉曼光譜儀載物臺(tái)上，100倍物鏡找到細(xì)胞。

調(diào)整濾光片使照射于細(xì)胞上的激光光強(qiáng)約為25mW，光譜采集時(shí)間為10s，波數(shù)范圍需包括“指紋

區(qū)”即400cm-1～1850cm-1。

每個(gè)樣本隨機(jī)選取20個(gè)細(xì)胞采集其單細(xì)胞拉曼光譜數(shù)據(jù)，選取4個(gè)細(xì)胞旁邊采集背景信號(hào)。

6.4數(shù)據(jù)前處理

原始拉曼數(shù)據(jù)用軟件進(jìn)行處理，包括減背景、基線校正和基于面積的歸一化處理。

采用平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差（StandardDeviationoftheMeans，SDM）進(jìn)行拉曼光譜質(zhì)量檢測(cè)，SDM值

越小說(shuō)明數(shù)據(jù)的可重復(fù)性越高，SDM需小于0.2；且以細(xì)胞數(shù)為橫坐標(biāo)，SDM值為縱坐標(biāo)作圖，曲線達(dá)到

飽和，說(shuō)明細(xì)胞數(shù)已足夠，滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)分析基本要求。

7結(jié)果分析

7.1結(jié)果計(jì)算

樣本間表型的相似程度按式（1）計(jì)算：

………………….（1）

式中：

R——相似程度；

Rb——組間差異均值；

Rw——組內(nèi)差異均值；

2

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N——組內(nèi)樣本個(gè)數(shù)。

7.2結(jié)果分析

評(píng)價(jià)待選菌株與對(duì)照菌株相似性程度的R值，越小（最小為0）說(shuō)明組間差異越小，即待評(píng)價(jià)組表型

與對(duì)照組越接近，當(dāng)R值小于0.1時(shí)，可認(rèn)為待選株表型與對(duì)照組相似；R值越大（最大為1）說(shuō)明待評(píng)價(jià)

組表型與對(duì)照組差異越大，即待評(píng)價(jià)組表型與對(duì)照組越不接近。

7.3重復(fù)性

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算