形態(tài)學(xué)實驗 石蠟切片法-染色、封藏

四、石蠟切片法

染色、封藏1石蠟切片的主要步驟：一、取材二、固定三、洗滌四、脫水五、透明六、透蠟與包埋七、切片八、貼片九、染色十、封藏2一、實驗原理：1、染色：細胞和組織的不同結(jié)構(gòu)之所以能被染成各種不同的顏色，是由于染料對它們所起的物理與化學(xué)綜合作用的結(jié)果。3（1）物理作用：滲透作用：染料滲透到多孔的組織中，與組織沒有牢固的結(jié)合。吸收作用：組織吸收染料中的色素粒子，與之牢固結(jié)合而呈顏色。吸附作用：染料中分散的色素粒子進入到組織細胞的間隙內(nèi)，由于分子的引力作用，使色素粒子被吸附而染色。如蛋白質(zhì)、核酸、膠體等有不同的吸附面，對染料離子的吸附有選擇性而呈不同顏色。4（2）化學(xué)作用：是因為細胞內(nèi)含有酸性和堿性物質(zhì)可分別與染料中的陽離子和陰離子互相結(jié)合，這種反應(yīng)使組織細胞染上顏色。5（3）以常用的蘇木精-伊紅（H.E）對染法為例：細胞核內(nèi)含有酸性物質(zhì)，易與堿性染料蘇木精中有染色作用的陽離子結(jié)合，細胞核被染上藍色。細胞質(zhì)含有堿性物質(zhì)，易與酸性染料伊紅中有染色作用的陰離子結(jié)合，細胞質(zhì)被伊紅染上粉紅色。但是嗜堿性和嗜酸性是相對的，因此在染料液中停留時間不宜過長。6常用的染料：生物學(xué)上的染料按來源分為天然染料和人工染料。1、天然染料：蘇木精、洋紅、地衣紅、靛青等。2、人工染料：堿性染料：番紅、美藍、結(jié)晶紫、堿性品紅。酸性染料：伊紅、固綠、蘇丹紅、酸性品紅。72、封藏：封藏是使已經(jīng)透明的材料保存在適合折光率的封藏劑中，使材料能在顯微鏡下清晰的顯示出來，并能長期保存。常用的封藏劑為樹膠，折光率為1.52，與玻璃的折光率1.51很接近。8二、實驗程序1、染色的一般方法由于要染的切片包在石蠟之中，而所用的染色劑又常常為水溶液，因此在染色之前，必須再度復(fù)水，石蠟切片在二甲苯中溶去石蠟，經(jīng)過各級酒精處理，下降至水。經(jīng)染色后需再脫水，上升到二甲苯透明，然后封藏。9H.E染法:從左到右，(1)-(19)缸1.二甲苯(1)脫蠟10min。2.二甲苯(2)脫蠟10min。3.100%乙醇（3）、100%乙醇（4），95%（5）、80%（6）、70%（7）酒精各2min。4.蒸餾水（8）

1min。5.Mayer’s蘇木精染色液30min。6.自來水蘭化107.1%伊紅（12）水溶液5min。8.蒸餾水（12.5）過一下。9.70%（13）、80%乙醇（14）、95%（15）、無水乙醇（16）、無水乙醇（17），每次各2min。14.二甲苯(18)

5min。15.二甲苯(19)

5min。16.封藏：封藏于中性樹膠中。(粘取)17.顯微鏡觀察結(jié)果：細胞核藍色，細胞質(zhì)粉紅色112、封藏的方法從二甲苯缸中取出含組織的載玻片放在玻片板上，（有組織切片一面朝上），迅速粘取樹膠于組織中央（千萬不能待二甲苯干燥后再進行），手輕輕地夾住蓋玻片的一側(cè)，稍微傾斜使其對側(cè)與封藏劑接觸成線狀后，再緩慢放下蓋玻片，避免中間產(chǎn)生氣泡。12

根據(jù)材料的大小，選用不同規(guī)格的蓋玻片。若膠液不足，可從蓋玻片邊緣補足；若膠液過多，則等干燥后用刀片刮去，并用紗布蘸二甲苯擦去殘留的樹膠。13HE染色應(yīng)注意以下幾個問題：1．組織切片的脫蠟步驟應(yīng)徹底，否則無論進行那種染色都會發(fā)生困難。脫蠟時間要充分，若溶蠟劑使用過久應(yīng)及時更換以免效率降低，若室溫過低，可將溶蠟劑置于溫箱中進行脫蠟。2．蘇木精染液使用一段時間后表面易出現(xiàn)亮晶狀飄浮物，這可能是液體表面的過氧化物，必須過濾除去，以防沉渣污染組織切片，或應(yīng)及時更換新液。

143．染色的時間長短需依據(jù)染色劑對組織的染色作用，室溫條件，切片厚薄，固定液的類別，染液的新舊而進行調(diào)節(jié)。所以在染色時必須使用顯微鏡觀察染色程度以利掌握時間。4．分化十分重要。分化步驟的準確也是染色成敗的關(guān)鍵，若分化失當則必然引起染色不勻或過淡、過深等現(xiàn)象，因此分化后一定要鏡檢，觀察胞核是否清晰，胞漿呈淡白色。否則需再次分化，不然一旦復(fù)染后，組織會呈紫藍色即“藍蓋紅”現(xiàn)象。155．還原液不宜過濃，若堿性太強易使組織脫落故以淡為宜。6．伊紅宜淡染，復(fù)染過深胞核會不清晰，影響鏡檢。7．若脫水、透明等步驟不夠徹底，則組織表面會有一層霧狀膜。若有這一現(xiàn)象，應(yīng)立即更換純酒精脫水，再次透明。168．染色后的組織切片、要將組織四周的污染物痕跡擦掉，以免影響美觀。9．封片劑要適量，滴加時應(yīng)小心傾滴，蓋玻片要輕輕放置，以免氣泡產(chǎn)生影響鏡檢。蓋玻片大小選擇要合適，一般要大于組織塊，以防封蓋不全，蓋玻片要放正，標簽貼牢，編號清楚。從而保證切片的封藏和美觀。10．染好的切片應(yīng)妥為保存，更應(yīng)避免日光照射，否則切片容易褪色。17三、實驗用品1、器材：玻璃缸、染色缸、鑷子、蓋玻片、顯微鏡等。2、試劑：不同濃度梯度的酒精、二甲苯，粘片劑，蘇木精、伊紅染色液。3、材料：已切好的石蠟切片。18四、作業(yè)1、在顯微鏡下觀察切片的制作效果和細胞形態(tài)，由老師打分，上交HE染色玻片2片。2、考察顯微鏡的基本操作方法和注意事項。19小鼠肝臟（10×4）20小鼠肝臟（10×10）肝小葉↗血管↖21小鼠肝臟（10×40）22小鼠脾臟（10×4）23小鼠脾臟（10×10）紅