高通量篩選技術(shù)

高通量篩選技術(shù)

高通量篩選最初是伴隨組合化學(xué)而產(chǎn)生的一種藥物篩選方式。

1990年末，組合化學(xué)的出現(xiàn)改變了人類獲取新化合物的方式，人們可以通過(guò)較少的步驟、在短時(shí)間內(nèi)同時(shí)合成大量化合物，在這樣的背景下高通量篩選的技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。

高通量篩選技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量候選化合物完成篩選，經(jīng)過(guò)近十年的發(fā)展，已經(jīng)成為比較成熟的技術(shù)，不僅僅應(yīng)用于對(duì)組合化學(xué)庫(kù)的化合物篩選，還更多地應(yīng)用于對(duì)現(xiàn)有化合物庫(kù)的篩選。

目前世界各大藥物生產(chǎn)商都建立有自己的化合物庫(kù)和高通量篩選機(jī)構(gòu)，對(duì)有潛力形成藥物的化合物進(jìn)行篦梳式的篩選。第2頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天我國(guó)藥物高通量篩選起步較晚，且不規(guī)范，僅有十多年的研究歷史。

1996年中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院引進(jìn)國(guó)內(nèi)第一臺(tái)Bionek2000型實(shí)驗(yàn)自動(dòng)化工作站；

1998年又引進(jìn)全國(guó)第一臺(tái)Topcount微量閃爍計(jì)數(shù)器，使放射配基實(shí)驗(yàn)、放射免疫實(shí)驗(yàn)等技術(shù)微量化、自動(dòng)化。上海藥物研究所、北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院分別成立了藥物篩選專門機(jī)構(gòu)，開(kāi)始從事大規(guī)模篩選工作。西安交通大學(xué)藥學(xué)院賀浪沖教授首創(chuàng)的細(xì)胞膜色譜（CMC）為化合物的體外高通量篩選提供了高選擇性、高特異性、高效率的篩選手段。CMC已成功用于鈣離子拮抗劑受體配體結(jié)合反應(yīng)的研究，目前正在進(jìn)行心血管化學(xué)合成藥物的高通量篩選和中藥有效部位及有效成分的尋找。今年將建立CMC自動(dòng)化篩選體系，促進(jìn)我國(guó)藥物高通量篩選技術(shù)的全面發(fā)展。第3頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天概念高通量篩選(Highthroughputscreening，HTS)技術(shù)是指以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)，以微板形式作為實(shí)驗(yàn)工具載體，以自動(dòng)化操作系統(tǒng)執(zhí)行試驗(yàn)過(guò)程，以靈敏快速的檢測(cè)儀器采集實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)，以計(jì)算機(jī)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，同一時(shí)間對(duì)數(shù)以千萬(wàn)樣品檢測(cè)，并以相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)支持整體運(yùn)轉(zhuǎn)的技術(shù)體系。第4頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天高通量細(xì)胞篩選技術(shù)(high-throughputcell-basedscreeningtechnology)是以高通量方式研究基因功能最有效的方法之一。通常,基因功能的初步篩選在96孔或384孔板上進(jìn)行,通過(guò)基因轉(zhuǎn)染將候選基因?qū)爰?xì)胞,或直接將基因表達(dá)產(chǎn)物加入細(xì)胞培養(yǎng)液中。

是20世紀(jì)80年代后期發(fā)展起來(lái)的一種篩選新技術(shù)。它集計(jì)算機(jī)控制、自動(dòng)化操作、高靈敏度檢測(cè)、數(shù)據(jù)結(jié)果自動(dòng)采集和處理于一體，實(shí)現(xiàn)了篩選的快速、微量、靈敏和大規(guī)律，日篩選量達(dá)到數(shù)萬(wàn)甚至數(shù)十萬(wàn)樣品次，是篩選技術(shù)和方法的一大進(jìn)步。

第5頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天篩選測(cè)定方法基于要研究的生物學(xué)或醫(yī)學(xué)問(wèn)題,例如,要研究抗血管生成活性,選用內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、遷移和粘附等分析測(cè)定;研究免疫調(diào)節(jié)活性,可選擇淋巴細(xì)胞或造血細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的分析測(cè)定;研究神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子活性,可選用神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞存活、突起生長(zhǎng)測(cè)定。除上述與細(xì)胞表型或形態(tài)學(xué)相關(guān)的檢測(cè)指標(biāo)外,細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、糖代謝、能量產(chǎn)生和代謝產(chǎn)物分析(metaboliccontrolanalysis)等代謝通路也是基因功能重要的研究?jī)?nèi)容。

第6頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天結(jié)合抗體芯片技術(shù)、多路測(cè)定技術(shù)(multiplexing)等新的檢測(cè)方法,高通量細(xì)胞篩選的應(yīng)用更為廣泛。另外,隨著熒光成像讀板儀(fluorescenceimageplatereader,FLIPR)、定量PCR、高通量熒光激活細(xì)胞分類器(HT-FACS)等檢測(cè)方法和技術(shù)的不斷發(fā)展和應(yīng)用,靈敏度和重現(xiàn)性這兩個(gè)高通量細(xì)胞篩選的關(guān)鍵問(wèn)題也逐步得以解決。第7頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、高通量篩選常用儀器設(shè)備Whatman過(guò)濾型做孔板是種多孔形狀物體，便于快速和批量處理樣品。板上刻有號(hào)碼適合于各種微孔板配用儀器和白動(dòng)控制裝置。

第8頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天Boekel微孔板振蕩器的特點(diǎn)

獨(dú)立設(shè)定溫度，振蕩速度和混合時(shí)間；

混勻器可以編程設(shè)定運(yùn)行一定時(shí)間或者瞬時(shí)混合3秒；

內(nèi)置的蓋可以減少污染，樣品揮發(fā)或者噪音的危險(xiǎn)。

第9頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天多通道移液器第10頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天連續(xù)移液器一次性吸取大量液體，然后每次按動(dòng)按鈕，僅僅釋放小量等體積的液體。大量液體進(jìn)行等體積分裝第11頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天215全自動(dòng)移液工作站

1.大容量，可自動(dòng)處理12個(gè)96孔反應(yīng)板或480個(gè)試管的樣品。

2.特別適合于HPLC或LC/MS的樣品處理。

3.使用709軟件，有易用的圖示管架編輯器。

4.無(wú)論開(kāi)口試管或密封試管都有很高精確度。5.Micro215進(jìn)樣量可低至0.5ul。

6.多通道215自動(dòng)樣品處理系統(tǒng)可同時(shí)處理8個(gè)樣品。第12頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天多功能酶標(biāo)儀（多功能微孔板檢測(cè)儀）微孔板檢測(cè)設(shè)備之一，集成4大功能模塊，可進(jìn)行放射性/非放射性檢測(cè)。

第13頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天流式細(xì)胞儀C6流式細(xì)胞儀系統(tǒng)是一種全功能、雙激光、六探測(cè)器的流式細(xì)胞儀分析系統(tǒng)，C6流式細(xì)胞儀系統(tǒng)的探測(cè)器不但可靈敏的捕獲前散射光和旁散射光，還有四個(gè)可調(diào)光學(xué)濾光片的熒光探測(cè)器。CFlow操作軟件使搜集數(shù)據(jù)和分析變的簡(jiǎn)單快速。高集成度、高度自動(dòng)化的主機(jī)，以及優(yōu)良人機(jī)界面、操作簡(jiǎn)便的CFlow軟件系統(tǒng)

第14頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天高通量平行合成儀第15頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天高通量平行合成儀第16頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天液相芯片檢測(cè)儀第17頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天微孔過(guò)濾板第18頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天12通道藥物篩選儀第19頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天國(guó)家新藥篩選中心第20頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天條形碼技術(shù)

條形碼(barcode)是將寬度不等的多個(gè)黑條和空白，按照一定的編碼規(guī)則排列，用以表達(dá)一組信息的圖形標(biāo)識(shí)符。常見(jiàn)的條形碼是由反射率相差很大的黑條（簡(jiǎn)稱條）和白條（簡(jiǎn)稱空）排成的平行線圖案。條形碼可以標(biāo)出物品的生產(chǎn)國(guó)、制造廠家、商品名稱、生產(chǎn)日期、圖書分類號(hào)、郵件起止地點(diǎn)、類別、日期等許多信息，因而在商品流通、圖書管理、郵政管理、銀行系統(tǒng)等許多領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用。第21頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)SAS（StatisticalAnalysisSystem，統(tǒng)計(jì)分析系統(tǒng)）是當(dāng)今國(guó)際最著名的數(shù)據(jù)分析軟件系統(tǒng)。SAS：數(shù)據(jù)的輸入輸出和整理、描述性統(tǒng)計(jì)、假設(shè)檢驗(yàn)、圖形的制作、回歸分析、多元統(tǒng)計(jì)分析、方差分析、協(xié)方差分析和時(shí)間序列分析等。數(shù)據(jù)訪問(wèn)，數(shù)據(jù)管理，數(shù)據(jù)呈現(xiàn)，數(shù)據(jù)分析SPSSEXCEL第22頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、高通量篩選技術(shù)常用方法微孔板的使用和光學(xué)檢測(cè)法工程菌株的裂解報(bào)告基因流式細(xì)胞技術(shù)蛋白質(zhì)芯片第23頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天微孔板的使用和光學(xué)檢測(cè)法化學(xué)發(fā)光指化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中發(fā)射出來(lái)的光，又稱冷光；生物發(fā)光是化學(xué)發(fā)光的一種，專指由酶催化的化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中發(fā)射出的光?；瘜W(xué)和生物發(fā)光經(jīng)常被用于測(cè)定樣品中未知成分的量，并且在過(guò)去的十年里在基因表達(dá)和基因調(diào)控的研究中發(fā)揮著非常重要的作用。第24頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天通過(guò)發(fā)射光的比率可以推出未知成分的濃度，因此測(cè)定化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中的發(fā)射光是非常有用的。反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的光與發(fā)射光的量產(chǎn)率是直接相關(guān)的，相應(yīng)的，與發(fā)光物質(zhì)的濃度成比例。因此，反應(yīng)過(guò)程中的光可以相對(duì)反映出目標(biāo)樣品中發(fā)光物質(zhì)的量。第25頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天化學(xué)發(fā)光儀使用范圍·ATP（三磷酸腺甙）檢驗(yàn)、熒光素酶檢驗(yàn)·免疫及proteomics·核酸，DNA及基因組·病毒研究（比如：SARS、禽流感病毒研究）·臨床診斷研究·染色體分析·毒性試驗(yàn)·細(xì)胞活力試驗(yàn)·餐館衛(wèi)生檢測(cè)·環(huán)境檢測(cè)·工業(yè)、農(nóng)林業(yè)、畜牧業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)等其它用途最廣泛的用途是對(duì)利用報(bào)告基因檢測(cè)目標(biāo)基因的表達(dá)以及檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP水平。第26頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

分子生物學(xué)家和細(xì)胞生物學(xué)家利用報(bào)告基因研究基因的表達(dá)和調(diào)控。將報(bào)告基因引入細(xì)胞DNA使之與某一特定分子事件相關(guān)，可以為這一分子事件帶來(lái)可測(cè)性。通常檢測(cè)的分子事件是基因功能，具有可測(cè)性的是發(fā)光。目前，市場(chǎng)上有許多發(fā)光報(bào)告基因出售。包括：螢火蟲(chóng)熒光素酶（fireflyluciferase），β－半乳糖苷酶（B-galactosidase），β－葡萄糖苷酸酶（B-glucuronidase，GUS），堿性磷酸酶（alkalinephosphatase），和人生長(zhǎng)激素（humangrowthhormone，hGH）。高靈敏度，低成本，快速以及使用簡(jiǎn)單使得發(fā)光檢測(cè)儀成為理想的基因表達(dá)研究工具。

第27頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天ATP水平測(cè)定

所有活細(xì)胞都含有ATP。ATP可以從細(xì)胞中提取出來(lái)，用螢火蟲(chóng)熒光素酶檢測(cè)。在這個(gè)發(fā)光反應(yīng)中，ATP是限制性反應(yīng)物。因此，到達(dá)發(fā)光檢測(cè)儀光電倍增管的光與樣品中ATP的含量成比例，相應(yīng)的與提取ATP所用的細(xì)胞數(shù)成比例。ATP發(fā)光檢測(cè)方法已經(jīng)使用了幾十年。第28頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天微生物污染檢測(cè)ATP的發(fā)光檢測(cè)方法可以檢測(cè)樣品中的所有微生物，因而被用于檢測(cè)水中的大腸桿菌含量，包括飲用水和用于oilfieldinjection，coolingsystem以及紙加工過(guò)程的工業(yè)用水。ATP的發(fā)光檢測(cè)方法還可以用于藥品，化妝品，牛奶以及其它食品的微生物控制。第29頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、高通量篩選的技術(shù)過(guò)程1、樣品庫(kù)2、初篩和復(fù)篩3、活性化合物4、深入篩選5、獲得少量先導(dǎo)化合物6、確證篩選藥物藥理學(xué)研究7、侯選藥物8、臨床前研究第30頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天HTS篩選的基本步驟第一步是選擇分子靶。選擇的依據(jù)是來(lái)源于國(guó)際醫(yī)學(xué)生物學(xué)的新成果。目前國(guó)際常用的分子靶有以下幾類：A、細(xì)胞膜受體；B、離子通道蛋白；C、酶蛋白；D、細(xì)胞核受體；E、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。第二步是建立穩(wěn)定表達(dá)分子靶的生物體系。靶是蛋白---克隆相對(duì)應(yīng)的蛋白，在大腸桿菌中表達(dá)和提純；靶是細(xì)胞受體---克隆出的基因轉(zhuǎn)化到載體細(xì)胞中，建立穩(wěn)定的細(xì)胞株。第31頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天第三步建立簡(jiǎn)便快速的大規(guī)模的生物檢測(cè)方法。根據(jù)靶的不同分為兩類：

1、以蛋白等分子為基礎(chǔ)；

2、以細(xì)胞為基礎(chǔ)酶蛋白---測(cè)定酶活性的變化；細(xì)胞膜受體---測(cè)定配體-受體的結(jié)合；細(xì)胞核受體---測(cè)定蛋白的表達(dá)。在建立大規(guī)模生物檢測(cè)方法的同時(shí)，要用組合化合物的方法合成大量不同結(jié)構(gòu)的化合物庫(kù)相配套。第32頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天HTS藥物篩選靶點(diǎn)與檢測(cè)方法（1）、分子靶點(diǎn)篩選模型---細(xì)胞信號(hào)通路篩選系統(tǒng)外界信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f到細(xì)胞內(nèi)，或者直接穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，最終影響某些基因的轉(zhuǎn)錄。在這個(gè)傳遞過(guò)程中，某些特殊的細(xì)胞或一些病理狀況下，可能是其中的一條或幾條通路起作用，藥物可以根據(jù)需要對(duì)這些通路進(jìn)行阻斷。使用信號(hào)通路篩選系統(tǒng)，可直接對(duì)藥物作用的分子機(jī)制有所了解。第33頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）、細(xì)胞膜表面受體篩選模型

a.G蛋白耦聯(lián)受體：受體與GTP結(jié)合的調(diào)節(jié)蛋白的耦聯(lián)，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生cAMP，從而將外界信號(hào)跨膜傳遞到細(xì)胞內(nèi)。如趨化因子受體、β-受體阻斷劑等。

b.催化受體：為單跨膜受體，分為胞外區(qū)，跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。當(dāng)細(xì)胞因子與胞外區(qū)結(jié)合后，引起多個(gè)受體單體的聚合，每個(gè)聚合體的受體單體可以是同一類型，也可以不同。如EPO、G-CSF、GH受體2個(gè)同樣的單體；IL-1，GM-CSF，IL-6受體是2個(gè)不同的單體；TNF-α是3個(gè)同樣的單體；IL-2是3個(gè)不同的受體。

c.離子通道耦聯(lián)受體：細(xì)胞表面一些神經(jīng)遞質(zhì)的受體，自身是一些離子通道，或者與離子通道相耦聯(lián)。當(dāng)與配體結(jié)合時(shí)，受體構(gòu)象改變，通道開(kāi)放，離子進(jìn)出細(xì)胞，引起電興奮。第34頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天作業(yè)第四章微生物雜交育種

1、放線菌雜交方法有哪些？簡(jiǎn)述每種方法的具體過(guò)程？第五章基因工程育種

1、簡(jiǎn)述基因體外定位誘變的方法。

第六章高通量篩選技術(shù)

1、簡(jiǎn)述表面展示技術(shù)的方法。

2、什么是報(bào)告基因？作為報(bào)告基因，在遺傳選擇和篩選檢測(cè)方面應(yīng)具備哪些條件？常見(jiàn)報(bào)告基因有哪些？第35頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天本課程考核方式寫一篇與微生物遺傳育種相關(guān)的綜述。字?jǐn)?shù)不低于4000字。期末成績(jī)=平時(shí)20%+實(shí)驗(yàn)20%+論文60%第36頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天評(píng)分辦法

課程論文占60%，其評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：1）選題新穎（熱點(diǎn)問(wèn)題的研究、空白問(wèn)題的探索、老問(wèn)題的新視野）（10分）2）結(jié)構(gòu)合理、行文流暢、邏輯嚴(yán)謹(jǐn)、學(xué)術(shù)語(yǔ)言規(guī)范（20分）3）觀點(diǎn)鮮明、資料翔實(shí)、立論深刻、有所創(chuàng)新（30分）4）注釋與參考文獻(xiàn)（文獻(xiàn)數(shù)量、種類、外文文獻(xiàn)）（10分）5）規(guī)范程度：題目、內(nèi)容提要、關(guān)鍵詞、正文、注釋、參考文獻(xiàn)（20分）6）總結(jié)全文的主要論點(diǎn)和發(fā)展方向，指出目前研究中尚需解決的問(wèn)題及研究成果的意義和價(jià)值。（10分）7）字?jǐn)?shù)不少于4000字，每少100字扣1分。第37頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天論文格式要求1、題名（黑體，小三，居中）2、姓名、班級(jí)、學(xué)號(hào)（仿宋、小四、居中）3、摘要：對(duì)全文進(jìn)行概括，提出研究目的與意義，論文主要內(nèi)容，150字左右（五號(hào)，楷體，首行縮進(jìn)2字符，行距固定值20磅?！罢倍旨哟郑?、關(guān)鍵詞：3~8個(gè)（五號(hào)，楷體，首行縮進(jìn)2字符，各關(guān)鍵詞之間加分號(hào)；最后一詞之后不加標(biāo)點(diǎn)符號(hào)?！瓣P(guān)鍵詞”三字加粗）第38頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月