重組技術(shù)應(yīng)用

重組技術(shù)應(yīng)用序列檢測

病原菌感染檢測傳統(tǒng)方法：免疫反應(yīng)斑點(diǎn)雜交與反轉(zhuǎn)斑點(diǎn)雜交

引物標(biāo)記多重PCR擴(kuò)增病原菌群引物設(shè)計(jì)：獨(dú)有的穩(wěn)定區(qū)1.診斷工具

——序列檢測第2頁,共31頁，2024年2月25日，星期天1.診斷工具

——比較序列分析比較序列分析：單核苷酸多態(tài)性（SNP）

SNP：主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。是人類可遺傳的變異中最常見的一種。占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個(gè)堿基對(duì)中就有1個(gè)，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)300萬個(gè)甚至更多。

SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個(gè)堿基的變異，這種變異可由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換(transition)或顛換(transversion)所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。但通常所說的SNP并不包括后兩種情況。

第3頁,共31頁，2024年2月25日，星期天基因的純合或雜合第4頁,共31頁，2024年2月25日，星期天利用SNP進(jìn)行已知遺傳疾病的診斷利用SNP分析未知遺傳疾病的原因建立人類SNP庫，利用SNP芯片進(jìn)行個(gè)性化診斷老年癡呆病對(duì)藥物tacrine的反應(yīng)

80％無ApoE4等位基因患者，有療效

60％有ApoE4等位基因患者，惡化第5頁,共31頁，2024年2月25日，星期天×MstⅡ酶切位點(diǎn)(GCTNAGG)5′3′正常基因5′3′突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析第6頁,共31頁，2024年2月25日，星期天+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析第7頁,共31頁，2024年2月25日，星期天1.診斷工具

——限制性片段長度多態(tài)性（RFLP)RFLP是根據(jù)不同個(gè)體基因組的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)堿基發(fā)生突變，或酶切位點(diǎn)之間發(fā)生了堿基的插入、缺失，導(dǎo)致酶切片段大小發(fā)生了變化，這種變化可以通過特定探針雜交進(jìn)行檢測，從而可比較不同個(gè)體的DNA水平的差異（即多態(tài)性）NPANPA已出生的生病孩子PAPA未出生的孩子？為患病小孩的父母提供未來的產(chǎn)前診斷第8頁,共31頁，2024年2月25日，星期天由某些序列重復(fù)程度的不同引起的長度多態(tài)性變化主要與衛(wèi)星DNA序列有關(guān)可以設(shè)計(jì)多位點(diǎn)探針，分析DNA圖譜進(jìn)行鑒定1.診斷工具——可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性（VNTR)1985年，AlecJeffrey發(fā)現(xiàn)非編碼區(qū)的小衛(wèi)星DNA串聯(lián)重復(fù)序列可用于確定個(gè)體的特異性，他開發(fā)了一個(gè)能和多個(gè)小衛(wèi)星序列位點(diǎn)互補(bǔ)探針，檢測結(jié)果類似條形碼，被稱為DNA指紋

改進(jìn)：多個(gè)單位點(diǎn)探針檢測（樣本量更少、有利于DNA指紋數(shù)據(jù)庫的建立、統(tǒng)計(jì)學(xué)上更為簡單）第9頁,共31頁，2024年2月25日，星期天多位點(diǎn)探針與單位點(diǎn)探針VNTR在司法上的應(yīng)用第10頁,共31頁，2024年2月25日，星期天2.新藥物的生物法生產(chǎn)

一般蛋白質(zhì)產(chǎn)品必須具有絕對(duì)的真實(shí)性時(shí)（即生物加工的蛋白質(zhì)產(chǎn)品和天然提取的產(chǎn)品完全一樣），選擇哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。真實(shí)性意味著不僅所有的氨基酸要有正確的排列順序，而且在培養(yǎng)細(xì)胞中的所有翻譯后修飾過程要和在完整的動(dòng)物體中的翻譯后修飾過程相同。哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)：提供盡可能類似于天然產(chǎn)物的產(chǎn)品，真實(shí)性最好另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是大多數(shù)具有商業(yè)價(jià)值的蛋白質(zhì)都很容易被細(xì)胞分泌出來細(xì)胞培養(yǎng)生長緩慢，培養(yǎng)基昂貴，蛋白質(zhì)表達(dá)水平較低安全性問題：轉(zhuǎn)化細(xì)胞的致癌可能性、病毒轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)2009年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)首個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥物ATryn上市第11頁,共31頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)基因植物和植物細(xì)胞培養(yǎng)成本優(yōu)勢不存在內(nèi)源病毒或朊病毒的安全問題生產(chǎn)的放大很容易通過擴(kuò)大種植面積來實(shí)現(xiàn)選定在植物中無菌的可食用部分生產(chǎn)蛋白質(zhì)，這樣不僅可以避免苛刻的純化過程，還可以直接將食用部分作為治療蛋白質(zhì)口服通常表達(dá)水平非常低（<總可溶性蛋白的1％）N-連接糖基化是不完全的，以及缺乏一些其它哺乳動(dòng)物的翻譯后過程。需要花費(fèi)大量時(shí)間來測試和生產(chǎn)足夠的種子，研制生產(chǎn)周期不能令人滿意很難對(duì)生長在地里的農(nóng)作物進(jìn)行環(huán)境控制，因此隨著生產(chǎn)時(shí)間和生產(chǎn)地點(diǎn)的不同（即環(huán)境），產(chǎn)品的生產(chǎn)量（也可能包括質(zhì)量）變化非常大。第12頁,共31頁，2024年2月25日，星期天3.基因治療對(duì)患者細(xì)胞中的遺傳信息進(jìn)行修飾來治療疾病的方法第13頁,共31頁，2024年2月25日，星期天第14頁,共31頁，2024年2月25日，星期天第15頁,共31頁，2024年2月25日，星期天

美國醫(yī)學(xué)家W·F·安德森等人對(duì)腺苷脫氨酶缺乏癥（ADA缺乏癥）的基因治療，是世界上第一個(gè)基因治療成功的范例。1990年9月14日，安德森對(duì)一例患ADA缺乏癥的4歲女孩Desilva，A進(jìn)行基因治療。這個(gè)4歲女孩由于遺傳基因有缺陷，自身不能生產(chǎn)ADA，先天性免疫功能不全，只能生活在無菌的隔離帳里。他們將含有這個(gè)女孩自己的白血球的溶液輸入她左臂的一條靜脈血管中，這種白血球都已經(jīng)過改造，有缺陷的基因已經(jīng)被健康的基因所替代。在以后的10個(gè)月內(nèi)她又接受了7次這樣的治療，同時(shí)也接受酶治療。經(jīng)治療后，免疫功能日趨健全，能夠走出隔離帳，過上了正常人的生活。

Desilva，A

，1999第16頁,共31頁，2024年2月25日，星期天4.重組疫苗失活毒株或活體減毒毒株（有一定危險(xiǎn)性）重組亞單位疫苗（保真度差、無法有效刺激免疫反應(yīng)）重組細(xì)菌疫苗（接種細(xì)菌）

以減毒細(xì)菌為宿主表達(dá)異源抗原，能夠有效刺激免疫反應(yīng)重組病毒疫苗（接種病毒）

以病毒為載體表達(dá)異源抗原，或破壞毒素基因植物可食用疫苗（通過轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)病毒或病菌抗原）DNA疫苗（在宿主中引入編碼抗原的DNA分子）第17頁,共31頁，2024年2月25日，星期天鑒定毒性基因的技術(shù)啟動(dòng)子誘捕庫體內(nèi)展示技術(shù)（IVET）差異熒光誘導(dǎo)技術(shù)第18頁,共31頁，2024年2月25日，星期天5.蛋白質(zhì)工程通過各種方法使蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變蛋白質(zhì)的某些特性和功能的技術(shù)過程稱為蛋白質(zhì)工程提高活力activity增強(qiáng)穩(wěn)定性stability降低或消除抗原性immunologicalproperty研究和了解分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對(duì)酶分子空間構(gòu)象的影響第19頁,共31頁，2024年2月25日，星期天氨基酸或核苷酸的置換修飾可以采用化學(xué)修飾方法，例如，Bender等成功地利用化學(xué)修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的絲氨酸轉(zhuǎn)換為半胱氨酸，修飾后，該酶失去對(duì)蛋白質(zhì)和多肽的水解能力，卻出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化學(xué)修飾法難度大，成本高，專一性差，而且要對(duì)酶分子逐個(gè)進(jìn)行修飾，操作復(fù)雜，難以工業(yè)化生產(chǎn)。

現(xiàn)在常用的氨基酸置換修飾的方法是定點(diǎn)突變技術(shù)。定點(diǎn)突變（sitedirectedmutagenesis）是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種基因操作技術(shù)。是指在DNA序列中的某一特定位點(diǎn)上進(jìn)行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術(shù)。是蛋白質(zhì)工程（ProteinEngineering）和酶分子組成單位置換修飾中常用的技術(shù)。定點(diǎn)突變技術(shù)，為氨基酸或核苷酸的置換修飾提供了先進(jìn)、可靠、行之有效的手段。氨基酸置換修飾第20頁,共31頁，2024年2月25日，星期天酶分子的定點(diǎn)突變1、基因序列分析2、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析3、酶活性中心分析4、引物設(shè)計(jì)進(jìn)行基因定點(diǎn)突變5、酶基因克隆表達(dá)6、變異特性分析第21頁,共31頁，2024年2月25日，星期天酶修飾后的性質(zhì)變化熱穩(wěn)定性：一般來說，熱穩(wěn)定性有較大的提高。抗原性：比較公認(rèn)的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比較明顯。各類失活因子的抵抗力：修飾酶對(duì)蛋白酶、抑制劑均有一定的抵抗能力，從而提高其穩(wěn)定性。半衰期：一般在體內(nèi)的半衰期得到有效延長。由于酶分子經(jīng)修飾后，增強(qiáng)對(duì)熱、蛋白酶、抑制劑等的穩(wěn)定性，從而延長了在體內(nèi)的半衰期。最適pH：大部分酶經(jīng)化學(xué)修飾后，酶的最適pH發(fā)生了變化，這種變化在應(yīng)用研究上有時(shí)具有重要意義。修飾酶最適pH更接近于生理環(huán)境，在臨床應(yīng)用上有較大意義。Km的變化：大多數(shù)酶經(jīng)修飾后，Vm沒有明顯變化，但有些酶經(jīng)修飾后，Km值變大。第22頁,共31頁，2024年2月25日，星期天定向進(jìn)化蛋白質(zhì)的合理設(shè)計(jì)(rationaldesign)

氨基酸序列比對(duì)、蛋白質(zhì)三維構(gòu)象、殘基功能分析

蛋白質(zhì)的定向進(jìn)化(directedevolution)第23頁,共31頁，2024年2月25日，星期天體外定向進(jìn)化的意義理論上，蛋白質(zhì)分子蘊(yùn)藏著很大的進(jìn)化潛力，很多功能有待于開發(fā)，這是體外定向進(jìn)化的基本先決條件。所謂酶的體外定向進(jìn)化，又稱實(shí)驗(yàn)分子進(jìn)化，屬于蛋白質(zhì)的非合理設(shè)計(jì)，它不需事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制，通過人為地創(chuàng)造特殊的條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制(隨機(jī)突變、重組和自然選擇)，在體外改造酶基因，并定向選擇出所需性質(zhì)的突變酶。酶的體外定向進(jìn)化技術(shù)極大地拓展了蛋白質(zhì)工程學(xué)的研究和應(yīng)用范圍，特別是能夠解決合理設(shè)計(jì)所不能解決的問題，為酶的結(jié)構(gòu)與功能研究開辟了嶄新的途徑，并且正在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域逐漸顯示其生命力。第24頁,共31頁，2024年2月25日，星期天定向進(jìn)化的原理第25頁,共31頁，2024年2月25日，星期天DNAShufflingStemmer在1994年首先提出的一種體外分子定向進(jìn)化方法同傳統(tǒng)的分子進(jìn)化方法相比，DNAShuffling可以更快地加速分子進(jìn)化的進(jìn)程、取得更好的進(jìn)化效果通過定向進(jìn)化方法改進(jìn)酶的特性、甚至創(chuàng)造出新酶成為對(duì)代謝途徑進(jìn)行改造的一種非常有用的策略。第26頁,共31頁，2024年2月25日，星期天提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量

實(shí)例:Arnold等人通過定向進(jìn)化改變了乙內(nèi)酰脲酶對(duì)底物的對(duì)映體選擇性（從D型變?yōu)長型），并使酶活力提高了5倍，這種進(jìn)化后的酶和另外三種Met合成途徑中的酶一起表達(dá)后大幅度提高了L-Met的合成速度。提高酶蛋白在各種極端物理或化學(xué)環(huán)境下的活力和穩(wěn)定性，對(duì)不同來源的蛋白質(zhì)的優(yōu)良性狀進(jìn)行組合

實(shí)例:Ness等人通過對(duì)26種枯草桿菌蛋白酶基因的Shuffling

而在酶活力、熱穩(wěn)定性、溶劑穩(wěn)定性等方面的特性取得了較大的進(jìn)展實(shí)例:兩種

-glycosidase基因的DNAShuffling定向進(jìn)化的應(yīng)用

—優(yōu)化代謝途徑第27頁,共31頁，2024年2月25日，星期天extremestabilityglucoseinhibitionlactosehydrolysislowerstabilitynoinhibitionlactosehydrolysisCelBPyrococcus(100oC)LacSSulfolobus(85oC)Geneshufflingoftwob-glycosidasesCelB-LacShybridSB20approachesCelBstabilitylesssubstrateinhibitionhighlactosehydrolysisGeneshuffling★★★★★★第28頁,共31頁，2024年2月25日，星期天Hybrids-i