第8章 DNA復(fù)制和修復(fù)課件

第八章DNA的復(fù)制和修復(fù)

第8章DNA復(fù)制和修復(fù)第一節(jié)染色體

第二節(jié)DNA的復(fù)制

第三節(jié)原核生物和真核生物DNA的復(fù)制特點

第四節(jié)DNA的損傷和修復(fù)主要講授內(nèi)容第8章DNA復(fù)制和修復(fù)第一節(jié)染色體第8章DNA復(fù)制和修復(fù)一、染色體（Chromosome)

內(nèi)容提要：細胞周期染色體與染色質(zhì)染色體的結(jié)構(gòu)和組成（原核生物、真核生物）核小體原核生物和真核生物基因組結(jié)構(gòu)特點比較

第8章DNA復(fù)制和修復(fù)CellcycleInterphase間期:G1+S+G2Mphase(mitosis有絲分裂):（一）細胞周期連續(xù)分裂的細胞從上一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂完成所經(jīng)歷的整個過程。包含G1期、S期、G2期、M期四個階段。合成RNA和核糖體合成DNA和組蛋白以及復(fù)制所需要的酶。DNA合成后期，是有絲分裂的準(zhǔn)備期。在這一時期，DNA合成終止，大量合成RNA及蛋白質(zhì)，包括微管蛋白和促成熟因子等。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)第8章DNA復(fù)制和修復(fù)（二）染色體與染色質(zhì)同一物種內(nèi)每條染色體所帶DNA的量是一定的，但不同染色體或不同物種之間變化很大，從上百萬個到幾億個核苷酸不等。如人X染色體就帶有1.28億個核苷酸對，而Y染色體只帶有0.19億個核苷酸對。染色體（chromosome）是細胞在有絲分裂時遺傳物質(zhì)存在的特定形式，是間期細胞染色質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密包裝的結(jié)果。真核生物的染色體在細胞生活周期的大部分時間里都是以染色質(zhì)(chromatin)的形式存在的。染色質(zhì)是一種纖維狀結(jié)構(gòu)，叫做染色質(zhì)絲，它是由最基本的單位—核小體(nucleosome)成串排列而成的。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)染色體和染色質(zhì)在化學(xué)組成上（DNA和組蛋白等）沒有差別，主要在于它們空間構(gòu)象不同，這也反映了它們在細胞周期的不同階段有不同功能。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)作為遺傳物質(zhì)，染色體具有以下特征：①分子結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定；②能夠自我復(fù)制，使親代、子代之間保持連續(xù)性；③能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成；④能夠產(chǎn)生可遺傳的變異。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)（三）染色體的結(jié)構(gòu)和組成（1）原核生物(prokaryote)的染色體原核生物如細菌染色體位于細胞內(nèi)的核區(qū)中，核區(qū)外沒有核膜。一般只有一條或幾條染色體，呈雙鏈閉環(huán)結(jié)構(gòu)，長度從250-35000μm不等。染色體裸露，沒有組蛋白和其他蛋白質(zhì)結(jié)合，不形成核小體結(jié)構(gòu)。比較易于接收帶有相同或不同物種的基因或DNA片段的插入。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)大腸桿菌染色體長為1333μm，要裝入長約為2μm，寬約1μm的細胞中，因此DNA必需以折疊或螺旋的方式存在。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)第8章DNA復(fù)制和修復(fù)第8章DNA復(fù)制和修復(fù)原核生物DNA基因組的特點①結(jié)構(gòu)簡練：DNA分子的絕大部分用來編碼蛋白質(zhì)，只有一小部分不轉(zhuǎn)錄，作為控制基因表達的序列存在。②基因種類和數(shù)量較少：③以操縱子為轉(zhuǎn)錄單元：原核生物DNA序列中功能相關(guān)的RNA和蛋白質(zhì)基因，往往聚集在基因組的一個或幾個特定部位，形成功能單位或轉(zhuǎn)錄單元，可被一起轉(zhuǎn)錄為含多個mRNA的分子，即多順反子mRNA.第8章DNA復(fù)制和修復(fù){組蛋白：H1H2AH2BH3H4非組蛋白}核小體{DNA蛋白質(zhì)染色體(2)真核生物染色體的組成第8章DNA復(fù)制和修復(fù)組蛋白的一般特性：■進化上的保守性保守程度：H1H2A、H2BH3、H41、組蛋白

上海生化所分子遺傳學(xué)1998年試題：在真核生物核內(nèi)。五種組蛋白（H1H2AH2BH3和H4）在進化過程中，H4極為保守，H2A最不保守（）第8章DNA復(fù)制和修復(fù)■無組織特異性■肽鏈氨基酸分布的不對稱性:N端均為堿性氨基酸。對于H1相反，C端為堿性氨基酸，N端疏水端?！鯤5組蛋白的特殊性：富含賴氨酸（24%）：兩棲類、魚類和鳥類中用來替換H1■組蛋白的可修飾性第8章DNA復(fù)制和修復(fù)簡述真核生物染色體上組蛋白的種類，組蛋白修飾的種類及其生物學(xué)意義中國科學(xué)院2003年碩士研究生入學(xué)《生物化學(xué)與分子生物學(xué)》試題

第8章DNA復(fù)制和修復(fù)

在細胞周期特定時間可發(fā)生甲基化、乙?；?、磷酸化和ADP核糖基化等。H3、H4修飾作用較普遍，H2B有乙酰化作用、H1有磷酸化作用。所有這些修飾作用都有一個共同的特點，即降低組蛋白所攜帶的正電荷。這些組蛋白修飾的意義：一是改變?nèi)旧w的結(jié)構(gòu)，直接影響轉(zhuǎn)錄活性；二是核小體表面發(fā)生改變，使其他調(diào)控蛋白易于和染色質(zhì)相互接觸，從而間接影響轉(zhuǎn)錄活性。組蛋白的可修飾性第8章DNA復(fù)制和修復(fù)H2BH2AH3H4a2a3a1a2a3a1a2a3a1a2a3a1L1L2aN第8章DNA復(fù)制和修復(fù)*組蛋白八聚體（Histoneoctamer）

H2A與H2B、H3與H4的親和力強，通過C端的疏水氨基酸結(jié)合

兩個H3、H4先形成四聚體結(jié)合兩個H2A和H2B的異二聚體組蛋白八聚體第8章DNA復(fù)制和修復(fù)2非組蛋白是指染色體上與特異DNA序列相結(jié)合的蛋白質(zhì)，所以又稱為序列特異性DNA結(jié)合蛋白（sequence-specificDNA-bindingproteins）。其酸性氨基酸的量超過堿性氨基酸的量，因此帶負電荷。具有種屬和組織特異性在整個細胞周期中都進行合成，不像組蛋白僅在S期和DNA復(fù)制同步進行。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)功能：幫助DNA分子折疊，形成不同的結(jié)構(gòu)域，從而利于DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄；協(xié)助啟動DNA復(fù)制；特異性地控制基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)基因表達。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)（四）核小體（Nuclearsome）*染色體結(jié)構(gòu)的第一個層次，構(gòu)成染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位

*足量的微球菌核酸酶處理染色質(zhì)可得到

＃146bpDNA＋組蛋白八聚體→核小體的核心顆粒

直徑約10nm①、核小體的組成第8章DNA復(fù)制和修復(fù)

組蛋白八聚體146bp的核心DNA146bp的核心DNA在組蛋白八聚體上盤繞1.75圈第8章DNA復(fù)制和修復(fù)Mononucleosomestypicallyhave~200bpDNA.End-trimmingreducesthelengthofDNAfirstto~165bp（含組蛋白H1）,andthengeneratescoreparticleswith146bp.＃微球菌酶處理所得核小體DNA長度的變化第8章DNA復(fù)制和修復(fù)第8章DNA復(fù)制和修復(fù)Chromatosome166bp,2superhelicalturnHistoneH1*組蛋白H1把核小體

“封鎖”起來第8章DNA復(fù)制和修復(fù)連接DNA<10to>100bp平均55bpNucleosomeHistoneH1Nucleosomerepeat:Core+linkerDNA200bp

②、染色體結(jié)構(gòu)的形成

（1）首先若干個核小體形成念珠狀結(jié)構(gòu)

第8章DNA復(fù)制和修復(fù)The10nmfiberisacontinuousstrongofnucleosomes.每個核小體單位包括：200bp左右的DNA、一個組蛋白八聚體、一分子H1第8章DNA復(fù)制和修復(fù)

高度有序左手螺旋每圈包括六個核小體30nmfiber(直徑30nm)Solenoid(螺線管）（2）30nm纖絲的構(gòu)成－－

染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的第二層次a、組成核小體串珠纖維在酶的作用下形成每圈6個核小體，外徑30nm的螺旋結(jié)構(gòu)。

第8章DNA復(fù)制和修復(fù)Nuclearmatrix(核基質(zhì)),proteincomplex30nmfiber300nmb、體內(nèi)存在狀態(tài)第8章DNA復(fù)制和修復(fù)從DNA到染色體的過程Compactionratio=8000螺旋結(jié)構(gòu)再次螺旋化，形成超螺旋結(jié)構(gòu)（此處有爭議，人衛(wèi)版醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)同意超螺旋學(xué)說，而北大版教材認為3級結(jié)構(gòu)是微帶，即曲折化的螺線管），此為3級結(jié)構(gòu)

第8章DNA復(fù)制和修復(fù)（3）真核生物基因組結(jié)構(gòu)特點●真核基因組結(jié)構(gòu)龐大

3×109bp、染色質(zhì)、核膜●單順反子●基因不連續(xù)性斷裂基因（interruptedgene）、內(nèi)含子(intron)、外顯子(exon)●非編碼區(qū)較多多于編碼序列(9:1)●含有大量重復(fù)序列第8章DNA復(fù)制和修復(fù)■不重復(fù)序列/單一序列：在基因組中有一個或幾個拷貝。真核生物的大多數(shù)基因在單倍體中都是單拷貝的。如：蛋清蛋白、血紅蛋白等功能：主要是編碼蛋白質(zhì)。■中度重復(fù)序列：在基因組中的拷貝數(shù)為101~104。如：rRNA、tRNA

一般是不編碼蛋白質(zhì)的序列，在調(diào)控基因表達中起重要作用

第8章DNA復(fù)制和修復(fù)■高度重復(fù)序列：拷貝數(shù)達到幾百個到幾百萬個。

●衛(wèi)星DNA：A?T含量很高的簡單高度重復(fù)序列。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)第二節(jié)DNA的復(fù)制第8章DNA復(fù)制和修復(fù)一、核酸生物合成的一般規(guī)律絕大多數(shù)DNA和RNA的生物合成均按照Watson-Crick的堿基配對原則，以預(yù)先存在的DNA鏈為模板，逐個復(fù)制，生成新的拷貝。某些病毒以RNA為模板，以逆轉(zhuǎn)錄方式合成互補的DNA（cDNA），然后再合成病毒RNA。DNA或RNA鏈的生物合成只能以5’-3’方向進行。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)特異性的聚合酶類催化核酸的生物合成：DNA聚合酶以DNA為模板催化DNA生物合成，稱為復(fù)制；RNA聚合酶以DNA為模板，催化RNA的生物合成，稱為轉(zhuǎn)錄。而逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板，合成DNA。在復(fù)制過程中，雙螺旋DNA的兩條鏈都作為模板，分別合成兩條DNA子鏈。在轉(zhuǎn)錄過程中，雙螺旋DNA中只有一條鏈為模板，RNA聚合酶合成與模板互補的RNA鏈。RNA聚合酶進行聚合反應(yīng)時，能夠直接以NTP為底物，逐個聚合，即從頭合成RNA。但DNA聚合酶不能催化從頭開始合成DNA，必須具有引物，底物dNTP只能加到已存在的RNA或DNA鏈的3’－OH末端。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)二、基本概念

(BasicConcept)DNA復(fù)制

親代雙鏈DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分別以各單鏈DNA分子為模板，聚合與自身堿基可以互補配對的游離的dNTP,

合成出兩條與親代DNA分子完全相同的子代DNA分子的過程?！?/p>

復(fù)制子（Replicon）；又稱復(fù)制單位或復(fù)制元DNA中含有一定復(fù)制起點和復(fù)制終點的復(fù)制單位。

1.3萬～90萬不等第8章DNA復(fù)制和修復(fù)●復(fù)制體（Replisome）Themultiprotein(30±)structurethatassemblesatreplicatingforktoundertakesynthesisofDNA復(fù)制叉處的許多酶和蛋白組成的復(fù)合體，協(xié)同動作合成DNA●復(fù)制叉DNA復(fù)制時，首先在一定位置解開雙鏈，這個復(fù)制起點呈現(xiàn)叉子的形式，稱為復(fù)制叉。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)三、DNA的半保留復(fù)制（Semi-ConservationReplication）概念：復(fù)制過程中各以雙螺旋DNA的其中一條鏈為模

板合成其互補鏈，新生的互補鏈與母鏈構(gòu)成子

代DNA分子。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)全保留復(fù)制半保留復(fù)制混合復(fù)制1958Meselson-stahl設(shè)計的CsCl超離心試驗證實了DNA復(fù)制的這一特性。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)DNA半保留復(fù)制的實驗依據(jù)：1958年

Meselson&Stahl

E.coli

放射性同位素（15N）標(biāo)記

CsCl密度梯度離心StahlMeselson第8章DNA復(fù)制和修復(fù)培養(yǎng)一代培養(yǎng)二代培養(yǎng)三代第8章DNA復(fù)制和修復(fù)第8章DNA復(fù)制和修復(fù)第8章DNA復(fù)制和修復(fù)15N標(biāo)記實驗·細胞生長在15N標(biāo)記培養(yǎng)基中·轉(zhuǎn)入正常N源培養(yǎng)基中·分離各代DNA·分析各代DNA的浮力密度15N標(biāo)記DNA未標(biāo)記DNACsCL密度梯度離心浮力密度

N15－DNA1.742g/mlN15－N14－DNA1.717g/mlN14－DNA1.710g/ml第8章DNA復(fù)制和修復(fù)第8章DNA復(fù)制和修復(fù)DNA半保留復(fù)制的意義：保證DNA代謝的穩(wěn)定性。經(jīng)過多代的復(fù)制，親代的遺傳特征完整無誤的傳遞給子代，子代DNA仍可以保持與最初親本的一致性。

穩(wěn)定性是相對的，變異是絕對的在各種理化因素的作用下，DNA會發(fā)生損傷；在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄的過程中，DNA會發(fā)生錯誤；在生長發(fā)育的過程中，DNA可能進行修飾、刪除、擴增和重排。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)

四、復(fù)制起點、方式和方向1、復(fù)制起點（originori或o復(fù)制原點）復(fù)制開始處DNA分子的特定位置原核生物（Prokaryote）：單復(fù)制起點即－－整個染色體只有一個復(fù)制單位

第8章DNA復(fù)制和修復(fù)

真核生物（Eukaryote）:多復(fù)制起點即－－一個genome中有多個復(fù)制單位第8章DNA復(fù)制和修復(fù)Replicationfork第8章DNA復(fù)制和修復(fù)

復(fù)制叉（Replicationfork）：染色體中參與復(fù)制的活性區(qū)域，即復(fù)制正在發(fā)生的位點

2、復(fù)制方向（復(fù)制過程的順序性）

復(fù)制眼（replicationeye）：電子顯微鏡下觀察正在復(fù)制的DNA，復(fù)制的區(qū)域形如一只眼睛第8章DNA復(fù)制和修復(fù)真核生物的多復(fù)制子多個復(fù)制眼第8章DNA復(fù)制和修復(fù)第8章DNA復(fù)制和修復(fù)

（1）單雙向復(fù)制取決于起點處有一個還是兩個復(fù)制叉

單向復(fù)制

雙向復(fù)制第8章DNA復(fù)制和修復(fù)（2）復(fù)制方向的多模式單起點、單方向（原核）多起點、單方向（真核）單起點、雙方向（原核）多起點、雙方向（真核）第8章DNA復(fù)制和修復(fù)3、復(fù)制方式大多數(shù)以對稱方式進行－－即兩條鏈同時復(fù)制也有一定時期內(nèi)DNA只復(fù)制一條鏈的情況

（1）從新起始（denovoinitiation

）或復(fù)制叉式（replicationfork

）

比較形象的－－θ

復(fù)制雙鏈環(huán)狀DNA的復(fù)制眼可以形成一種θ結(jié)構(gòu)，形狀像希臘字母θ，因而叫….第8章DNA復(fù)制和修復(fù)AreplicationeyeformsathetastructureincircularDNA.兩個共價封閉的互相盤繞的DNA雙鏈在拓撲異構(gòu)酶作用下從起始點（ori）開始形成DNA切口和封閉，DNA的一條或兩條主鏈骨架有暫時的切斷，是DNA超旋或解旋，有利于復(fù)制叉向前移動。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)

（2）置換式（Displacementform

）又稱D環(huán)復(fù)制

線粒體和葉綠體

DNA的復(fù)制方式2/3屬于不對稱的復(fù)制方式，雙鏈DNA的兩條鏈分別有自己的ori。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)（3）共價延伸方式（covalenceelongation）或滾環(huán)式復(fù)制（rollingcirclereplication）由于復(fù)制時產(chǎn)生的滾環(huán)結(jié)構(gòu)形狀象σ，又稱σ復(fù)制

病毒、細菌因子和真核生物

第8章DNA復(fù)制和修復(fù)第三節(jié)原核生物和真核生物DNA的復(fù)制特點第8章DNA復(fù)制和修復(fù)一、原核生物DNA的復(fù)制特點1、DNA雙螺旋的解旋DNA解螺旋酶或DNA解鏈酶大腸桿菌的解螺旋酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ與rep蛋白共同作用，將DNA兩條鏈解開。解螺旋酶I、II、III沿著模板鏈的5’→3’方向隨著復(fù)制叉的前進而移動，而rep蛋白則在另一條模板鏈上沿3’→5’方向移動。

第8章DNA復(fù)制和修復(fù)解旋酶(helicase):

使DNA的兩條鏈分開，它通常利用ATP水解來提供必需的能量；第8章DNA復(fù)制和修復(fù)該酶能使復(fù)制叉前方的DNA雙鏈解開一短段，每解開一個堿基對需要兩分子ATP水解成ADP和Pi以供給能量。一旦有一段堿基順序解開，就會有幾個分子的單鏈結(jié)合蛋白（SSB）與每條分開的DNA鏈緊密結(jié)合，以防止它們重新接觸結(jié)合堿基對。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)DNA旋轉(zhuǎn)酶屬DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ，可引入負超螺旋，消除復(fù)制叉前進時帶來的扭曲張力。拓撲異構(gòu)酶分兩類：I和II，廣泛存在于原核生物和真核生物。拓撲異構(gòu)酶I使DNA的一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，反應(yīng)無須供給能量，主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，與轉(zhuǎn)錄有關(guān)。拓撲異構(gòu)酶Ⅱ使DNA的兩條鏈同時斷裂和再連接，當(dāng)它引入超螺旋時需要由ATP供給能量。分布在染色質(zhì)骨架蛋白和核基質(zhì)部，與復(fù)制有關(guān)。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)原核拓撲構(gòu)酶Ⅰ作用機制：①酶與DNA結(jié)合使雙鏈解旋；②使一條鏈切開，但酶與切口的兩端結(jié)合阻止了螺旋的旋轉(zhuǎn)；③酶使另一條鏈經(jīng)過缺口，然后再將兩斷端連接起來；④酶從DNA上脫落，兩條鏈復(fù)原，得到的DNA比原來少一個負超螺旋。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）復(fù)制叉上的解螺旋酶，沿雙鏈DNA前進，產(chǎn)生單鏈區(qū)，大量的單鏈DNA結(jié)合蛋白與單鏈區(qū)結(jié)合，阻止復(fù)性和保護單鏈DNA不被核酸酶降解。原核生物SSB蛋白與DNA結(jié)合表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)，如第一個SSB蛋白結(jié)合到DNA上的能力為1，第二個SSB結(jié)合能力高達1000倍，真核生物SSB蛋白無協(xié)同效應(yīng)。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)單鏈結(jié)合蛋白（single-strandbindingprotein):單鏈DNA結(jié)合，阻止其再形成雙鏈體狀態(tài)φX174噬菌體的DNA在三種功能蛋白先后作用下分開成為單鏈：在復(fù)制起始點，噬菌體A蛋白使病毒（+）鏈產(chǎn)生缺口。Rep蛋白提供解旋酶活性，它使兩鏈分離。SSB包繞單鏈形成穩(wěn)定的單鏈形式。ThreeproteinsunwindφX174DNA第8章DNA復(fù)制和修復(fù)

在復(fù)制叉處，DNA的兩條鏈都作為模板同時合成兩條新鏈。DNA分子的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，而DNA復(fù)制時無論以那條鏈做模板，新合成的鏈?zhǔn)前?’→3’方向進行的，所以只有一條模板鏈指導(dǎo)合成的新生鏈能夠沿著復(fù)制叉運動的方向連續(xù)復(fù)制，此新合成的鏈稱為前導(dǎo)鏈（leadingstrand）。另一條模板鏈指導(dǎo)合成的新生鏈也是沿5’→3’方向進行，但與復(fù)制叉前進的方向相反，是分段合成的，這些片斷于1969年首先在大腸桿菌中分離出來，被稱為岡崎片段。

2DNA復(fù)制的半不連續(xù)性（Semi-DiscontinuousReplication）

第8章DNA復(fù)制和修復(fù)迄今發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶只能催化DNA鏈從5’端向3’端延長。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)在細菌中岡崎片段長約1000－2000核苷酸，但在真核生物中，相應(yīng)片斷的長度可能短得多，由100～400個核苷酸組成。合成的片段即為岡崎片段。這些岡崎片段以后由DNA連接酶連成完整的DNA鏈，因此岡崎片段是DNA復(fù)制中短暫的中間產(chǎn)物。這條鏈不連續(xù)合成的鏈稱為滯后鏈(laggingstrand)。這種前導(dǎo)鏈的連續(xù)復(fù)制和滯后鏈的不連續(xù)復(fù)制在生物界是普遍存在的，稱為DNA合成的半不連續(xù)復(fù)制。

第8章DNA復(fù)制和修復(fù)第8章DNA復(fù)制和修復(fù)OnestrandreplicatedascontinuoussegmentOtherreplicatedinshortsegments

(tobejoinedlaterbyligase)Replication

ForkPPPPSSSSContinuousSegmentedUnzipping第8章DNA復(fù)制和修復(fù)先導(dǎo)鏈按dUMP片段連續(xù)復(fù)制后隨鏈按Okazaki片段不連續(xù)復(fù)制

先導(dǎo)鏈（leadingstrand）：DNA復(fù)制時，與復(fù)制叉向前移動的方向一致，以3’→5’鏈為模板，按

5’→3’方向連續(xù)合成的一條鏈

后隨鏈（laggingstrand）：岡崎片段(Okazakifragment):DNA復(fù)制不連續(xù)合成鏈中形成的短DNA片段第8章DNA復(fù)制和修復(fù)3DNA復(fù)制的引發(fā)和終止在細胞提取物中合成岡崎片段時，不僅需要dNTP作為前體，還需要一個與模板DNA堿基順序互補的RNA短片段作為引物。DNA復(fù)制時，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶從RNA引物3’端開始合成新的DNA鏈。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)對于前導(dǎo)鏈，引發(fā)過程很簡單，只要一段引物，DNA聚合酶就能以此為起點一直合成下去。但對于滯后鏈，引發(fā)過程很復(fù)雜，需要多種蛋白質(zhì)和酶的協(xié)同作用，還涉及岡琦片段的形成和連接。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)復(fù)制叉的結(jié)構(gòu)及參與復(fù)制的酶與因子第8章DNA復(fù)制和修復(fù)第8章DNA復(fù)制和修復(fù)對于鏈的終止不需要特定的信號，大腸桿菌的兩個復(fù)制叉進行雙向復(fù)制，會合點就是復(fù)制終止點，一般位于oriC的相對處（大腸桿菌DNA中分離的一個245bp的片段，能支持任何DNA分子在大腸桿菌細胞內(nèi)復(fù)制的最小片段，該245bp的片段稱為oriC）。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)正向重復(fù)序列反向重復(fù)序列第8章DNA復(fù)制和修復(fù)4DNA聚合酶

一旦復(fù)制起始，復(fù)制叉就沿著DNA分子前進，合成與親本鏈互補的兩條新DNA鏈。新生鏈的合成由DNA聚合酶催化完成。從大腸桿菌細胞中分離出了5種DNA聚合酶。DNA聚合酶III是大腸桿菌DNA復(fù)制中鏈延伸反應(yīng)的主要聚合酶。DNA聚合酶I專門用于RNA引物的去處。另外3種DNA聚合酶主要參與DNA修復(fù)和跨損傷合成。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)（1）DNA聚合酶IDNApolI由一條多肽鏈組成，分子量為109KD。酶分子中含有一個Zn2＋，是聚合酶活性必需的。用枯草桿菌蛋白酶可將此酶水解成兩個片段，大片段的分子量為68KD，通常稱為klenow片段，小片段為35KD。大小片段具有不同的酶活性。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)1.easilycleavedintotwofragmentsbyproteinase: a.largefragment(Klenowfragment)containspolymeraseand3’-5’exonuclease(proofreadingdomain).Usedinvitroforsynthesisreactions(DNA

sequencing).E.coliDNApolI(polA)NCKlenowfragment(68kD)exonuclease3’-5’polymerasesitesmallfragment(35kD)C5’-3’activityproofreadingexonucleasecatalytic第8章DNA復(fù)制和修復(fù)（a）DNA聚合酶的5'→3'聚合活性第8章DNA復(fù)制和修復(fù)

這是DNA聚合酶最主要的活性，按模板DNA上的核苷酸順序，將互補的dNTP逐個加到引物RNA3’-OH末端，即促進3'-OH與dNTP的5'-PO4形成磷酸二酯鍵，酶的專一性表現(xiàn)為新進入的dNTP必須與模板DNA堿基配對時才有催化作用，5'→3'聚合活性存在于klenow片段上。DNA聚合酶I的延伸能力不強，每次與模板－引物結(jié)合僅能添加20～100個核苷酸。

第8章DNA復(fù)制和修復(fù)（b）DNA聚合酶的3’→5’外切核酸酶（exonuclease)活性

這種酶活性的主要功能是從3’→5’方向識別并切除DNA生長鏈末端與模板DNA不配對的核苷酸，這種功能稱為校對功能（proofreading），這是保證其聚合作用的正確性不可缺少的，因此對于維持DNA復(fù)制的真實性（replicationalfidelity）至關(guān)重要。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)ProofreadingbyDNApolymerase第8章DNA復(fù)制和修復(fù)第8章DNA復(fù)制和修復(fù)(c)DNA聚合酶的5'→3'外切核酸酶活性

這種酶活性是從DNA鏈的5’端向3’末端水解已配對的核苷酸，本質(zhì)是切斷磷酸二酯鍵，每次能切除10個核苷酸。因此，這種酶活性在DNA損傷的修復(fù)中可能起重要作用，對完成的DNA片段去除5’端的RNA引物也是必須的。在雙鏈DNA的單鏈缺口上，DNApolⅠ的5‘→3’聚合活性和5‘→3’外切酶活性同時發(fā)生，就好像一個5’-P端的核苷酸在移動，缺口在移動。進行中的新鏈聚合置換原來的鏈，這種反應(yīng)叫做缺口平移(nicktranslation)第8章DNA復(fù)制和修復(fù)第8章DNA復(fù)制和修復(fù)(2)DNAPolymeraseIII(DNA聚合酶III）

DNA聚合酶III由10個不同的亞基構(gòu)成。其中α、ε和θ亞基構(gòu)成核心酶。α亞基具有5‘→3’

聚合酶活性，ε亞基具有3‘→5’外切活性，θ亞基功能尚不清楚，可能僅僅起結(jié)構(gòu)上的作用，使兩個核心亞基以及其他各輔助亞基裝備在一起，因此起組裝作用。DNA聚合酶III由兩個亞單位組成，形成不對稱的二聚體。

第8章DNA復(fù)制和修復(fù)(Note:nobetasubunitsareshown;withoutbeta,thisformofthecomplexiscalledDNApolIII*)組成核心聚合酶，形成催化DNA合成的活動中心。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)性質(zhì)聚合酶I聚合酶II聚合酶III3`→5`外切+++5`→3`外切+--新生鏈的合成--+生物學(xué)活性10.0515生物學(xué)功能切除引物修復(fù)DNA修復(fù)DNA復(fù)制大腸桿菌DNA聚合酶I、II、III的性質(zhì)比較第8章DNA復(fù)制和修復(fù)5、DNA連接酶（1967年發(fā)現(xiàn)）：若雙鏈DNA中一條鏈有切口，一端是3’-OH，另一端是5‘-磷酸基，連接酶可催化這兩端形成磷酸二酯鍵，而使切口連接。但是它不能將兩條游離的DNA單鏈連接起來

DNA連接酶在DNA復(fù)制、損傷修復(fù)、重組等過程中起重要作用。3‘5‘3‘5‘OHP第8章DNA復(fù)制和修復(fù)6、復(fù)制忠實性的保證

1、DNApol的3’5’外切酶活性

(exonucleaseactivity)

2、DNApol只能從引物的3’

端延伸DNA

（需要RNA引物）

a、堿基配對協(xié)同性導(dǎo)致最初幾個堿基錯配率高，且不易校正（原因：從模板復(fù)制最初幾個核酸時，堿基堆集力和氫鍵都較弱，易發(fā)生錯配）

b、RNA引物最終被降解而避免錯誤

3、后隨鏈的不連續(xù)合成因其有利于錯配堿基的校正。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)二、真核生物DNA的復(fù)制特點(DNAreplicationinEukaryote)

第8章DNA復(fù)制和修復(fù)

1、復(fù)制概況

a、多個復(fù)制元（multiplereplicon

），雙向復(fù)制

b、復(fù)制元相對較小(13-900kb),

復(fù)制速度較慢,大約

500~5000bp/min

（3000bp/min）

c、復(fù)制終止通過復(fù)制叉的相遇而終止第8章DNA復(fù)制和修復(fù)multiplereplicon

例；果蠅5000replicons平均40Kb（酵母）哺乳動物平均100Kb第8章DNA復(fù)制和修復(fù)

2、真核生物的DNA聚合酶

α、β、δ、ε、γ五種

位置核內(nèi)核內(nèi)核內(nèi)核內(nèi)

線粒體

合成

與引發(fā)修復(fù)合成合成,修復(fù)復(fù)制功能酶結(jié)合前導(dǎo)鏈

后隨鏈3’－5’校NONOYesYesYes正活性

α

β

δ

ε

γ第8章DNA復(fù)制和修復(fù)

真核生物DNA復(fù)制的引發(fā)酶●DNApolα+primase形成緊密的復(fù)合物6-9NtRNAasprimer

●引發(fā)酶（primase）：50-60kd

●作用方式為陣發(fā)性的，每次作用拷貝6～15個核苷酸

●SV40體外DNA復(fù)制情況分析

第8章DNA復(fù)制和修復(fù)

ε

δ第8章DNA復(fù)制和修復(fù)3.真核生物染色體在全部復(fù)制完成之前，各個復(fù)制起始點不能開始新一輪復(fù)制。原核生物中復(fù)制起始點上連續(xù)開始新的復(fù)制事件，表現(xiàn)為一個復(fù)制子內(nèi)套疊有多個復(fù)制叉。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)4.真核生物DNA的復(fù)制起始點被稱為自主復(fù)制序列（ARS），長約為150bp左右，含有幾個復(fù)制起始必需的保守區(qū)。并且復(fù)制起始需起點識別復(fù)合物（ORC）參與，并需要ATP。5.端粒的復(fù)制。線性染色體的末端DNA稱為端粒，端粒的功能主要是穩(wěn)定染色體末端結(jié)構(gòu)，防止染色體之間的末端連接。復(fù)制由一種特殊的酶－－端粒酶所催化。第8章DNA復(fù)制和修復(fù)a、復(fù)制子的大小（Sizesofreplicon）:Yeastorfly 平均40kbMammals 平均100kbProkaryoticDNA: >1000kbb、岡崎片段(Okazakifragments):ProkaryoticDNA: 1000-2000ntEukaryoticDNA: 100-200ntc、復(fù)制速度（Rateofreplication）:EukaryoticDNA: ca.3,000bp/min(50/sec)ProkaryoticDNA: 50,000bp/min(900/sec)原核生物和真核生物DNA復(fù)制的比較第8章DNA復(fù)制和修復(fù)1.Semi-conservativereplication2.Semi-discontinuousrepliction3.DNAhelicase,Ssb4.RNApriming5.校正閱讀（Proofreading）1.復(fù)制起點（單、多）2.復(fù)制子（大小、多少）3.復(fù)制起始的許可因子的控制（復(fù)制周期的重疊與否）4.復(fù)制叉移動的速度(900/50nt/S)5.岡崎片段的大小6.端粒和端粒酶7.DNA聚合酶Polymerases相同點：不同點：第8章