防疫物資采購新冠病毒檢測試劑盒性能方案

第一節(jié)新型冠狀病毒(2019-nCoV)抗體檢測試劑盒 1一、原理 1二、抗體檢測優(yōu)勢 2三、分類 2四、檢測原理（以IgM抗體為例） 2五、各種檢測方法的特點 4六、適用范圍 4七、操作步驟（以國械注準(zhǔn)20203400240為例） 4八、標(biāo)本運輸 5九、臨床意義 6第二節(jié)新冠病毒核酸檢測試劑 6一、新冠病毒核酸檢測方法 6二、新冠病毒核酸檢測實驗室生物安全要求 7三、新冠病毒核酸檢測結(jié)果 8四、新冠病毒核酸檢測流程 9第一節(jié)新型冠狀病毒(2019-nCoV)抗體檢測試劑盒一、原理新型冠狀病毒(2019-nCoV)抗體檢測試劑盒用于快速定性檢測人類全血、血清、血漿中的新型冠狀病毒IgM/IgG抗體，最快可在15分鐘內(nèi)肉眼觀察獲得檢測結(jié)果。二、抗體檢測優(yōu)勢1.與核酸聯(lián)合檢測提高檢出率。2.采樣的問題可能使核酸檢測出現(xiàn)假陰性的情況，抗體檢測采樣較均一。3.抗體檢測有效幫助提高疑似病例的確診率。4.實驗室要求低，利于各級醫(yī)院廣泛展開。5.流行病學(xué)研究提供支持數(shù)據(jù)。三、分類按檢測原理不同分為以下四類：1.新型冠狀病毒IgM/IgG抗體檢測試劑盒（膠體金法）2.新型冠狀病毒IgM/IgG抗體檢測試劑盒（熒光免疫層析法）3.新型冠狀病毒IgM/IgG抗體檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）4.新型冠狀病毒IgM/IgG抗體檢測試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）四、檢測原理（以IgM抗體為例）1.膠體金法（以間接法為例）新型冠狀病毒(2019-nCoV)IgM抗體檢測試劑盒（膠體金法）的檢測原理是膠體金標(biāo)記鼠抗人IgM，同時硝酸纖維素膜上包被新型冠狀病毒抗原，利用膠體金免疫層析間接法的原理達到檢測人血清中新型冠狀病毒IgM抗體的目的。2.熒光免疫層析法新型冠狀病毒IgM抗體檢測試劑盒（熒光免疫層析法）的原理是基于干式熒光標(biāo)記技術(shù)和免疫層析技術(shù)，采用全血、血清或血漿作為樣本，配套全自動熒光免疫定量分析儀，全自動穿刺進樣，實現(xiàn)“樣本進、結(jié)果出”，最大程度避免產(chǎn)生氣溶膠，降低對操作者和環(huán)境污染風(fēng)險。3.酶聯(lián)免疫法（以捕獲法為例）新型冠狀病毒IgM抗體檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）的原理是應(yīng)用捕獲酶聯(lián)免疫吸附分析法，采用抗人IgM單克隆抗體包被反應(yīng)板，加入校準(zhǔn)品或稀釋后的樣品，樣品中的病毒IgM抗體與已包被的單克隆抗體結(jié)合形成抗人IgM抗體-IgM抗體復(fù)合物，洗滌后加入HRP標(biāo)記的2019-nCoVN蛋白抗原（E蛋白抗原或S蛋白抗原），形成抗人IgM抗體-IgM抗體-2019-nCoVN蛋白抗原-HRP復(fù)合物。洗板后加入TMB底物，復(fù)合物上連接的HRP催化底物生成藍色物質(zhì)，加入終止液后變成黃色，在450nm波長處有特異吸收峰。通過峰值高低對人血清中的2019-nCoVIgM抗體進行定性檢測。4.化學(xué)發(fā)光法（以間接法為例）新型冠狀病毒抗體檢測試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）的原理是高科技材料磁珠標(biāo)記病毒的重組蛋白，用于結(jié)合血液樣本中的病毒抗體IgM，再使用二抗來識別抗體。二抗上面偶聯(lián)了堿性磷酸酶，加入底物后會產(chǎn)生光信號，化學(xué)發(fā)光儀器通過高靈敏度的PMT（光電倍增管）來檢測光子，從而實現(xiàn)pg(皮克)級別的高靈敏度檢測。五、各種檢測方法的特點膠體金法操作便捷，可直接目視判讀，一般15分鐘左右即可完成檢測；免疫熒光層析法與膠體金法一樣操作便捷，檢測迅速，但需要儀器判讀；酶聯(lián)免疫法可采用常規(guī)酶標(biāo)儀判讀，一般靈敏度較高，但檢測時間較長（約1.5小時左右），而且操作步驟較多，操作過程中應(yīng)采取措施避免感染。化學(xué)發(fā)光法一般靈敏度亦較高，采用全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，無需過多手工操作即可完成檢測，檢測時長一般約半小時。六、適用范圍用于體外定性檢測人血清、血漿和靜脈全血樣本中新型冠狀病毒（2019-nCoV）IgM/IgG抗體。僅用作對新型冠狀病毒核酸檢測陰性疑似病例的補充檢測指標(biāo)或疑似病例診斷中與核酸檢測協(xié)同使用，不能作為新型冠狀病毒感染的肺炎確診和排除的依據(jù)，不適用于一般人群的篩查。僅限醫(yī)療機構(gòu)使用。七、操作步驟（以國械注準(zhǔn)20203400240為例）1.取出試劑盒，室溫平衡20~30分鐘。2.滴加血清或血漿樣本10μL，滴加全血樣本20μL于反應(yīng)孔中，待液體充分吸入。3.滴加樣本稀釋液2滴于反應(yīng)孔中，待液體充分吸入。4.1-15分鐘可判讀結(jié)果。陽性結(jié)果：檢測開始后1-15min，檢測卡C線和T線位置均出現(xiàn)條帶。陰性結(jié)果：15min內(nèi)僅有檢測卡C線位置出現(xiàn)條帶，T線位置不出現(xiàn)條帶。無效結(jié)果：15min內(nèi)檢測卡C線和T線位置均不出現(xiàn)條帶或僅T線位置出現(xiàn)條帶，C線位置不出現(xiàn)條帶。八、標(biāo)本運輸1.院內(nèi)運輸包裝：標(biāo)本采集后用1000mg/L含氯消毒液對標(biāo)本容器外表面進行擦拭或噴灑消毒，然后放入帶有生物安全警示標(biāo)識的專用標(biāo)本自封袋中包裝，并對自封袋外表面用1000mg/L含氯消毒液進行消毒，然后置于專用密閉轉(zhuǎn)運箱，并對轉(zhuǎn)運箱外表面用1000mg/L含氯消毒液消毒。運送：由經(jīng)過生物安全培訓(xùn)的專人運送至實驗室，運送人員應(yīng)佩戴帽子、一次性外科口罩、手套、隔離衣，轉(zhuǎn)運期間保持轉(zhuǎn)運箱平穩(wěn)，避免劇烈震蕩、顛簸。2.院外運輸應(yīng)按照《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規(guī)定》（衛(wèi)生部令第45號）要求執(zhí)行。依據(jù)國家《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術(shù)指南》標(biāo)準(zhǔn)，新型冠狀病毒毒株及其他潛在感染性材料的運輸包裝分類屬于A類，對應(yīng)的聯(lián)合國編號為UN2814，包裝材料應(yīng)符合PI602分類包裝要求。九、臨床意義1.IgM、IgG類抗體是人體感染新冠病毒后產(chǎn)生的免疫防御蛋白，IgM抗體產(chǎn)生早，一經(jīng)感染，快速產(chǎn)生，維持時間短，消失快，血液中檢測陽性可作為早期感染的指標(biāo)，可用于感染的早期輔助診斷。2.IgG抗體產(chǎn)生晚，維持時間長，消失慢，血液中檢測陽性可作為感染和既往感染的指標(biāo)。3.血清新型冠狀病毒特異性IgM抗體和IgG抗體陽性；血清新型冠狀病毒特異性IgG抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽性或恢復(fù)期較急性期4倍及以上升高”為確診病例的血清學(xué)依據(jù)。第二節(jié)新冠病毒核酸檢測試劑一、新冠病毒核酸檢測方法采用RT-PCR檢測技術(shù)。根據(jù)國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術(shù)指南，在實驗室要確認一個病例為陽性，需滿足同一份標(biāo)準(zhǔn)中新冠病毒的ORF1ab及N基因2個靶標(biāo)特異性RT-PCR檢測結(jié)果均為陽性，或單靶標(biāo)陽性患者重新采樣/另一類型樣品檢測仍為單靶標(biāo)陽性，故實驗室針對新冠病毒的核酸檢測應(yīng)至少包含最為保守及特異的ORF1ab區(qū)域以及N基因。二、新冠病毒核酸檢測實驗室生物安全要求1.實驗室及檢驗人員生物安全自新冠肺炎疫情爆發(fā)以來，各醫(yī)院檢驗科面對新冠病毒檢測量增加、確診/疑似病例和普通患者的標(biāo)本不易區(qū)分、實驗室空間限制、生物安全防護物資不足等各類問題，臨床實驗室特別是進行新冠病毒核算檢驗的科室的生物安全防護措施尤為關(guān)鍵。目前國家衛(wèi)生健康委員會對新冠病毒暫按照病原微生物危害程度分類中第二類病原微生物進行管理，根據(jù)最新版的新冠病毒實驗室檢測指南及實驗室生物安全指南，如無法對原始樣本進行可靠的滅活，則對其進行的核酸檢測應(yīng)當(dāng)在生物安全二級實驗室進行，同時采用生物安全三級實驗室的個人防護(建議至少穿戴工作服、一次新工作帽、雙層手套、醫(yī)用一次性防護服、醫(yī)用防護口罩或動力送風(fēng)過濾式呼吸器、防護面屏或護目鏡、工作鞋或膠鞋、防水靴套)，各實驗室還可根據(jù)自身情況增加進一步的防護；同時標(biāo)準(zhǔn)預(yù)防、不定期通風(fēng)和手衛(wèi)生等重要的防護措施必不可少。2.原始樣本的滅活及對核酸檢測的影響新冠病毒實驗室檢測指南中未對原始樣本的有效滅活條件進行規(guī)定或建議，在目前最新的新冠病毒核酸檢測專家共識中，建議采用56℃水浴45min，并可根據(jù)提取試劑在標(biāo)本裂解時所采用的溫度調(diào)整滅活溫度，但不低于56℃，此條件是依據(jù)以往對MERS等病毒滅活條件的研究。同時專家共識也建議各實驗室對原始樣品的滅活條件有預(yù)實驗結(jié)果的支持。由于目前常見樣本類型的新冠病毒核酸陽性檢出率仍不高，故任何可能降低病毒核酸提取效果及檢出率的因素，如樣本滅活條件及滅活時間等均應(yīng)引起重視。此前，華中科技大學(xué)附屬同濟醫(yī)院檢驗科的專家學(xué)者對PCR檢測病毒核酸(以乙型流感病毒為例)進行了相應(yīng)的小樣本量比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未滅活處理、56℃水浴30min，及50℃干預(yù)1h的同一樣本其PCR檢測陽性結(jié)果的擴增曲線CT值無明顯變化，可作為新冠病毒樣本滅活的參考。根據(jù)筆者所在研究團隊20例新冠病毒感染者的同一樣行樣本分別進行56℃干浴30min及65℃干浴30min后，其PCR檢測的陽性CT值無明顯差異(P>0.05)，該研究結(jié)果尚未發(fā)表。三、新冠病毒核酸檢測結(jié)果1.不同樣品類型中新冠病毒的核酸檢測在臨床上的新冠病毒疑似病例分別采集不同類型呼吸道樣品進行核酸檢測，結(jié)果初步提示在新冠病毒感染中，取咽拭子樣本及深部痰樣本的病毒核酸檢出率之間有明顯差異，咽拭子樣品中新冠病毒陽性檢出率低于深部咳痰。2.不同呼吸道樣本取樣材料對新冠病毒核酸檢測結(jié)果的影響在確診患者中對比了帶病毒保存液的植絨拭子樣本及無病毒保存液的普通棉簽拭子樣本的新冠病毒核酸檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)普通棉簽拭子的核酸檢出率明顯低于帶病毒保存液的植絨拭子(P<0.05)。3.討論根據(jù)目前最新版新冠病毒診療指南、防控方案及實驗室檢測專家共識，對新冠病毒的核酸檢測均應(yīng)至少檢測ORF1ab及N基因(或E基因)，檢測的通道同時陽性時判定為陽性，并均踢打陰性結(jié)果不能排除新冠病毒感染，應(yīng)考慮各環(huán)節(jié)中導(dǎo)致假陰性的原因。同時在第五版實驗室檢測技術(shù)指南中，對于單通道陽性結(jié)果，不僅要求重新采樣及檢測，對結(jié)果判定也增加了新的要求，即重新檢測結(jié)果仍為單通道陽性時，判定heUS那檢測結(jié)果為陽性；同時增加了2種類型樣本均檢測得到單靶標(biāo)陽性結(jié)果時，應(yīng)判定核酸檢測結(jié)果為陽性。四、新冠病毒核酸檢測流程1.試劑配制根據(jù)待測樣本數(shù)量+2人份（空白對照和陽性對照）配制試劑：（2019-nCoV-PCR反應(yīng)液26μl/人份+2019-nCoV-PCR-酶混合液4μl/人），充分混勻成PCR混合液，每一反應(yīng)管分裝30μl配制好的PCR混合液。2.核酸提?。?）取出樣本