霍亂實驗室檢測

霍亂的實驗室檢測

目的:提高檢出率,減少漏檢以及誤判的發(fā)生

手段:檢測人員是否有足夠的責任心?檢測試劑準備是否齊全且符合要求?是否嚴格按照檢測流程進行操作?

什么是霍亂?霍亂是由01群和0139群霍亂弧菌（V．c

ho

le

ra

e

）引起的急性腸道傳染病，發(fā)病急、傳播速度快、波及范圍廣、危害嚴重的甲類傳染病?；魜y概述古典生物型小川型Og

a

w

a

(AB)稻葉型Ina

b

a

(AC)彥島型Hikojim

(AB

C)O1群埃爾托生物型霍亂弧菌霍亂病原菌O139群（B

e

ng

a

l）非O1群O2-O200群腹瀉病原菌

病原體O

1群，O

139群霍亂弧菌

發(fā)病特征：劇烈腹瀉、嘔吐、嚴重脫水時致酸中毒、循環(huán)衰竭而致死亡不治療或醫(yī)療很差的條件下病死率可達到20－50

％（重癥病人達70－100

％）

培養(yǎng)特性：營養(yǎng)要求不高，兼性厭氧，37

℃生長，怕酸嗜堿，

p

H:7.4-9.6快速生長

檢驗依據(jù)：WS

289-2008《霍亂診斷標準》霍亂防治手冊（1999年第五版）霍亂的實驗室檢測

樣品的采集和運輸

不同樣品的病原分離流程及技術要點

糞便

水體

水產(chǎn)品，食品等

平板分離及可疑菌落挑取

菌落鑒定

常用快速檢測方法

膠體金檢測條

熒光PCR檢測

檢測工作中應關注的事項樣品的采集和運輸

采集：

病例：糞便、肛拭子、嘔吐物

未使用抗生素之前“健康”人：糞便、肛拭子其他傳播環(huán)節(jié)的標本：食物、水、環(huán)境類樣品??

監(jiān)測：水樣，水產(chǎn)品等運輸：一般要求在3小時內(nèi)室溫（20-25℃）條件下送達實驗室檢測

C-B運輸培養(yǎng)基（p

H8.4

）;（或文臘二氏保存液）

堿性蛋白胨水（p

H8.4-9.2

）：不是最佳的，尤其6小時內(nèi)還不能進行培養(yǎng)時，盡量采用C-B運輸培養(yǎng)基。

糞便的采集與保存運送以采集病人自然排除的新鮮糞便為主，水樣便采取1

～3

m

L，成形便采取指甲大小的糞量，亦可用直腸棉拭或采便管由肛門插入直腸內(nèi)3

～5

c

m處采取，采集后的樣品應盡快挑取接種于堿性蛋白胨水（ＰＨ8.６-9.2

），同時劃線分離選擇性培養(yǎng)基（慶大／四號／ＴＣＢＳ平板），如不能在６小時內(nèi)送達實驗室檢測的樣品，應插入Ca

ry-Bla

ir二氏半固體保存培養(yǎng)基（或文臘二氏保存液）中送檢。標本與保存液比例約為1∶5。

分離培養(yǎng)要點（兩管三板法）：

挑取糞便，直接接種于堿性蛋白胨水（第一管）中，同時劃線分離選擇性平板（慶大／四號／ＴＣＢＳ平板，第一板）。

第一管堿性蛋白胨水在３７℃增菌６－８小時，沾取菌膜下表層液體，劃線分離選擇性平板（慶大／四號／ＴＣＢＳ平板，第二板），同時吸取

0.1

～0.2

m

l表層培養(yǎng)物，接種堿性蛋白胨水（第二管）。

第二管堿性蛋白胨水增菌１８小時后劃線分離選擇性平板（慶大／四號／ＴＣＢＳ平板，第三板）。糞便分離流程及技術要點

水體的采集與保存運送水體的采集一般用無菌的500

m

l水樣瓶采集相對靜止的表層水(深度為30

c

m以內(nèi))500

m

l，密封加蓋后于室溫（20-25℃）3小時內(nèi)送達實驗室檢測。

分離培養(yǎng)要點（十倍濃縮堿胨水增菌培養(yǎng)法）：取450

m

l水樣，用1

M氫氧化鈉調(diào)整至p

H

8.4-9.2。然后加10倍濃縮堿性胨水50

m

l。再加入1%亞碲酸鉀0.25

～0.5

m

l和1000單位/m

l青霉素1m

l。37℃培養(yǎng)過夜，取菌膜下表層培養(yǎng)物接種選擇性培養(yǎng)基（慶大／四號／ＴＣＢＳ平板）分離培養(yǎng)，同時吸0.1

～0.2m

l表層培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于堿性胨水管中作二次增菌，37℃培養(yǎng)6

～8

h再劃線接種于選擇性培養(yǎng)基（慶大／四號／ＴＣＢＳ平板）。水體分離流程及技術要點

水產(chǎn)品的采集與保存運送

通常選取活的或者新鮮的水生動物為采集對象，有時也應考慮冰凍的水生動物，有條件的采樣點可將水生動物整體采回實驗室再進行相關處置

涂抹采集：使用無菌棉簽涂抹5只以上水水生動物表面、腮部及泄殖腔，直接接種到

20

m

l堿性蛋白胨水作為增菌液處理。

整體或局部采集：在實驗室應以無菌操作將其解剖，取鰓部和腸內(nèi)容物25克剪碎后，置滅菌均質(zhì)杯或均質(zhì)袋中，加入225

m

L倍體積的堿性蛋白胨水增菌；但小貝殼類動物，則用錘子將外殼擊碎，整體放入100

m

l三角瓶中，加入5-10倍的堿性蛋白胨水增菌；甲殼類動物除含肉質(zhì)部分外，其余部分(包括鰓、腸、足、表層外殼等)整體放入100

m

l三角瓶中，加入5-10倍的堿性蛋白胨水增菌。

分離培養(yǎng)（兩管兩板法）：接種后的堿性蛋白胨水37℃培養(yǎng)過夜，取菌膜下表層培養(yǎng)物接種選擇性培養(yǎng)基（慶大／四號／ＴＣＢＳ平板）．同時吸0.1

～0.2

m

l表層培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于10

m

l堿性胨水管中作二次增菌，37℃培養(yǎng)6

～8

h再劃線接種于選擇性培養(yǎng)基（慶大／四號／ＴＣＢＳ平板）。水產(chǎn)品分離流程及技術要點

平板分離

選擇性分離平板應采用9

c

m

分離平板（不建議采用7

c

m

平板），一個平

板分離一個樣品（嚴禁一個平板分離2

份或以上樣品??！

）。

樣品平板分離時應進行分區(qū)劃線分離，平板分離的單個菌落數(shù)量應該達到

50

個以上。

可疑菌落挑取

經(jīng)典的鑒定步驟要求每個平板應挑取5

個以上可疑菌落,轉(zhuǎn)種于克氏雙糖斜

面或者普通瓊脂斜面待分純培養(yǎng)后,再進行O

1

、O

139

群血清玻片凝集試驗，鑒于對霍亂疫情應急處理的考慮,現(xiàn)大多數(shù)監(jiān)測實驗室一般采用將血清玻片凝集試驗前置的做法,作為快速篩查的手段,直接對平板上生長的單個可

疑菌落進行玻片凝集試驗,出現(xiàn)明顯凝集時可做初步報告,對平板上出現(xiàn)可疑凝集的菌株必須馬上轉(zhuǎn)種于克氏雙糖斜面或者普通瓊脂斜面,待純培養(yǎng)物生長良好后再次進行玻片凝集試驗加以確證。

慶大霉素平板和4

號瓊脂：多呈半透明狀，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并

隨培養(yǎng)時間的延長而加深（由于這類培養(yǎng)基均含有亞碲酸鹽成份）。

TCBS（硫代硫酸鹽枸櫞酸鹽膽鹽瓊脂）：菌落生長呈黃色發(fā)亮、表面光滑、潤濕、稍凸起、邊緣整齊。

（TC

BS平板生長的菌落不能直挑取進行玻片凝集試驗，需按經(jīng)典方法進行純培養(yǎng)后再進行玻片凝集試驗）平板分離及可疑菌落挑取

染色鏡檢革蘭染色陰性的短桿菌

血清凝集試驗：

分別使用O

1

群，O

139

群霍亂血清進行凝集試驗，同時使用生理鹽水進行

對照凝集，以排除與生理鹽水發(fā)生凝集的自凝菌。

生理鹽水不凝集，O

1

群血清明顯凝集的菌落，進一步使用稻葉型和小川型血清進行凝集試驗，判定型別：稻葉型血清凝集而小川型血清不凝集的菌落

為稻葉型，小川型血清凝集而稻葉型血清不凝集的菌落為小川型，如稻葉型血清和小川型血清均出現(xiàn)凝集的時候，要注意鑒別是否為彥島型，需進行試管凝集試驗且兩者的凝集效價均超過一半以上才能判定為彥島型，因為某些小川型菌落自身會帶有少量的C抗原而出現(xiàn)與稻葉型血清發(fā)生弱凝集，因此如小川型血清凝集較稻葉型血清凝集有明顯優(yōu)勢時應維持小川型的判定。

生理鹽水不凝集，O

139

群血清明顯凝集的菌落，一般為O

139

群，但其與O

22

群及O

155

群甚至一些非霍亂弧菌會出現(xiàn)交叉凝集，由上級實驗室進行進一步確認。菌落鑒定O1群和O139群抗原構(gòu)造與血清分型AO139BC小川+++少量稻葉+—+彥島O139+—++—+—型特異性抗原群特異性抗原型別

國內(nèi)商品化的霍亂檢測血清

國外血清：日本生研，泰國S

&A血清等進一步實驗氧化酶試驗1％鹽酸對氨基二甲基苯胺或鹽酸二甲基對苯二胺水溶液粘絲試驗0.5％去氧膽酸鈉水溶液

生化鑒定

生化鑒定管：發(fā)酵葡萄糖、甘露醇、蔗糖、產(chǎn)酸不產(chǎn)氣能分解色氨酸賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶（+）精氨酸雙水解酶（-）霍亂弧菌生化鑒定管（11

種生化,套裝，環(huán)凱）；

生化鑒定條：梅里埃API

20

E鑒定條等

全自動生化檢測儀檢測：梅里埃VITEK2

COMP

全自動生化鑒定卡等

進一步分型鑒定(省CDC進行)

噬菌體分型

PFG

E脈沖場分型進一步實驗

針對原始樣品（如病人糞便）以及初始增菌后的菌液進行快速檢測

膠體金快速檢測卡

O

1群霍亂膠體金標記快診卡

O

139群霍亂膠體金標記快診卡

熒光PCR快速檢測試劑盒

O

1群、O

139群雙色熒光檢測試劑盒

霍亂C

TX毒力基因熒光檢測試劑盒注：快速檢測并不能替代常規(guī)檢測的進行，只是作為輔助檢測的一種手段霍亂快速檢測技術的應用霍亂弧菌膠體金免疫層析檢測熒光PCR檢測霍亂弧菌病例標本檢測環(huán)境和食品調(diào)查的初篩方法O

1群、O

139群雙色熒光檢測試劑盒深圳生科源生物技術有限公司O1群和O139群霍亂弧菌的檢驗程序鑒定分型確診報告膠體金、熒光PCR快速診斷增菌培養(yǎng)（堿胨水）分離培養(yǎng)慶大霉素、4號、TCBS瓊脂標本（糞便等）玻片凝集陽性（結(jié)合菌落、菌體形態(tài)）凝集菌落或可疑菌落第二次增菌（堿胨水）初步報告10-20小時6-8小時純培養(yǎng)（營養(yǎng)瓊脂或克氏雙糖培養(yǎng)）10-20小時直接