酶工程在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用

酶工程在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用酶促反應(yīng)的專一性強(qiáng)，反應(yīng)條件溫和。酶工程的優(yōu)點(diǎn)是工藝簡單、效率高、生產(chǎn)成本低、環(huán)境污染小，而且產(chǎn)品收率、純度高，還可制造出化學(xué)法無法生產(chǎn)的產(chǎn)品。以下重點(diǎn)介紹固定化酶技術(shù)在制藥工業(yè)中生產(chǎn)抗生素、核苷酸和氨基酸的應(yīng)用。第2頁,共43頁，2024年2月25日，星期天1.固定化細(xì)胞法生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸2.固定化酶法生產(chǎn)5’-復(fù)合單核苷酸3.固定化酶法生產(chǎn)L-氨基酸第3頁,共43頁，2024年2月25日，星期天1.固定化細(xì)胞法生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸青霉素G(或V)經(jīng)青霉素?；缸饔茫獬?cè)鏈后的產(chǎn)物稱為6-氨基青霉烷酸(6-APA)，也稱無側(cè)鏈青霉素。第4頁,共43頁，2024年2月25日，星期天6-APA是生產(chǎn)半合成青霉素的最基本原料，到目前為止，以6-APA為原料已合成近3萬種衍生物，并已篩選出數(shù)十種耐酸、耐酶、低毒及具有廣譜抗菌作用的半合成青霉素。第5頁,共43頁，2024年2月25日，星期天1．技術(shù)路線固定化細(xì)胞法生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸的技術(shù)路線第6頁,共43頁，2024年2月25日，星期天2．工藝過程(1)大腸桿菌培養(yǎng)(2)

E．coli固定化(3)固定化E．coli反應(yīng)堆制備(4)轉(zhuǎn)化反應(yīng)(5)6-APA的提取第7頁,共43頁，2024年2月25日，星期天青霉素?；皋D(zhuǎn)化流程圖1.酶反應(yīng)器；2．pH凋節(jié)罐；3．熱水罐；4．堿液罐；5.熱水循環(huán)泵；6．裂解液循環(huán)泵；7．流量計；8.自動pH計；9．自動記錄溫度計；10．酶反應(yīng)器溫度計第8頁,共43頁，2024年2月25日，星期天大腸桿菌培養(yǎng)

斜面培養(yǎng)基：普通肉汁瓊脂培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨2％，NaCl0.5％，苯乙酸0.2％，自來水配制。用2mol/LNaOH溶液調(diào)pH7.0，在55.16kPa壓力下滅菌30min后備用。第9頁,共43頁，2024年2月25日，星期天將斜面接種后培養(yǎng)18～30h的E．ColiD816(產(chǎn)青霉素?；?，用15mL無菌水制成菌細(xì)胞懸液；取1mL懸浮液接種至裝有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角燒瓶（250mL）中，在搖床上28℃，170r/min振蕩培養(yǎng)15h，如此依次擴(kuò)大培養(yǎng)，直至1000～2000L。第10頁,共43頁，2024年2月25日，星期天規(guī)模通氣攪拌培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后用高速管式離心機(jī)離心收集菌體，備用。第11頁,共43頁，2024年2月25日，星期天E．coli固定化

取E.coli濕菌體100kg，置于40℃反應(yīng)罐中，在攪拌下加入50L10％明膠溶液，攪拌均勻后加入25％戊二醛5L，再轉(zhuǎn)移至搪瓷盤中，使之成為3～5cm厚的液層，室溫放置2h，再轉(zhuǎn)移至4℃冷庫過夜；第12頁,共43頁，2024年2月25日，星期天待形成固體凝膠塊后，通過粉碎和過篩，使其成為直徑為2mm左右的顆粒狀固定化E．coli細(xì)胞，用蒸餾水及pH7.5、0.3mol/L磷酸緩沖液先后充分洗滌，抽干，備用。第13頁,共43頁，2024年2月25日，星期天固定化E．Coli反應(yīng)堆制備

生物反應(yīng)堆：將酶或細(xì)胞進(jìn)行固定化處理，再將固定化酶或細(xì)胞裝填于適當(dāng)反應(yīng)器中制成的填充式反應(yīng)器。第14頁,共43頁，2024年2月25日，星期天將上述充分洗滌后的固定化E．Coli細(xì)胞(產(chǎn)青霉素?；?裝填于帶保溫夾套的填充床式反應(yīng)器中，即成為固定化E．coli反應(yīng)堆（反應(yīng)器規(guī)格為Ф70cm×160cm）。第15頁,共43頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)化反應(yīng)

取20kg青霉素G(或V)鉀鹽，加入到1000L配料罐中，用0.03mol/L、pH7.5的磷酸緩沖液溶解并使青霉素鉀鹽濃度為3％，用2mol/LNaOH溶液調(diào)pH至7.5～7.8；

第16頁,共43頁，2024年2月25日，星期天然后，將反應(yīng)器及pH調(diào)節(jié)罐中反應(yīng)液溫度升到40℃，維持反應(yīng)體系的pH在7.5～7.8范圍內(nèi)，以70L/min流速使青霉素鉀鹽溶液通過固定化E．Coli

反應(yīng)堆進(jìn)行循環(huán)轉(zhuǎn)化，直至轉(zhuǎn)化液pH不變?yōu)橹?。循環(huán)時間一般為3～4h。反應(yīng)結(jié)束后，放出轉(zhuǎn)化液。第17頁,共43頁，2024年2月25日，星期天6-APA的提取

上述轉(zhuǎn)化液經(jīng)過濾澄清后，濾液用薄膜濃縮器減壓濃縮至100L左右；冷卻至室溫后，于250L攪拌罐中加50L醋酸丁酯充分?jǐn)嚢杼崛?0～15min（萃?。?；第18頁,共43頁，2024年2月25日，星期天取下層水相，加1％g/mL活性炭于70℃攪拌脫色30min，濾除活性炭；濾液用6mol/L鹽酸調(diào)pH至4.0左右，5℃放置結(jié)晶過夜；次日濾取結(jié)晶，用少量冷水洗滌，抽干，115℃烘2～3h，得成品6-APA。按青霉素G計，收率一般為70％～80％。第19頁,共43頁，2024年2月25日，星期天2.固定化酶法生產(chǎn)5’-復(fù)合單核苷酸4種5’-復(fù)合單核苷酸注射液可用于治療白血球下降、血小板減少及肝功能失調(diào)等疾病。核糖核酸(RNA)經(jīng)5’-磷酸二酯酶作用可分解為腺苷、胞苷、尿苷及鳥苷的一磷酸化合物，即AMP、CMP、UMP，及GMP。

第20頁,共43頁，2024年2月25日，星期天5’-磷酸二酯酶存在于桔青霉細(xì)胞、谷氨酸發(fā)酵菌細(xì)胞及麥芽根等生物材料中。實驗以麥芽根為材料制取5’-磷酸二酯酶，并使其固定化后用于水解酵母RNA，以生產(chǎn)5’-復(fù)合單核苷酸注射液。第21頁,共43頁，2024年2月25日，星期天RNA由核糖核苷酸經(jīng)磷酯鍵縮合而成長鏈狀分子核苷酸之間的連結(jié)方式：3‘,5’-磷酸二酯鍵生產(chǎn)5’-復(fù)合單核苷酸第22頁,共43頁，2024年2月25日，星期天1．技術(shù)路線固定化酶法生產(chǎn)5’-復(fù)合單核苷酸的技術(shù)路線

第23頁,共43頁，2024年2月25日，星期天2．工藝過程(1)5’-磷酸二酯酶的制備(2)固定化5’-磷酸二酯酶的制備

(3)轉(zhuǎn)化反應(yīng)

(4)5’-復(fù)合單核苷酸的分離純化

(5)精制及灌封第24頁,共43頁，2024年2月25日，星期天5’-磷酸二酯酶的制備

取干麥芽根，加9～10倍體積(W/V)的水，用2mol/LHCl調(diào)pH至5.2，于30℃條件下浸泡15～20h，然后加壓去渣，浸出液過濾，濾液冷卻至5℃，加入2.5倍體積(V/V)的95％冷工業(yè)乙醇(5℃)，于5℃靜置2～3h后，吸去上層清液，回收乙醇，下層離心收集沉淀，用少量丙酮及乙醚先后洗滌2～3次，真空干燥，粉碎得5’-磷酸二酯酶。第25頁,共43頁，2024年2月25日，星期天固定化5’-磷酸二酯酶的制備

取上述磷酸二酯酶0.2kg(控制固定化后的固定化酶比活力在100U/g以上為宜)，用1.5％的(NH4)2SO4溶液溶解，過濾得酶液。另取濕ABXE—纖維素樹脂40kg，加入0～5℃的蒸餾水至80L，攪拌下先后加入1mol/LHCl和5％NaNO2溶液各10L，攪拌均勻，于0～5℃下反應(yīng)150min后，抽濾；第26頁,共43頁，2024年2月25日，星期天濾餅迅速用預(yù)冷的0.05mol/LHCl和蒸餾水各洗3次，抽干后將濾餅投入上述5’-磷酸二酯酶溶液中，攪拌均勻后用1mol/LNa2CO3溶液調(diào)pH8.0，攪拌反應(yīng)30min，用冷水洗3～4次，抽干，得固定化5’-磷酸二酯酶。第27頁,共43頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)化反應(yīng)

取2kgRNA，緩慢加入預(yù)熱至60～70℃的360LpH5.0的10-3mol/LZnCl2溶液中，用1mol/LNaOH溶液調(diào)至pH5.0～5.5，濾除沉淀，將清液升溫至70℃，加入上述濕的固定化5’-磷酸二酯酶40kg(要求酶的比活在100U/g以上)，于67℃維持pH5.0～5.5，攪拌反應(yīng)1～2h。第28頁,共43頁，2024年2月25日，星期天根據(jù)增色效應(yīng)，用紫外吸收法判斷轉(zhuǎn)化平衡點(diǎn)。轉(zhuǎn)化完成后，濾出轉(zhuǎn)化液，用于分離5’-單核苷酸。固定化酶再繼續(xù)用于下一批轉(zhuǎn)化反應(yīng)。第29頁,共43頁，2024年2月25日，星期天5’-復(fù)合單核苷酸的分離純化

將上述轉(zhuǎn)化液用6mol/LHCl溶液調(diào)pH至3.0，濾除沉淀，濾液用6mol/LNaOH溶液調(diào)pH至7.0，進(jìn)入已處理好的Cl-型陰離子交換樹脂柱(Ф30cm×100cm)，流速為2～2.5L/min，吸附后，用250～300L去離子水洗滌柱床;第30頁,共43頁，2024年2月25日，星期天然后用3％NaCl溶液以l～1.2L/min流速洗脫，當(dāng)流出液pH達(dá)到7.0時開始分部收集，直至洗脫液中不含核苷酸為止，合并含核苷酸鈉的洗脫液進(jìn)行精制。第31頁,共43頁，2024年2月25日，星期天

精制及灌封

上述核苷酸鈉溶液用薄膜濃縮器減壓濃縮后，測定核苷酸含量，再用無熱原質(zhì)水稀釋至20mg/mL，加入0.5％～1.0％(g/mL)藥用活性炭，煮沸10min脫色和除熱原，濾除活性炭，濾液經(jīng)6號除菌漏斗或0.45μm孔徑的微孔濾膜過濾除菌后灌封，即為5’-復(fù)合單核苷酸注射液。第32頁,共43頁，2024年2月25日，星期天熱原質(zhì)熱原質(zhì)是在生產(chǎn)過程中由于被污染后由雜菌所產(chǎn)生的一種內(nèi)毒素。各種雜菌所產(chǎn)生的熱原反應(yīng)有所不同。革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的熱原反應(yīng)一般比革蘭氏陽性菌的為強(qiáng)。

第33頁,共43頁，2024年2月25日，星期天熱原注入體內(nèi)引起惡寒高熱，嚴(yán)重的引起休克。它是多糖磷類脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的結(jié)合體，為大分子有機(jī)物質(zhì)，能溶于水。在280℃加熱4h它能被破壞90%；第34頁,共43頁，2024年2月25日，星期天180~200℃加熱半小時或150℃加熱2h能被徹底破壞。它亦能被強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氧化劑(如高錳酸酸鉀)等破壞。它能通過一般濾器，但能被活性炭、石棉濾材等所吸附。第35頁,共43頁，2024年2月25日，星期天生產(chǎn)中常用活性炭脫色去除熱原，但須注意脫色時pH，溫度、炭用量及脫色時間等因素，還應(yīng)考慮它對抗生素的吸附問題，否則會影響抗生素的產(chǎn)量；第36頁,共43頁，2024年2月25日，星期天此外，對某些產(chǎn)品可用超微過濾辦法去除熱原，還應(yīng)加強(qiáng)在生產(chǎn)過程中的環(huán)境衛(wèi)生以防止熱原。第37頁,共43頁，2024年2月25日，星期天3.固定化酶法生產(chǎn)L-氨基酸目前氨基酸在醫(yī)藥、食品以及工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用越來越廣。以適當(dāng)比例配成的混合液可以直接注射到人體內(nèi)，用以補(bǔ)充營養(yǎng)。各種必需氨基酸對人體的正常