酶與細胞的固定化技術

酶與細胞的固定化技術酶應用過程中的一些不足酶的穩(wěn)定性較差：除了某些耐高溫的酶，如α-淀粉酶等；和胃蛋白酶等可以耐受較低的pH條件以外，大多數的酶在高溫、強酸、強堿和重金屬離子等外界因素影響下，都容易變性失活。酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中與底物反應，這樣酶在反應系統(tǒng)中，與底物和產物混在一起，反應結束后，即使酶仍有很高的活力，也難于回收利用。這種一次性使用酶的方式，不僅使生產成本提高，而且難于連續(xù)化生產。產物的分離純化較困難：酶反應后成為雜質與產物混在一起，無疑給產物的進一步的分離純化帶來一定的困難。

固定化技術第2頁,共61頁，2024年2月25日，星期天酶的固定化

1、什么是固定化技術和固定化酶2、固定化酶的研究歷史3、酶的固定化技術4、固定化酶的特點GoGoGoGo第3頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

固定化生物技術——

通過化學或物理的手段將酶或游離細胞定位于限定的空間區(qū)域內，使其保持活性并可反復利用。第4頁,共61頁，2024年2月25日，星期天1.酶是蛋白質，穩(wěn)定性差（熱、酸堿、有機溶劑對其有影響）。2.不能回收，也使產物中混雜酶蛋白。3.分離純化困難。

游離酶的缺點：第5頁,共61頁，2024年2月25日，星期天什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術第6頁,共61頁，2024年2月25日，星期天固定化酶固定化酶：是指借助物理或化學方法將酶固定在載體上，并在一定的空間內進行催化反應的酶。固定化酶可以連續(xù)地進行反應，反應后的酶可以回收重復使用。固定化酶形狀：顆粒、線條、薄膜和酶管等。固定化菌體優(yōu)點：1）可提高穩(wěn)定性；2）能回收，易與產物分離，可反復使用；3）可連續(xù)化生產操作；4）可實現(xiàn)最優(yōu)化控制；5）酶可以再生利用。缺點：1）酶固定化后酶活力有損失；2）只能用于可溶性小分子底物；3）與完整細胞比較，不適于多酶反應。第7頁,共61頁，2024年2月25日，星期天制備固定化酶的依據固定化酶必須能保持酶原有的專一性、高效催化能力和常溫、常壓下能起催化反應等特點。固定化酶應能回收、貯藏，利于反復使用。固定化酶應用于機械化和自動化操作，所用載體常有一定的機械強度。固定化酶應能保持甚至超過原有酶液的活性。即要保護活性中心基團。固定化酶應能最大程度與底物接近，從而提高產量。具有最小的空間位阻。固定化酶應有最大的穩(wěn)定性。定化酶應易與產物分離。第8頁,共61頁，2024年2月25日，星期天固定化方法

吸附法

結合法

交聯(lián)法

包埋法網格型微囊型共價鍵結合法離子鍵結合法酶的固定化方法第9頁,共61頁，2024年2月25日，星期天1、吸附法

利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。常用的固體吸附劑有活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石等。操作簡便，條件溫和，不會引起酶變性失活，載體廉價易得，而且可反復使用。由于靠物理吸附作用，結合力較弱，酶與載體結合不牢固而容易脫落，所以使用受到一定的限制。

第10頁,共61頁，2024年2月25日，星期天優(yōu)點：條件溫和，操作簡便，酶活力損失少。缺點：結合力弱，易解吸附。第11頁,共61頁，2024年2月25日，星期天2、結合法選擇適宜的載體，使之通過共價鍵或離子鍵與酶結合在一起的固定化方法。根據酶與載體結合的化學鍵不同，可分為：離子鍵結合法：通過離子鍵使酶與載體結合的固定化方法稱為離子鍵結合法。離子鍵結合法所使用的載體是某些不溶于水的離子交換劑。常用的有DEAE-纖維素、TEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等。共價鍵結合法：通過共價鍵將酶與載體結合的固定化方法稱為共價鍵結合法。共價鍵結合法所采用的載體主要有：纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼質、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。酶分子中可以形成共價鍵的基團主要有：氨基、羧基、巰基、羥基、酚基和咪唑基等。要使載體與酶形成共價鍵，必須首先使載體活化。第12頁,共61頁，2024年2月25日，星期天第一個離子結合法固定化酶：

DEAE-Cellulose

固定化過氧化氫酶第一個工業(yè)化的固定化酶：

DEAE-SephadexA-50

固定化氨基?；傅?3頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

借助共價鍵將酶的活性非必需側鏈基團和載體的功能基團進行偶聯(lián)。共價結合法（covalentbindingorcovalentcoupling）

第14頁,共61頁，2024年2月25日，星期天1）載體：親水載體優(yōu)于疏水載體

如:天然高分子衍生物:

纖維素葡聚糖凝膠親和性好，機械性能差瓊脂糖合成聚合物：聚丙烯酰胺 聚苯乙烯機械性能好，但有疏水結構尼龍第15頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

使載體活化的方法很多，主要的有：重氮化法、疊氮法、溴化氰法、烷基化法等。第16頁,共61頁，2024年2月25日，星期天優(yōu)點：酶與載體結合牢固，不會輕易脫落，可連續(xù)使用。缺點：反應條件較激烈，易影響酶的空間構象而影響酶的催化活性。

第17頁,共61頁，2024年2月25日，星期天3、交聯(lián)法借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網狀結構的固定化酶的方法。戊二醛有兩個醛基，這兩個醛基都可與酶或蛋白質的游離氨基反應，形成席夫（Schiff）堿，而使酶或菌體蛋白交聯(lián)，制成固定化酶或固定化菌體。交聯(lián)反應既能發(fā)生在分子間，也可發(fā)生在分子內。酶濃度低時，交聯(lián)發(fā)生在分子內，酶仍保持溶解狀態(tài)。酶濃度高時，交聯(lián)發(fā)生在分子間，酶變?yōu)椴蝗軕B(tài)。交聯(lián)法制備的固定化酶或固定化菌體結合牢固，可以長時間使用。但由于交聯(lián)反應條件較激烈，酶分子的多個基團被交聯(lián)，致使酶活力損失較大，而且制備成的固定化酶或固定化菌體的顆粒較小，給使用帶來不便。為此，可將交聯(lián)法與吸附法或包埋法聯(lián)合使用，以取長補短。常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯等。其中應用最廣泛的是戊二醛。第18頁,共61頁，2024年2月25日，星期天酶分子之間共價交聯(lián)和與水不溶性載體共價偶聯(lián)酶分子；（a）酶分子之間用雙功能基團的化學交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶第19頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

缺點：(1)反應條件激烈，酶分子的多個基團被交聯(lián)，酶活力損失大。(2)制備的固定化酶顆粒較小，給使用帶來不便。

第20頁,共61頁，2024年2月25日，星期天4.包埋法

將酶用物理的方法包埋在各種載體（高聚物）內。分為：網格型：將酶包埋在高分子凝膠細微網格中。微囊型：將酶包埋在高分子半透膜中。第21頁,共61頁，2024年2月25日，星期天1）網格型包埋法（gel(lattic)entrapment）又稱凝膠包埋法凝膠包埋條件酶活性強度天然凝膠瓊脂、海藻酸鈣、角叉菜膠、明膠溫和不變差合成凝膠聚丙烯酰胺、光交聯(lián)樹脂聚合反應部分失活高使用的多孔載體及其特點第22頁,共61頁，2024年2月25日，星期天海藻酸鈣凝膠包埋法：滴至海藻酸鈉溶液＋E(orcell)CaCl2溶液中IE(orIC)

角叉菜膠包埋法：滴至角叉菜膠＋E(orcell)KCl

溶液中IE(orIC)聚丙烯酰胺凝膠包埋法：

APAcr+Bis+E(orcell)IE(orIC)TEMED第23頁,共61頁，2024年2月25日，星期天2）微囊型包埋法（microencapsulation）

又稱半透膜包埋法將一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜內。半透膜：直徑幾十微米到幾百微米，厚約25nm。半透膜孔徑<酶分子孔徑，小于半透膜孔徑的小分子底物和產物可以自由進出，被稱為“人工細胞”。第24頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

與網格型包埋法相比，微囊型包埋法的優(yōu)點：1）固定化酶顆粒小，有利于底物和產物擴散。2）半透膜能阻止蛋白質分子滲漏和進入，注入體內既可避免引起免疫過敏反應，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有較大的醫(yī)學價值。缺點：反應條件要求高,制備成本也較高。

第25頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

包埋法是目前應用最多的一種較理想的方法，與其它固定化方法相比：優(yōu)點：不與酶蛋白氨基酸殘基反應，很少改變酶的高級結構，酶活回收率高。缺點：只適合作用于小分子底物和產物的酶。第26頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

吸附法結合法交聯(lián)法包埋法

酶的四種固定化方法第27頁,共61頁，2024年2月25日，星期天第28頁,共61頁，2024年2月25日，星期天第29頁,共61頁，2024年2月25日，星期天固定化方法吸附法包埋法結合法交聯(lián)法制備難易易較難難較難結合程度弱強強強活力回收高，酶易流失高低中等再生可能不能不能不能費用低低高中等底物專一性不變不變可變可變各種固定化方法的優(yōu)缺點比較第30頁,共61頁，2024年2月25日，星期天固定化酶性質固定化對酶穩(wěn)定性影響：1）對熱穩(wěn)定性提高；2）對變性劑、抑制劑的耐受性提高；3）對蛋白酶抵抗能力增加、儲存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性有所增強。最適溫度：一般與游離酶相似。最適pH：受載體帶電性和產物性質等最適pH會受一定影響。底物特異性：是否變化與底物的分子質量大小有一定關系。米氏常數：固定化酶的表觀米氏常數隨載體帶電性能而變化。第31頁,共61頁，2024年2月25日，星期天固定化酶操作的注意事項活性中心：保護酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基團固有的高級結構不受到損害，在制備固定化酶時，需要在非常嚴密的條件下進行。功能基團：如游離的氨基、羧基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、絲氨酸和蘇氨酸的羥基等，當這些功能基團位于酶的活性中心時，要求不參與酶的固定化結合酶的高級結構：要避免用高溫、強酸、強堿等處理，而且有機溶劑、高濃度的鹽也會使酶變性、失活，因此，操作應盡量在非常溫和的條件下進行。第32頁,共61頁，2024年2月25日，星期天分類方式固定化細胞分類方式固定化細胞細胞類型微生物植物動物生理狀態(tài)死細胞:完整細胞,細胞碎片,細胞器活細胞:增殖細胞,靜止細胞,饑餓細胞細胞的固定化方法第33頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

1)直接固定法

不使用載體，借助物理（如加熱、冰凍）、化學方法（如檸檬酸、各種絮凝劑）將細胞直接固定。一般只用于單酶或少數幾種酶催化的反應。

2)吸附法

3)包埋法

2.固定化方法第34頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

與固定化酶相比，固定化細胞的情況比較復雜。（1）有活性升高的現(xiàn)象。（2）穩(wěn)定性的增加。（3）最適溫度和最適pH常保持不變。固定化細胞的特點

第35頁,共61頁，2024年2月25日，星期天固定化酶（細胞）的評價指標（一）固定化酶（細胞）活力：固定化酶通常呈顆粒狀，一般用于測定自然酶活力的方法改進后才能用于測定固定化酶。通常采用間歇測定和連續(xù)測定方法。蛋白總量：1）雙辛可寧酸法(BCA法)；2）考馬斯亮藍法。半衰期：在連續(xù)測定條件下，固定化酶(細胞)的活力下降為最初活力一半所經歷的連續(xù)工作時間，以t1/2表示，是衡量穩(wěn)定性的一項重要指標。第36頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

如果耦聯(lián)率與酶活力回收率相近，則表明固定化方法對酶活力沒有明顯影響。固定化酶（細胞）的評價指標（二）偶聯(lián)率=(加入蛋白活力一上清液蛋白活力)/加入蛋白活力×100%活力回收率=固定化酶總活力/加入酶的總活力×100%相對活力=固定化酶總活力/(加入酶的總活力-上清液中未偶聯(lián)酶活力)×100%第37頁,共61頁，2024年2月25日，星期天乙酰-DL—AlaL—Ala+乙酸 乙酰-D—Ala固定化酶與固定化細胞的應用

一、在工業(yè)生產上的應用

1.氨基?；福ˋminoacylase）世界上第一種工業(yè)化生產的固定化酶第38頁,共61頁，2024年2月25日，星期天泵儲罐反應產物離心機消旋反應器固定化酶柱子晶體L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala第39頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

2.葡萄糖異構酶世界上生產規(guī)模最大，應用最為成功的一種固定化酶。第40頁,共61頁，2024年2月25日，星期天二、固定化酶在醫(yī)學上的應用

1.消血栓：纖溶酶是異源蛋白質，在人體內引起免疫反應，無法長期使用。酶的不穩(wěn)定性使其在較短的時間內失活。用包埋法制備的酶固定化技術可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物質能自由進出。第41頁,共61頁，2024年2月25日，星期天2.人工腎：原理：將病人血液中的尿素經脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微膠囊活性炭組成人工腎。第42頁,共61頁，2024年2月25日，星期天酶傳感器

固定化酶和電化學傳感器的結合。優(yōu)點：①既有不溶性酶體系的優(yōu)點，又具有電化學電極的高靈敏度；②酶的專一反應性，使其具有較高的選擇性，能夠直接在復雜試樣中進行測定。三、在分析檢測中的應用第43頁,共61頁，2024年2月25日，星期天SensitiveandspecificRapidSimpleBiosensor第44頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

1967年Updike等采用酶的固定化技術，將葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧電極結合，組裝成了世界上第一個生物傳感器——葡萄糖氧化酶電極。第45頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

葡萄糖酶電極

酶電極示意圖?－D－葡萄糖＋O2 D－葡萄糖酸－1，5－內酯＋H2O2半透膜酶膠層感應電極第46頁,共61頁，2024年2月25日，星期天GlucoseGluconicacidGlucoseoxidaseOxygenHydrogenperoxideMembraneElectrode

根據反應中消耗的O2、生成的葡萄糖酸和H2O2的量，可以用氧電極、pH電極和H2O2電極來測定葡萄糖的含量。第47頁,共61頁，2024年2月25日，星期天繼酶傳感器（enzymesensor）后，又出現(xiàn)：細胞器傳感器（cellorganellesensor）組織傳感器（tissuesensor）微生物傳感器（microbesensor）免疫傳感器（immunosensor）第48頁,共61頁，2024年2月25日，星期天1）酶傳感器的原理生物傳感器

由生物識別單元（如酶、微生物、抗體等）和物理轉換器相結合所構成的分析儀器。第49頁,共61頁，2024年2月25日，星期天生物識別元件

(Biologicalrecognitionelement)

是酶、抗原(體)、細胞器、組織切片和微生物細胞等生物分子經固定化后形成的一種膜結構，對被測定的物質有選擇性的分子識別能力。第50頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

換能器(Transducer)

將識別元件上進行的生化反應中消耗或生成的化學物質，或產生的光或熱等轉換為電信號，并呈現(xiàn)一定的比例關系。第51頁,共61頁，2024年2月25日，星期天第52頁,共61頁，2024年2月25日，星期天酶傳感器工作原理示意圖酶傳感器主要由固定化酶膜和變換器組成：固定化酶膜：選擇性地“識別”并催化被檢測物質發(fā)生化學反應；變換器：把催化反應中底物或產物的變量轉換成電信號，通過儀表顯示出來。

第53頁,共61頁，2024年2月25日，星期天第54頁,共61頁，2024年2月25日，星期天2）酶傳感器的應用

水質監(jiān)測

用化學法測