藥品無菌保證原理

第一部分微生物基礎知識簡介第2頁,共62頁，2024年2月25日，星期天一、微生物生存的環(huán)境人類生活的環(huán)境充斥著大量微生物海拔100英里（約160公里）以上海平面以下600英尺（約182米）的地方都可以發(fā)現(xiàn)微生物的蹤跡1英里=5,280英尺或1.609公里第3頁,共62頁，2024年2月25日，星期天一、常見微生物種類基本特點細菌0.5～5μm，生長態(tài)時不耐熱，部分能形成耐熱芽孢真菌5μm～50μm，形成芽孢隨空氣擴散，不耐熱病毒小于0.1μm，一般不耐熱，0.22μm過濾不了第4頁,共62頁，2024年2月25日，星期天一、真菌和細菌大小真菌5μm~50μm細菌0.5~5μm主要成員酵母、霉菌細菌細胞組成酵母是單細胞，其它為多細胞均為單細胞細胞質成份遺傳物質(DNA)被雙層核膜包裹(真核)，并且還有如線粒體、葉綠體及高卡基體等被膜包裹的細胞器。遺傳物質(DNA)祼露并游離于細胞質內(原核)，并且不含有其它有膜細胞器。繁殖方式有性（如大型真菌或無性如酵母），霉菌則二者兼有無性（裂殖）孢子霉菌產生分生孢子（生長繁殖，類似于植物的種子)，雖不耐熱，但會飄浮于空氣中而難以消除。酵母不會產生孢子。主要只有兩個屬產生孢子（內生孢子），又名芽孢：Bacillus-芽孢桿菌屬和Clostridium-梭菌屬，細菌芽孢屬于休眠體，一個細菌細胞產生一個芽孢生長條件20-25oC,3-5天30-35oC,1-2天殺滅程度不耐熱，但難用消毒劑消毒（因孢子處于漂浮狀態(tài)）生長態(tài)菌不耐熱（極個別除外），但形成芽孢后耐熱。第5頁,共62頁，2024年2月25日，星期天一、微生物分布特點微生物無處不在氣源性微生物革蘭氏陽性菌較多它們可形成芽孢，難以殺滅因此，藥品生產需要HVAC水源性則革蘭氏陽性菌居多不會生成孢子但會形成細菌內毒素耐熱性差G+G-第6頁,共62頁，2024年2月25日，星期天一、生長態(tài)菌及孢子將植物比喻微生物，不恰當而直觀如玉米，發(fā)芽→生長→種子，前二種相當于微生物的生長狀態(tài)，到了種子，對環(huán)境的（水分、溫度等）耐受性大大增強然而，微生物的芽孢，并不是繁殖的手段，而是休眠體，植物沒有這種相對應的東西革蘭氏陽性菌：氣源性，身體上部，呼吸道革蘭氏陰性菌：則是水源性的，細胞結構不同生物指示劑均為革蘭氏陽性菌，滅菌用BI為非致病菌。第7頁,共62頁，2024年2月25日，星期天一、細菌芽胞（孢）的形成及其特性成熟芽孢孢子壁母細胞孢子壁的形成生長態(tài)細胞摘自/microbes/spores.asp內生孢子產生于Gram+

細菌:

芽孢桿菌屬Bacillus

梭菌屬Clostridium僅含核酸及少量萌發(fā)必需物皮層含DPA和Ca2+復合物能抵御各種惡劣環(huán)境可休眠上百萬年真菌孢子因不具上述特性而不耐熱DPA：吡啶二羧酸第8頁,共62頁，2024年2月25日，星期天一、生物指示劑（BI）的定義對特定滅菌工藝具有一定耐受性并能用于定量測定滅菌效力的微生物制劑（USP28）

特點用于制備生物指示劑的微生物應具有相當?shù)哪褪苄浴⒎€(wěn)定性、易培養(yǎng)、及非致病性相用于被驗證產品、滅菌工藝、生產工藝符合有關法規(guī)的要求第9頁,共62頁，2024年2月25日，星期天一、什么是芽孢？當某些細菌遇到不良生存環(huán)境條件時，為保護自身，在細胞內形成一外壁厚而堅硬的體眠體，該體眠體即稱芽孢（Spore）或孢子。由于其對不良環(huán)境的耐受性遠高于生長態(tài)細胞，常被用于挑戰(zhàn)滅菌工藝，以確認被滅菌物品無菌的可靠性。第10頁,共62頁，2024年2月25日，星期天一、芽孢的特性主要產生于Gram+

細菌的兩個屬芽孢桿菌屬Bacillus梭菌屬Clostridium能抵御各種惡劣環(huán)境，可存活上百萬年，因為它有厚的皮層結構僅含核酸及少量萌發(fā)必需物含水量極低休眠體，內生孢子，不可再生（每個細胞只產生一個芽孢）；真菌孢子屬于分生孢子，不具上述特性。第11頁,共62頁，2024年2月25日，星期天芽孢的特點耐熱80℃下長期存活100℃下有相當高的存活率100℃以上死亡過程符合一級動力學方程影響芽孢耐熱性的因素芽孢存在的介質受熱時的濕度第12頁,共62頁，2024年2月25日，星期天生物指示劑（BI）對特定滅菌工藝具有一定耐受性并能用于定量測定滅菌效力的微生物制劑（USP28）

特點芽孢用于制備生物指示劑的微生物應具有相當?shù)哪褪苄?、穩(wěn)定性、易培養(yǎng)、及非致病性第13頁,共62頁，2024年2月25日，星期天第二部分

熱力滅菌基本原理第14頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

熱對微生物的作用當高溫破壞了細胞中起生命作用的蛋白質、酶及核酸時，細胞死亡。生命基本物質的破壞本質上是化學變化實驗證明微生物受熱死亡速度符合一級動力學方程第15頁,共62頁，2024年2月25日，星期天一級動力學方程式dN/dt＝K(N0－Nt)N0為t＝0時，存活的微生物數(shù)；

Nt為t時被殺滅的微生物數(shù)；

N為t時存活的微生物數(shù)

K為常數(shù)。對數(shù)規(guī)則第16頁,共62頁，2024年2月25日，星期天微生物存活數(shù)與滅菌時間關系圖

半對數(shù)座標Y軸：微生物取對數(shù)X軸：時間為10進制普通座標tlgN102030123Y軸及X軸均為普通座標（示意）tN102030101001000第17頁,共62頁，2024年2月25日，星期天芽孢的耐熱參數(shù)：D值指一定溫度下將微生物殺滅90％或下降一個對數(shù)單位所需要的時間。lgNt1234t1t2D第18頁,共62頁，2024年2月25日，星期天滅菌溫度對D值的影響滅菌溫度低時，達到同一滅菌效果的時間就長115℃121℃125℃lgNt△lgN=1D125D121D115第19頁,共62頁，2024年2月25日，星期天F0值：達到同一滅菌效果的概念

F0值即標準滅菌時間指產品在滅菌過程中獲得的與標準參照條件（121℃）相同滅菌效果的曝熱時間lgNtLgNoLgNt121℃117℃△LgNFTFo第20頁,共62頁，2024年2月25日，星期天不同滅菌溫度下的滅菌率滅菌溫度℃滅菌率L1000.0081050.0251120.1261150.2511160.3161180.5011200.7941211.0001221.251231.59滅菌率：為達到與某一溫度下滅菌1分鐘相同的滅菌效果，在121℃下滅菌所需要的滅菌時間

100℃滅菌時1分鐘，相當于121℃滅菌0.008分鐘，即Fo值為0.008分鐘。105℃滅菌40分鐘時，F(xiàn)o約為1分鐘，能使D值為1分鐘的芽孢數(shù)量下降1個對數(shù)單位第21頁,共62頁，2024年2月25日，星期天第三部分

藥典對最終滅菌產品的無菌標準第22頁,共62頁，2024年2月25日，星期天無菌檢查的局限性歷史的教訓：1962年，美國FDA頒布第一部GMP1970-1975年，美國輸液污染至敗血癥400多起

--有問題的產品全部通過了無菌檢查無菌檢查的風險（另稿有示例說明）取樣量為20瓶時污染率與通過無菌檢查概率的關系批產品污染率％5101520通過無菌檢查的概率％361241第23頁,共62頁，2024年2月25日，星期天藥典對無菌保證的定量標準1973年的英國藥典和1980年USP增補版提到了無菌的量化標準Fo不小于8分鐘經滅菌后，產品中污染菌存活的概率不大于百萬分之一。中國藥典在2000版起，收載了此標準。無菌保證值：污染菌存活概率的負對數(shù)，經滅菌后，產品的無菌保證值不小于6第24頁,共62頁，2024年2月25日，星期天lgN2345-2-3-41-5-6-101234576891012分11SAL＝F0/D–lgN0

假定D121為1無菌保證值與Fo、D值及帶菌量的關系過度殺滅示意生產中Fo=8示意第25頁,共62頁，2024年2月25日，星期天“無菌”的標準及概念“每批產品中，污染品概率不得超過一百萬分之一”，無菌的這一量化標準應當可以用試驗來證明的。用無菌檢查法顯然是不可能的。然而，每瓶產品微生物存活的概率卻可計算的。這就需要測試產品滅菌前微生物污染數(shù)、D值，使用對數(shù)規(guī)則，并用生物指示劑試驗來證實。量化指標+計算+試驗，使無菌標準成為工業(yè)界可執(zhí)行的標準

第26頁,共62頁，2024年2月25日，星期天產品滅菌完全的必要措施

從公式

SAL＝F0/D–lgN0看滅菌完全的必要措施足夠的F0值產品滅菌前污染菌檢測需氧菌總計數(shù)（微生物污染水平）污染菌耐熱性第27頁,共62頁，2024年2月25日，星期天產品滅菌完全的必要措施-2通常采用的中間控制手段：對每批的灌封開始和結束階段，分別對灌裝好的半成品取樣檢測。樣品須作需氧菌總計數(shù)將檢品液置于100℃下加熱10分鐘，檢查是否有耐熱芽孢存活須對微生物學檢測結果進行趨勢分析。第28頁,共62頁，2024年2月25日，星期天產品滅菌完全的必要措施-3

FDA要求－“對于在滅菌前產品污染菌檢測中所發(fā)現(xiàn)的耐熱孢子，必須與驗證滅菌工藝所用生物指示劑的耐熱性進行對比”第29頁,共62頁，2024年2月25日，星期天產品滅菌完全的必要措施-4具體要求：如經熱處理后檢出的微生物是芽孢類微生物。需將其培養(yǎng)并收集芽孢，測定其的耐熱性，將之與驗證滅菌工藝用生物指示劑的耐熱性進行對比。如果所分離的污染菌耐熱性高于生物指示劑的耐熱性，則必須使用耐熱性更強的生物指示劑對滅菌工藝重新進行驗證(可以使用生產中的分離菌)。如果在生產全過程中，對微生物污染嚴格控制，那么，這種情況發(fā)生的概率是非常小的。第30頁,共62頁，2024年2月25日，星期天無菌保證水平舉例假定滅菌開始時產品中的污染微生物總數(shù)（N0）為100cfu/瓶，污染微生物的耐熱參數(shù)（D）為1分鐘，要達到藥典規(guī)定的SAL不小于6的標準，滅菌F0值應達到多少？相當于121℃和115℃下滅菌多少分鐘？答：F0=（SAL＋lgN0）×D=（6+lg100）×1=8分鐘，需在121℃下滅菌8分鐘。換算成115℃下的滅菌時間是：F0/L115=8/0.25=32分鐘。第31頁,共62頁，2024年2月25日，星期天某復方氨基酸注射液采用110℃，30分鐘的滅菌程序，起始污染微生物仍為100cfu/瓶，D值為0.5分鐘，請計算無菌保證值和殘存微生物污染的概率。答：其SAL為：SAL=F0/D-lgN0=L110×t/D-lg100=0.08×30/0.5-2=2.8殘存微生物的概率為10-2.8＝0.158％通過無菌檢查的概率為(1-0.158％)20=96.9%。無菌保證水平舉例二第32頁,共62頁，2024年2月25日，星期天第四部分

注射劑常見滅菌方法第33頁,共62頁，2024年2月25日，星期天濕熱滅菌-1濕熱滅菌通常指一定壓力下的蒸汽滅菌，也包括過熱水滅菌（水浴式或噴淋式）實際上只要微生物處于達到水－水蒸氣平衡狀態(tài)下的滅菌過程，都是濕熱滅菌例：實驗室給微生物取樣瓶滅菌時通常加入1ml水并密封。水分的存在有利于滅菌第34頁,共62頁，2024年2月25日，星期天濕熱滅菌特點蒸汽有利于蛋白質的變性和酶的失活，從而殺滅細胞蒸汽熱穿透性強滅菌效率高溫度相對較低滅菌時間相對短滅菌過程不產生任何化學物理污染滅菌設備控制參數(shù)少，運行穩(wěn)定，方便管理第35頁,共62頁，2024年2月25日，星期天濕熱滅菌工藝之一美國FDA規(guī)定的殘存概率法滅菌過程8≤F0<12分鐘適用于熱穩(wěn)定性不很好的產品通過控制工藝過程的微生物污染和滅菌工藝參數(shù)使產品無菌無菌保證值不小于6第36頁,共62頁，2024年2月25日，星期天濕熱滅菌工藝之二過度殺滅法F0不低于12熱穩(wěn)定性好的產品以徹底殺滅任何污染的微生物為實現(xiàn)無菌的手段無菌保證值不小于6第37頁,共62頁，2024年2月25日，星期天其它濕熱滅菌工藝？F0值低于8的滅菌工藝熱穩(wěn)定性很差的產品以無菌生產工藝為基礎，滅菌是提高無菌保證水平的輔助手段不計算F0值，污染概率不大于0.1%除血液制品外，發(fā)達國家這類大容量注射劑幾乎沒有小容量注射劑也少見第38頁,共62頁，2024年2月25日，星期天無菌灌裝與流通蒸汽滅菌PDA《參數(shù)放行》-1999-10-21文件中指出：如果產品在最終滅菌前采取無菌灌裝，那么該產品的滅菌工藝可以采用較小的F0值（如F0≤8min）這當然是對熱穩(wěn)定差的產品采用的方法此提法和歐盟GMP無菌藥品附錄一致這一原則還沒有被我國制藥行業(yè)所認可，我國企業(yè)只認可流通蒸汽滅菌，卻忽視了無菌制造工藝的關鍵要求第39頁,共62頁，2024年2月25日，星期天不同工藝無菌保證比較表過度殺滅法Fo>1210-6熱穩(wěn)定性好的產品以殺滅微生物作為實現(xiàn)無菌的手段殘存概率法Fo>810-6熱穩(wěn)定性較差產品工藝過程將防止產品被耐熱菌污染放在首位，而不是僅依賴最終滅菌去消除污染

流通蒸汽法不計算Fo0.1%熱不穩(wěn)定產品加熱是無菌生產工藝（除菌過濾）的補充手段除菌過濾法LRV>70.1%不能加熱的產品LRV=logreductionvalue過濾對數(shù)下降值，一般上游為107下游為1，則LRV=7由于后續(xù)無菌操作較多，最終產品達到的無菌保證水平遠低于除菌過濾的本身的能力第40頁,共62頁，2024年2月25日，星期天干熱滅菌機理干熱滅菌與濕熱滅菌的動力學特征相似，符合“對數(shù)規(guī)則”，但滅菌的機理卻并不相同。干熱滅菌為何需較高的溫度？水份的影響：濕度低機理不同：干熱滅菌是使微生物氧化而不是使蛋白質變性第41頁,共62頁，2024年2月25日，星期天干熱滅菌要點干熱滅菌的介質通常是熱空氣用對數(shù)規(guī)則描述微生物殺滅過程，準確性較差溫度高，200℃以上，有可能到320℃用于玻璃容器、手術器械等無菌生產工藝中安瓿、西林瓶的滅菌和去熱源第42頁,共62頁，2024年2月25日，星期天干熱滅菌與去熱原的關系去熱原的工藝條件比孢子殺滅程序要苛刻得多，通常相當于標準干熱滅菌時間FH

的數(shù)十倍。如果干熱法去熱原工藝能使細菌內毒素下降3個對數(shù)單位，就不必再進行微生物的生物指示劑挑戰(zhàn)性試驗。第43頁,共62頁，2024年2月25日，星期天第五部分

滅菌工藝的驗證第44頁,共62頁，2024年2月25日，星期天滅菌工藝的驗證滅菌工藝驗證資料是國外藥品（注射劑）注冊的必報材料滅菌工藝條件（滅菌介質、溫度時間參數(shù)、裝載方式等）滅菌設備和滅菌工藝的驗證（前者與后者不同）滅菌工藝驗證資料包括滅菌設備的安裝確認滅菌設備的運行確認滅菌工藝的驗證先對設備溫度儀表和驗證用儀表進行校準空載熱分布－找到滅菌過程中滅菌設備的最冷點不同裝載形式、不同裝量規(guī)格產品的熱穿透試驗－產品獲得的F0生物指示劑驗證-微生物挑戰(zhàn)性試驗第45頁,共62頁，2024年2月25日，星期天滅菌過程的Fo示意第46頁,共62頁，2024年2月25日，星期天熱力滅菌常用生物指示劑滅菌方式微生物（孢子）D值范圍（分）濕熱121℃嗜熱脂肪芽孢桿菌Bacillusstearothermophilus

1.5-3.0枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis

0.3-0.7凝結芽孢桿菌Bacilluscoagulans

0.4-0.8梭狀芽孢桿菌Clostridiumsporogenes

0.4-0.8干熱150℃枯草芽孢桿菌黑色變種

Bacillussubtilisvar.niger

>1.0資料來源：參數(shù)放行專題材料第47頁,共62頁，2024年2月25日，星期天第六部分

常見滅菌設備介紹第48頁,共62頁，2024年2月25日，星期天滅菌設備1、混合蒸汽滅菌柜2、下排式蒸汽滅菌柜3、脈動真空蒸汽滅菌柜4、旋轉噴淋滅菌柜5、隧道式洗瓶滅菌柜工作原理圖第49頁,共62頁，2024年2月25日，星期天混合蒸汽滅菌柜SAM=steamairmixture蒸汽空氣混合滅菌柜混合汽體滅菌柜進蒸汽的管沒畫出頂上用一風扇，使滅菌均勻無風扇時，滅菌容易不均勻熱交換器控制冷卻速度第50頁,共62頁，2024年2月25日，星期天下排式蒸汽滅菌柜熱蒸汽在上冷空氣在下蒸汽擠空氣第51頁,共62頁，2024年2月25日，星期天脈動真空蒸汽滅菌柜有高真空及脈動真空二種形式第二種比較常見抽99%，剩1%3次真空，殘存的空氣為0.1%密封圈第52頁,共62頁，2024年2月25日，星期天旋轉噴淋滅菌柜純化水或注射用水作傳熱介質-過熱水滅菌加熱時開工業(yè)蒸汽冷卻時，可用冷凍水或自來水冷卻產品轉動，受熱均勻軟袋滅菌時，用過熱水較多，但需加壓縮空氣第53頁,共62頁，2024年2月25日，星期天干熱滅菌柜常見程序：180×2小時，細菌內毒素下降3對數(shù)單位第54頁,共62頁，2024年2月25日，星期天隧道式洗瓶滅