《DB32T 3762.17-2021新型冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)范 第17部分核酸檢測(cè)用假病毒陽(yáng)性質(zhì)控品》

ICS13.100

C50

DB32

江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB32/T3762.17—2021

新型冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)范

第17部分：核酸檢測(cè)用假病毒陽(yáng)性質(zhì)控品

TechnicalspecificationsforSARS-CoV-2detection

Part17:Pseudoviruspositivecontrolmaterialfornucleicaciddetection

2021-12-09發(fā)布2022-01-09實(shí)施

江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

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新型冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)范第17部分：核酸檢測(cè)用假病毒陽(yáng)性質(zhì)控品

1范圍

本文件規(guī)定了新型冠狀病毒核酸檢測(cè)用假病毒類(lèi)弱陽(yáng)性質(zhì)控品的術(shù)語(yǔ)和定義、縮略語(yǔ)、試劑和材料、

儀器和設(shè)備、假病毒原液的技術(shù)要求、質(zhì)控品的制備和質(zhì)控品的技術(shù)要求。

本文件適用于新型冠狀病毒核酸檢測(cè)用假病毒類(lèi)弱陽(yáng)性質(zhì)控品的技術(shù)要求以及評(píng)價(jià)方法。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

JJF1006一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范

JJF1343標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

質(zhì)控品controlmaterial

用于體外診斷的質(zhì)量控制物質(zhì)，是一種旨在用于醫(yī)學(xué)用途的檢測(cè)系統(tǒng)中使用的物質(zhì)、材料、物品或

設(shè)備，其目的是評(píng)價(jià)或驗(yàn)證測(cè)量精密度、測(cè)量準(zhǔn)確度、由于試劑或分析儀器的變化檢測(cè)系統(tǒng)可能產(chǎn)生的

分析偏差等性能特征，可用于能力驗(yàn)證、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)量控制。

3.2

假病毒pseudovirus

一種具有病毒擬似的物理結(jié)構(gòu)和特異性核酸序列的病毒樣粒子，其分析特性與真實(shí)病毒相似，但不

具備自我復(fù)制和感染的能力。

3.3

假病毒質(zhì)控品pseudoviruscontrolmaterial

由假病毒原料定量分裝后制成，能夠參與到病毒檢測(cè)從提取到擴(kuò)增的全過(guò)程；具有生物安全性的同

時(shí)可作為測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)，用于病毒核酸定性和定量測(cè)量方法的驗(yàn)證評(píng)價(jià)以及實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制。

3.4

計(jì)量溯源性metrologicaltraceability

1

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通過(guò)一條具有規(guī)定不確定度的不間斷的比較鏈，使測(cè)量結(jié)果或測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)的值能夠與規(guī)定的參考標(biāo)準(zhǔn)

（通常是與國(guó)家測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)或國(guó)際測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)）聯(lián)系起來(lái)的特性。

3.5

同源性homology

兩個(gè)核酸分子的核苷酸序列間的相似程度。本文指假病毒質(zhì)控品中目的基因序列與相應(yīng)的真實(shí)病毒

參考毒株序列的一致性。

3.6

均勻性u(píng)niformity

同一批次生產(chǎn)的假病毒質(zhì)控品，每個(gè)最小包裝單元含有等量的目標(biāo)假病毒的狀態(tài)。通過(guò)測(cè)量取自不

同包裝單元或取自同一包裝單元的、特定量的樣品，定量測(cè)量結(jié)果落在規(guī)定不確定度范圍內(nèi)，則可認(rèn)為

質(zhì)控品所含目標(biāo)假病毒的量是均勻的。

3.7

穩(wěn)定性stability

假病毒質(zhì)控品在特定的保存條件和保存時(shí)間內(nèi)，假病毒的量保持在規(guī)定范圍內(nèi)的能力。

4縮略語(yǔ)

下列縮略語(yǔ)適用于本文件。

DMEM：Dulbecco改良培養(yǎng)基（Dulbecco’smodifiedeagle’smedium）

PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）

qPCR：熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitativepolymerasechainreaction）

RT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reversetranscriptionpolymerasechainreaction）

RT-qPCR：逆轉(zhuǎn)錄熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reversetranscriptionquantitativepolymerasechain

reaction）

RNase：核糖核酸酶（ribonuclease）

5技術(shù)要求

5.1假病毒質(zhì)控品的技術(shù)要求主要分為兩個(gè)方面，包含對(duì)假病毒原液的技術(shù)要求，如假病毒內(nèi)靶標(biāo)

RNA序列的同源性、假病毒原液的雜質(zhì)殘留等；還包含對(duì)質(zhì)控品成品的技術(shù)要求，如靶標(biāo)RNA定值、

均勻性、穩(wěn)定性等。

5.2假病毒質(zhì)控品必須同時(shí)滿(mǎn)足以下8點(diǎn)技術(shù)要求，才能作為新型冠狀病毒核酸檢測(cè)用的弱陽(yáng)性質(zhì)控

品：

a)用于制備質(zhì)控品的原料假病毒含有與新冠核酸檢測(cè)的靶標(biāo)RNA序列一致的RNA；

b)用于制備質(zhì)控品的假病毒原液不含有cDNA雜質(zhì)；

c)用于制備質(zhì)控品的假病毒原液無(wú)菌；

d)質(zhì)控品的靶標(biāo)RNA濃度為試劑盒檢出限的1.5-3倍左右，且定值結(jié)果具有計(jì)量溯源性；

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e)質(zhì)控品同批次均勻性合格；

f)質(zhì)控品短期、長(zhǎng)期及極端環(huán)境下穩(wěn)定性合格；

g)質(zhì)控品適用于至少8款獲批上市的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒。

6試劑和材料

6.1無(wú)酶水：GB/T6682中的一級(jí)水，應(yīng)為無(wú)RNA酶的水。

6.2PCR、RT-PCR、RT-qPCR、數(shù)字PCR相關(guān)試劑：商品化試劑。

6.3PCR引物、探針：參照權(quán)威機(jī)構(gòu)公布的序列或自行設(shè)計(jì)。

6.4RNase：商品化試劑。

6.5無(wú)RNA酶的各型號(hào)槍頭、EP管、PCR管、離心管、試管：商品化耗材。

6.6本文件中所有的化學(xué)試劑，除特別說(shuō)明外，全部為分析純級(jí)別試劑。

7儀器和設(shè)備

7.1生物安全柜。

7.2普通離心機(jī)、冷凍離心機(jī)。

7.3恒溫水浴鍋。

7.4PCR儀。

7.5核酸電泳儀。

7.6凝膠成像系統(tǒng)。

7.7熒光定量PCR儀。

7.8數(shù)字PCR系統(tǒng)。

7.9各型號(hào)移液器。

7.10培養(yǎng)箱。

8假病毒原液的技術(shù)要求

8.1靶標(biāo)RNA序列同源性的檢測(cè)

8.1.1檢測(cè)方法

8.1.1.1RT-PCR檢測(cè)

提取假病毒的RNA作為模板。選用中國(guó)疾病預(yù)防控制中心或世界衛(wèi)生組織推薦的（見(jiàn)表1）或根

據(jù)靶標(biāo)RNA自行設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。設(shè)置以水為模板的陰性對(duì)照，以含靶標(biāo)RNA的標(biāo)

準(zhǔn)物質(zhì)為模板的陽(yáng)性對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離、回收反應(yīng)產(chǎn)物。

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表1中國(guó)疾病預(yù)防控制中心、世界衛(wèi)生組織推薦的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)引物和探針序列

目標(biāo)基因引物/探針序列（5’—3’）

FCCCTGTGGGTTTTACACTTAA

ORF1abRACGATTGTGCATCAGCTGA

P5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'

FGGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT

NRCAGACATTTTGCTCTCAAGCTG

P5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'

FACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT

ERATATTGCAGCAGTACGCACACA

P5'-FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BBQ-3'

8.1.1.2測(cè)序及溯源性分析

將8.1.1.1的產(chǎn)物測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與相應(yīng)的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)靶標(biāo)RNA的參考序列進(jìn)行比

對(duì)。

8.1.2結(jié)果判定

在RT-PCR陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照都成立的情況下：

a)若滿(mǎn)足假病毒RNA的RT-PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果為陽(yáng)性且測(cè)序結(jié)果比對(duì)一致，則為合格；

b)若假病毒RNART-PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果為陰性，則表明假病毒未包裹病毒RNA，或假病毒

核酸提取失敗，應(yīng)重新制備假病毒或提取核酸。

8.2cDNA雜質(zhì)的檢測(cè)

8.2.1檢測(cè)方法

分別以未做核酸提取的假病毒原液和假病毒中提取的RNA為模板，使用推薦的或自行設(shè)計(jì)的引

物和探針或商品化試劑盒進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。設(shè)置以水為模板的陰性對(duì)照，以重組質(zhì)粒為模板的陽(yáng)性對(duì)

照。

8.2.2結(jié)果判定

在陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照都成立的情況下：

a)若未提取的假病毒原液和/或假病毒提取的RNA的qPCR結(jié)果為陽(yáng)性，即出現(xiàn)典型的S型

擴(kuò)增曲線或依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)判定，則表明原液中或假病毒內(nèi)含有cDNA雜質(zhì)，即為不合格，

應(yīng)重新消化去除cDNA雜質(zhì)。

b)若未提取的假病毒原液和假病毒提取的RNA的qPCR結(jié)果為陰性，即未起峰或依據(jù)試劑盒

說(shuō)明書(shū)判定，說(shuō)明無(wú)cDNA，即為合格。

8.3無(wú)菌檢測(cè)

用DMEM培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)假病毒原液24h，溶液澄清，無(wú)菌生長(zhǎng)，即為合格。

9質(zhì)控品的制備

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對(duì)結(jié)果判定為合格的假病毒原液，根據(jù)需要使用適當(dāng)?shù)娜軇?duì)假病毒原料進(jìn)行稀釋后，分裝至凍存

管，直接或凍干后-20℃保存。具體制備過(guò)程本文件不作贅述。

10質(zhì)控品的技術(shù)要求

10.1新型冠狀病毒靶標(biāo)RNA的定量

10.1.1基本要求

采用核酸提取方法提取假病毒質(zhì)控品的RNA，采用RT-qPCR法或數(shù)字PCR法對(duì)靶標(biāo)RNA

的濃度進(jìn)行定值。使用推薦的或自行設(shè)計(jì)的引物和探針或商品化試劑盒進(jìn)行定值。核酸提取方法和靶標(biāo)

RNA濃度的定值方法均應(yīng)通過(guò)適宜的國(guó)家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的驗(yàn)證方可采用。

10.1.2RT-qPCR定量法

10.1.2.1使用RT-qPCR法進(jìn)行定量時(shí)，所使用的具體方法應(yīng)為針對(duì)新型冠狀病毒靶標(biāo)RNA片段

設(shè)計(jì)建立的方法。

10.1.2.2標(biāo)準(zhǔn)品可以為拷貝數(shù)已知的新型冠狀病毒RNA或cDNA，或含有相關(guān)目的DNA片段的

重組質(zhì)粒。

10.1.2.3將標(biāo)準(zhǔn)品以10倍進(jìn)行梯度稀釋至少5個(gè)梯度，分別以每個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為模板，

進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，根據(jù)各梯度標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值和濃度制定標(biāo)準(zhǔn)曲線和公式。

10.1.2.4根據(jù)質(zhì)控品RNA的Ct值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線和公式計(jì)算出質(zhì)控品中新型冠狀病毒靶標(biāo)RNA

的濃度。

10.1.3數(shù)字PCR定量法

10.1.3.1使用數(shù)字PCR法進(jìn)行定量時(shí)，所使用的具體方法應(yīng)為針對(duì)新型冠狀病毒靶標(biāo)RNA片段設(shè)

計(jì)建立的方法。

10.1.3.2提取假病毒RNA，上樣至數(shù)字PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行數(shù)字PCR反應(yīng)。按照式（1）計(jì)算質(zhì)

控品RNA的濃度。

CA

C1（1）

B

C—質(zhì)控品中靶標(biāo)RNA的原始濃度，單位為拷貝每微升；

C1—數(shù)字PCR檢測(cè)結(jié)果所示的靶標(biāo)RNA的濃度，單位為拷貝每微升；

A—數(shù)字PCR反應(yīng)體系中靶標(biāo)RNA的稀釋倍數(shù)；

B—核酸提取時(shí)靶標(biāo)RNA的濃縮倍數(shù)。

10.1.4靶標(biāo)RNA濃度的計(jì)算

定值結(jié)果采取10.1.2或10.1.3所述的方法進(jìn)行靶標(biāo)RNA的濃度計(jì)算，質(zhì)控品濃度為新冠核酸

檢測(cè)試劑盒檢出限的1.5-3倍左右即為合格。

10.2均勻性檢測(cè)

10.2.1檢測(cè)方法

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按照J(rèn)JF1006和JJF1343的要求，依據(jù)每一批次質(zhì)控品的制備數(shù)量，隨機(jī)抽樣選擇不同數(shù)量的包

裝單元進(jìn)行均勻性檢測(cè)。對(duì)質(zhì)控品進(jìn)行核酸提取后，按10.1.2或10.1.3的方法進(jìn)行靶標(biāo)RNA濃度

測(cè)定，計(jì)算每一個(gè)包裝單元靶標(biāo)RNA的濃度。

10.2.2均勻性判定

對(duì)所得數(shù)據(jù)按照J(rèn)JF1006和JJF1343的統(tǒng)計(jì)學(xué)要求進(jìn)行檢驗(yàn)，若結(jié)果無(wú)顯著性差異，則質(zhì)控品

均勻性良好，即為合格。若存在顯著性差異，即為均勻性不合格。

10.3穩(wěn)定性檢測(cè)

10.3.1短期穩(wěn)定性

短期穩(wěn)定性評(píng)價(jià)質(zhì)控品在使用溫度（20±5）℃和運(yùn)輸溫度4℃下的穩(wěn)定性。按JJF1006和JJF1343

的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。按10.1.2或10.1.3的方法進(jìn)行靶標(biāo)RNA濃度測(cè)定。

10.3.2長(zhǎng)期穩(wěn)定性

長(zhǎng)期穩(wěn)定性評(píng)價(jià)質(zhì)控品在存儲(chǔ)溫度