酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊笳莆誆LISA的基本原理掌握ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)HBsAg的原理、操作方法及結(jié)果判斷熟悉表面抗原檢測(cè)的臨床意義第2頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天（一）ELISA的原理ELISA的基本原理三種必要的試劑：①固相的抗原或抗體，即“免疫吸附劑”（immunosorbent）②酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為"結(jié)合物"（conjugate）③酶作用的底物第3頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。第4頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。

第5頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）方法類型及反應(yīng)原理雙抗體夾心法間接法競(jìng)爭(zhēng)法捕獲法第6頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天1雙抗體夾心法

——是檢測(cè)抗原最常用的方法第7頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天第8頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天操作步驟1）將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體，洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。2）加受檢標(biāo)本，保溫反應(yīng)。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物，洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。3）加酶標(biāo)抗體，保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體，此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)。4）加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。第9頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天應(yīng)用此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。

第10頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天2間接法

——是檢測(cè)抗體常用的方法

第11頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天第12頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天基本步驟1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。2）加稀釋的受檢血清，保溫反應(yīng)。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去。3）加酶標(biāo)抗抗體。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體抗體結(jié)合，從而間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量正相關(guān)。4）加底物顯色。第13頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天應(yīng)用檢測(cè)Ab的最常用的方法只要更換不同的固相Ag，可以用一種酶標(biāo)二抗檢測(cè)各種與Ag相應(yīng)的Ab。第14頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天3競(jìng)爭(zhēng)法第15頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，因此陽(yáng)性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。方法相同第16頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天ELISA的基本步驟包被—洗滌—封閉—洗滌—加樣—加酶結(jié)合物—加底物、顯色劑—終止液—酶標(biāo)儀檢測(cè)第17頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天包被將抗原或抗體固定化的過程稱為包被(coating)。換言之，包被即是抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面的過程?？贵w和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時(shí)被認(rèn)為具有同等的包被效果。第18頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天固相載體固相載體在ELISA測(cè)定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)?？勺鱁LISA中載體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。

ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板最為常用，專用于EILSA的產(chǎn)品稱為ELISA板，國(guó)際上標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板為8×12的96孔式。第19頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天固相載體

微顆粒帶有蛋白質(zhì)結(jié)合功能基團(tuán)，結(jié)合容量大、反應(yīng)速度快膜載體硝酸纖維素膜（NC）、玻璃纖維素膜、尼龍膜，非共價(jià)鍵結(jié)合，但吸附能力強(qiáng)斑點(diǎn)ELISA第20頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天洗滌洗滌在ELISA過程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELSIA就是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)。可以說在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌，不得馬虎。

第21頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天封閉●

包被好的固相載體表面常留有少量未吸附位點(diǎn)，可非特異地吸附測(cè)定時(shí)加入的標(biāo)本和酶標(biāo)記物中的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致本底偏高。因此需用1％～5％牛血清白蛋白或5％～20％小牛血清等包被一次，消除上述干擾，此過程稱為封閉。

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一般說來(lái)，雙抗體夾心法，只要酶標(biāo)記物是高活性的，操作時(shí)洗滌徹底，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果。

第22頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天加樣

在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。

加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。第23頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天加酶結(jié)合物結(jié)合物即酶標(biāo)記的抗體（或抗原），是ELISA中最關(guān)鍵的試劑。

ELISA的酶應(yīng)符合以下要求：純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來(lái)源豐富，價(jià)格不貴，制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保留它的活性部分和催化能力。最好在受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。另外，它的相應(yīng)底物易于制備和保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測(cè)定等。

第24頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天常用的酶和底物1、辣根過氧化物酶（horsradishperoxidase,HRP）糖蛋白主酶+亞鐵血紅素輔基（活性基團(tuán)）純度：RZ=OD403/OD275,>3.1酶活性：U：1min將1μmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。反應(yīng)式：DH2+H2O2D+2H2O底物：OPD,TMB,5-ASA,ABTS第25頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶作用后顯色終止液終止反應(yīng)顯色最大吸收峰致癌避光OPD橙黃色H2SO4棕黃色492nm有需要TMB藍(lán)色H2SO4黃色450nm無(wú)無(wú)需OPD和TMB的比較第26頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天底物顯色終止液最大吸收峰特點(diǎn)APp-NPP黃色NaOH405nmβ-Gal4MUG熒光物4MU//均相酶免疫測(cè)定2、堿性磷酸酶和β半乳糖苷酶的比較第27頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天顯色顯色是ELISA中的最后一步溫育反應(yīng)，此時(shí)酶催化無(wú)色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無(wú)色，而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。在定量測(cè)定中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。定性測(cè)定的顯色可在室溫進(jìn)行，時(shí)間一般不需要嚴(yán)格控制，有時(shí)可根據(jù)陽(yáng)性對(duì)照孔和陰性對(duì)照孔的顯色情況適當(dāng)縮短或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，及時(shí)判斷。

第28頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶反應(yīng)終止液常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。

第29頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天比色比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。酶標(biāo)比色儀檢測(cè)酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱酶標(biāo)儀，通常指專用于測(cè)讀ELISA結(jié)果吸光度的光度計(jì)。第30頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天結(jié)果判斷定性測(cè)定對(duì)受檢標(biāo)本中是否含有待測(cè)抗原或抗體作出“有”或“無(wú)”的簡(jiǎn)單回答，分別用“陽(yáng)性”、“陰性”表示定量測(cè)定

在定量測(cè)定中，每批測(cè)試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品中待測(cè)抗原的量。第31頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天預(yù)期結(jié)果陽(yáng)性：顯色為黃色陰性：無(wú)色1234陰性陰性陽(yáng)性陽(yáng)性第32頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天試劑盒的組成

完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：

（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）

（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）

（3）酶的底物；

（4）陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品（定性測(cè)定中）參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測(cè)定中）；

（5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；

（6）洗滌液；（7）顯色液

（8）酶反應(yīng)終止液。第33頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天本次實(shí)驗(yàn)內(nèi)容乙肝表面抗原的檢測(cè)具體操作見說明書(一組7孔)第34頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天乙肝相關(guān)知識(shí)慢性乙型肝炎是一種由乙型肝炎病毒（HBV）引起的慢性、傳染性疾病，嚴(yán)重危害健康，影響生活質(zhì)量。1.乙肝的流行病學(xué)全世界半數(shù)以上的人被感染過，5％為慢性感染，每年有5000萬(wàn)新感染，100萬(wàn)死亡。我國(guó)有9.8％HBsAg（＋），慢性達(dá)1000萬(wàn)，60％人群感染。第35頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.傳播途徑傳染源：HBV攜帶者、乙肝患者血液、體液（精液、陰道分泌物、唾液）傳播途徑：血液、血制品、性、垂直、日常密切接觸易感人群：母親是HBV感染的嬰兒、HBV感染家庭成員、吸毒者、性病病人、血透病人、部分醫(yī)護(hù)人員第36頁(yè),共38頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.乙肝病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)、基因組的特點(diǎn)HBV顆粒：小球形顆粒（無(wú)病毒核酸，無(wú)感染性）——病毒顆粒包膜產(chǎn)生過剩管形顆粒