免疫細(xì)胞的分離與檢驗(yàn)

關(guān)于免疫細(xì)胞的分離與檢驗(yàn)

第一節(jié)免疫細(xì)胞的分類與分離一、免疫細(xì)胞的種類與特征二、免疫細(xì)胞的分離技術(shù)三、細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇第2頁,共60頁，2024年2月25日，星期天免疫細(xì)胞的特征1、免疫細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征理化性狀生物學(xué)特性2、免疫細(xì)胞的膜分子特征

CD分子第3頁,共60頁，2024年2月25日，星期天

免疫細(xì)胞的起源與分化

紅細(xì)胞血小板肥大細(xì)胞中性粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞樹突狀細(xì)胞漿細(xì)胞T細(xì)胞NK細(xì)胞第4頁,共60頁，2024年2月25日，星期天免疫細(xì)胞的分離技術(shù)1、密度梯度離心法2、黏附分離法3、熒光激活分離法4、磁性分離法5、其他分離法第5頁,共60頁，2024年2月25日，星期天密度梯度離心法離心前離心后稀釋抗凝血淋巴細(xì)胞分離液血漿單個(gè)核細(xì)胞粒細(xì)胞紅細(xì)胞第6頁,共60頁，2024年2月25日，星期天沉降速度=2r2（Q—Q0）9

xgQ=顆粒比重Q0=溶質(zhì)比重r=顆粒半徑

=形狀因子=顆粒摩擦系數(shù)/同體積球型顆粒摩擦系數(shù)

=粘稠度g=相對離心力第7頁,共60頁，2024年2月25日，星期天人類血液有形成分的平均密度與直徑

密度直徑（

）血小板1.04—1.06淋巴細(xì)胞1.06—1.088—10粒細(xì)胞1.08—1.0913紅細(xì)胞1.09—1.107.5第8頁,共60頁，2024年2月25日，星期天黏附分離法尼龍毛法貼壁法親和板法吸附柱法第9頁,共60頁，2024年2月25日，星期天熒光激活分離法（FACS）熒光檢測器濾光片透鏡接物鏡激光束偏轉(zhuǎn)板噴嘴細(xì)胞收集管流體護(hù)套樣品第10頁,共60頁，2024年2月25日，星期天流式細(xì)胞儀第11頁,共60頁，2024年2月25日，星期天磁性分離法磁鐵吸引法磁式細(xì)胞分類術(shù)法第12頁,共60頁，2024年2月25日，星期天MACS(陽性選擇法）NS第13頁,共60頁，2024年2月25日，星期天MACS(陰性選擇法）NS第14頁,共60頁，2024年2月25日，星期天第15頁,共60頁，2024年2月25日，星期天其他分離法花環(huán)沉降法細(xì)胞活化克隆法MHC分子四聚體法第16頁,共60頁，2024年2月25日，星期天抗原肽-MHC分子四聚體技術(shù)T第17頁,共60頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇細(xì)胞凍存的原理與方法細(xì)胞復(fù)蘇的原理與方法第18頁,共60頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞凍存罐第19頁,共60頁，2024年2月25日，星期天

第二節(jié)免疫細(xì)胞膜分子的檢測一、免疫細(xì)胞膜分子檢測的原理與類型二、免疫細(xì)胞膜分子的檢測方法第20頁,共60頁，2024年2月25日，星期天免疫細(xì)胞膜分子檢測的原理與類型1、以抗體識(shí)別抗原2、以配體識(shí)別受體第21頁,共60頁，2024年2月25日，星期天免疫細(xì)胞膜分子的主要檢測方法1、免疫標(biāo)記檢測方法熒光抗體法酶免疫檢測法免疫金銀染色法2、補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒試驗(yàn)（CDC）3、花環(huán)形成試驗(yàn)第22頁,共60頁，2024年2月25日，星期天SmIg的熒光抗體檢測法第23頁,共60頁，2024年2月25日，星期天SmIg的酶免疫檢測法第24頁,共60頁，2024年2月25日，星期天補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒試驗(yàn)（CDC）染料補(bǔ)體第25頁,共60頁，2024年2月25日，星期天E-花環(huán)T細(xì)胞B細(xì)胞花環(huán)形成細(xì)胞綿羊紅細(xì)胞第26頁,共60頁，2024年2月25日，星期天第27頁,共60頁，2024年2月25日，星期天EA-花環(huán)第28頁,共60頁，2024年2月25日，星期天EAC-花環(huán)第29頁,共60頁，2024年2月25日，星期天

第三節(jié)免疫細(xì)胞功能測定一、轉(zhuǎn)化、增殖試驗(yàn)二、細(xì)胞毒試驗(yàn)三、抗體形成試驗(yàn)四、細(xì)胞吞噬與殺傷試驗(yàn)第30頁,共60頁，2024年2月25日，星期天1、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)2、混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)化、增殖試驗(yàn)第31頁,共60頁，2024年2月25日，星期天第32頁,共60頁，2024年2月25日，星期天放射性測定3H-TdR絲裂原（抗原）刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)原理示意第33頁,共60頁，2024年2月25日，星期天1、T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)2、NK活性測定3、ADCC作用測定細(xì)胞毒檢測試驗(yàn)第34頁,共60頁，2024年2月25日，星期天放射性測定細(xì)胞毒試驗(yàn)原理示意靶細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞分離上清第35頁,共60頁，2024年2月25日，星期天1、直接溶血空斑試驗(yàn)2、間接溶血空斑試驗(yàn)3、SPA-SRBC溶血空斑試驗(yàn)抗體形成試驗(yàn)第36頁,共60頁，2024年2月25日，星期天直接溶血空斑試驗(yàn)第37頁,共60頁，2024年2月25日，星期天間接溶血空斑試驗(yàn)第38頁,共60頁，2024年2月25日，星期天SPA-SRBC溶血空斑試驗(yàn)第39頁,共60頁，2024年2月25日，星期天1、細(xì)胞吞噬功能試驗(yàn)2、細(xì)胞殺菌功能試驗(yàn)細(xì)胞吞噬與殺傷功能試驗(yàn)第40頁,共60頁，2024年2月25日，星期天第41頁,共60頁，2024年2月25日，星期天吞噬百分率=吞有顆粒的吞噬細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)的吞噬細(xì)胞數(shù)吞噬指數(shù)=吞噬細(xì)胞吞噬的總顆粒數(shù)計(jì)數(shù)的吞噬細(xì)胞數(shù)第42頁,共60頁，2024年2月25日，星期天NBT還原試驗(yàn)原理：N-N-C+H+N=N-R-N-NH2CN=NH四氮唑基（淡黃色）甲月簪基（紫黑色）第43頁,共60頁，2024年2月25日，星期天NBT還原試驗(yàn)方法：1、抗凝血+硝基藍(lán)四氮唑（NBT），37。C孵育25min。2、推片染色、鏡檢。正常值：NBT陽性細(xì)胞7.5-15%第44頁,共60頁，2024年2月25日，星期天

第四節(jié)免疫細(xì)胞凋亡測定一、細(xì)胞凋亡的概念與原理二、細(xì)胞凋亡的檢測方法第45頁,共60頁，2024年2月25日，星期天

細(xì)胞凋亡的概念與原理1、細(xì)胞凋亡的概念2、細(xì)胞凋亡的原理3、細(xì)胞凋亡的特點(diǎn)第46頁,共60頁，2024年2月25日，星期天

細(xì)胞凋亡（apoptosis）

細(xì)胞在內(nèi)源性基因調(diào)控下發(fā)生的主動(dòng)死亡過程，也稱程序性死亡。第47頁,共60頁，2024年2月25日，星期天

細(xì)胞凋亡的過程凋亡信號——凋亡受體——信號傳導(dǎo)——凋亡基因啟動(dòng)——編碼程序性死亡蛋白——細(xì)胞結(jié)構(gòu)解體——細(xì)胞凋亡第48頁,共60頁，2024年2月25日，星期天

細(xì)胞凋亡機(jī)制第49頁,共60頁，2024年2月25日，星期天

細(xì)胞凋亡的特點(diǎn)1、細(xì)胞皺縮2、染色質(zhì)邊集3、凋亡小體出現(xiàn)第50頁,共60頁，2024年2月25日，星期天

細(xì)胞凋亡第51頁,共60頁，2024年2月25日，星期天

細(xì)胞凋亡的檢測方法1、形態(tài)觀察法2、生化檢測法3、流式細(xì)胞儀檢測法第52頁,共60頁，2024年2月25日，星期天形態(tài)觀察法普通光鏡檢測——HE染色甲基綠-派諾寧染色熒光顯微鏡檢測——溴化丙錠染色透射電鏡檢測——典型形態(tài)改變第53頁,共60頁，2024年2月25日，星期天生化檢測法凝膠電泳法原位末端標(biāo)記法二苯胺分光光度法第54頁,共60頁，2024年2月25日，星期天凝膠電泳法原理：斷裂DNA在凝膠中呈梯形排列（DNAladder）方法：提取總DNADNA凝膠電泳觀察DNAladder現(xiàn)象第55頁,共60頁，2024年2月25日，星期天原位末端標(biāo)記法（TUNEL）原理：利用標(biāo)記的dUTP，在TdT作用下結(jié)合DNA斷片的3’末端羥基，顯示斷鏈DNA，提示凋亡方法：制備組織切片標(biāo)記物結(jié)合標(biāo)記物顯色鏡檢第56頁,共60頁，2024年2月25日，星期天二苯胺分光光度法原理：細(xì)胞凋亡可產(chǎn)生低分子量DNA，通過超速離心可與細(xì)胞核的高分子量DNA分離，分別測定兩種DNA，即可得出凋亡百分率。方法：裂解細(xì)胞

13000g超速離心分別提取DNA

使DNA顯色，測定第57頁,共60頁，2024年2月25日，星期天凋亡百分率=上清液OD值上清液OD值+沉淀OD值第58頁,共60頁，2024年2月25