3-基因工程原理ds-測序技術(shù)

基因工程原理何光源2021-3-102024/5/2造福人類的HGP2024/5/2第一節(jié)DNA測序策略DNA的測序策略因待測DNA分子性質(zhì)、測序方法和測序目的不同而有所不同。在測序之前，必須根據(jù)待測序列區(qū)的長度，所要求的測序精確度以及現(xiàn)有設(shè)施來制定測序總策略。一、序列確實(shí)證性測序策略二、未知序列的從頭測序策略2024/5/2一、序列確實(shí)證性測序策略確證性測序〔confirmatorysequencing〕：對的核酸序列進(jìn)行鑒定和證實(shí)；例如：臨床分子診斷中，對有遺傳傾向的病例檢測相關(guān)基因有無突變；不僅有助于臨床診斷，還有助于探索有關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理及基因突變引起的表型變化。2024/5/2一、序列確實(shí)證性測序策略多數(shù)情況下，確證性測序的DNA片段較小，一套反響即可獲得雙鏈DNA其中一條鏈上局部區(qū)域的核苷酸序列，通常只需對亞克隆于M13噬菌體或噬菌粒載體上的一段適宜的限制酶切片段進(jìn)行測序；待測DNA片段位于通用引物的測序范圍之內(nèi)時(shí)，可按克隆位點(diǎn)兩側(cè)的載體序列設(shè)計(jì)和合成寡核苷酸片段作為“通用引物〞；否那么，最好的方法是合成一段長度為18-20核苷酸的寡核苷酸引物，與距離待測區(qū)約50-100核苷酸的序列互補(bǔ)。2024/5/2〔一〕隨機(jī)測序法鳥槍法shotgunstrategy利用超聲處理、核酸酶Ⅰ〔DNaseⅠ〕切割或限制性酶切割，將長鏈DNA隨機(jī)斷裂成適于測序的片段，把這些DNA片段裝入適當(dāng)載體，建立亞克隆文庫，含有子片段的亞克隆擴(kuò)增后分別進(jìn)行DNA序列測定，然后將序列重疊排列，確定待測DNA的完整序列；該法所獲得的序列由許多序列累積產(chǎn)生，結(jié)果準(zhǔn)確；但由于測序的亞克隆是隨機(jī)挑選出來，某些序列可能屢次重復(fù)測定，而一些序列一直不出現(xiàn)，通常要測定比實(shí)際靶DNA所含核苷酸多4～7倍的序列；如果靶DNA含較多的重復(fù)序列，計(jì)算機(jī)將難以進(jìn)行分析。2024/5/2〔二〕定向測序法定向測序法〔directedsequencing〕：指從待測DNA片段的某一端開始按順序進(jìn)行測序，直至將待測DNA的序列全部測完；該類方法具有方向性，不會(huì)出現(xiàn)大量重復(fù)測定的現(xiàn)象；主要包括：嵌套缺失法和引物步入法。2024/5/2〔二〕定向測序法1．嵌套缺失法嵌套缺失法〔nesteddeletion〕：利用工具酶酶解待測DNA，只要控制消化時(shí)間，即可產(chǎn)生一組從同一端缺失的長度不一的互套缺失突變體，測定其序列，通過相互重疊局部將相鄰片段的序列彼此拼接，如此重疊互套，獲得待測DNA的全序列；產(chǎn)生互套缺失突變體的主要工具酶：核酸外切酶III、核酸酶Bal31、DNA酶I和T4DNA聚合酶。2024/5/2〔二〕定向測序法用外切酶Ⅲ構(gòu)建互套缺失突變體測序方法示意圖2024/5/2〔二〕定向測序法2．引物步入法引物步入法〔primerwalking〕：從待測DNA片段的3’端開始，利用載體上的序列設(shè)計(jì)第一次反響的引物，測定一段DNA序列，然后依次根據(jù)前一次測序結(jié)果，設(shè)計(jì)下一次反響引物，循序漸進(jìn)測序，直至完成，得到靶DNA的全部序列。2024/5/2〔二〕定向測序法引物步入法測序原理示意圖2024/5/2KeyGenomicsTechnologies1975-SouthernDNAhybridizationtechnique1977-Sanger’schain-terminationandMaxam、Gilbert’schemicalDNAsequencingmethods1980-Automatedinsituoligonucleotidesynthesisinstrument1985-Mullis’sdiscoveryofPCRatCetus1992-Affymetrix(Fodor’sgroup)firstgene-chip1995-ABI’sfirstautomatedDNAsequencer2006-2ndgenerationDNAsequenceronmarket2007andbeyond–Singlemoleculesequencingtechniques2024/5/22024/5/2第二節(jié)傳統(tǒng)的DNA序列分析法Sanger雙脫氧鏈終止法Maxam-GilbertDNA化學(xué)修飾法DNA雜交測序毛細(xì)管電泳DNA序列分析的自動(dòng)化2024/5/21970年創(chuàng)造了第一種DNA測序方法2024/5/2Sanger雙脫氧鏈終止法Sanger于1977年在加減法測序的根底上創(chuàng)立了雙脫氧鏈末端合成終止法〔chainterminationmethod〕，簡稱Sanger法、雙脫氧法或酶法。2024/5/2一、根本原理單鏈DNA模板、DNA合成引物、DNA聚合酶以單鏈的DNA為模板，合成出準(zhǔn)確的DNA互補(bǔ)鏈能夠利用2’，3’-雙脫氧核苷三磷酸作底物，參入到寡核苷酸鏈的3’-末端，從而終止DNA鏈的延長2024/5/2雙脫氧鏈終止法的測序根底是以雙脫氧核苷三磷酸為測序反響的鏈終止劑。2024/5/22024/5/2

POHdNTPddNTP

POHOH

P

P

P

POH2024/5/22024/5/22024/5/2雙脫氧鏈末端終止法測序原理示意圖2024/5/2二、測序反響體系的組成2024/5/2Sanger雙脫氧-M13體系M13--噬菌體載體，可得到單鏈DNA序列Sanger雙脫氧-pUC體系

pUC-質(zhì)粒載體，利用雙鏈質(zhì)粒DNA模板的雙脫氧DNA序列分析法2024/5/22024/5/22024/5/22024/5/22024/5/2二、測序反響體系的組成〔二〕引物“通用〞引物：在DNA聚合酶催化的測序反響中需要測序引物。不管是單鏈DNA模板，還是雙鏈DNA模板，都可通過使用克隆位點(diǎn)兩側(cè)的載體序列互補(bǔ)的“通用〞引物；通用引物長度：一般為15～30個(gè)核苷酸。2024/5/2二、測序反響體系的組成〔三〕DNA聚合酶1．大腸桿菌DNA聚合酶I大片段〔Klenow片段〕：Sanger法最早使用的酶，具有5’→3’聚合酶和3’→5’外切酶活性，催化鏈延伸反響的能力較差，用它進(jìn)行測序常產(chǎn)生較高的本底和假帶；2．測序酶〔sequenase〕：經(jīng)過修飾的T7噬菌體DNA聚合酶，消除了3’→5’外切酶活性。酶活非常穩(wěn)定，很高的鏈延伸能力和極快的聚合反響速度，測定較長DNA的首選酶；3．TaqDNA聚合酶：PCR反響關(guān)鍵酶，在95℃的高溫下保持穩(wěn)定，可在高溫下進(jìn)行反響，該酶用于測序具有很好的鏈延伸性能，能克服富含GC序列的模板形成自身二級結(jié)構(gòu)對測序的影響。2024/5/2二、測序反響體系的組成〔四〕放射性核素標(biāo)記的dNTPα-32P-dNTP或α-35S-dNTP。目前通常采用α-35S-dNTP。2024/5/2二、測序反響體系的組成〔五〕測序產(chǎn)物的凝膠電泳及識(shí)讀能否將測序反響中產(chǎn)生的各種不同長度的DNA片段進(jìn)行有效別離是序列分析成敗的關(guān)鍵。2024/5/2三、Sanger雙脫氧鏈終止法的特點(diǎn)1.快速簡便，一次反響可測500個(gè)以上的堿基序列；2.熒光染料代替放射性核素標(biāo)記，使該法便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析，能夠滿足絕大多數(shù)DNA樣品序列分析的需要。2024/5/2Maxam-GilbertDNA化學(xué)修飾法1977年哈佛大學(xué)A.M.Maxam和W.Gilbertf創(chuàng)造原理：化學(xué)試劑處理末端放射性標(biāo)記的DNA片段，造成堿基的特異性切割產(chǎn)生一組具有不同長度的DNA鏈混合物經(jīng)凝膠電泳別離和放射自顯影，讀出待測DNA片段的核苷酸序列2024/5/2由于這種化學(xué)切割反響的特異性是由堿基的修飾作用決定的，所以切割反響必定是定量的化學(xué)切割反響的試劑：肼hydrazine聯(lián)氨NH2-NH2硫酸二甲酯dimethylsulphate六氫吡啶2024/5/2堿性條件下，肼與胸腺嘧啶〔T〕和胞嘧啶〔C〕作用通過六氫吡啶作用，使兩個(gè)磷酸分子從糖片段上釋放出來，導(dǎo)致在核苷酸位置上發(fā)生DNA的斷裂鹽存在的條件下，肼同T的反響被抑制，只發(fā)生胞嘧啶堿基特異的切割反響由此區(qū)別C和C+T兩種反響2024/5/2硫酸二甲酯〔(CH3O)2SO4〕一種堿性的化學(xué)試劑作用于DNA堿基環(huán)中的氮原子，使之甲基化在中性的pH值環(huán)境中，可導(dǎo)致配糖鍵發(fā)生水解，使去堿基的糖-磷酸鍵十分微弱堿性條件下磷酸分子從DNA鏈上脫落，造成鏈的斷裂鳥嘌呤〔G〕的N7>腺嘌呤(A)的N3六氫吡啶作用，從脫氧核糖上移去2個(gè)磷酸分子，使DNA鏈在甲基化的鳥嘌呤G位點(diǎn)斷裂2024/5/22024/5/2CS載體系統(tǒng)：末端標(biāo)記載體核酸內(nèi)切酶Th111Ⅰ特點(diǎn)：產(chǎn)生5’單堿基的突出末端，便于標(biāo)記；Th111Ⅰ位點(diǎn)十分稀少；5’突出末端可以是G或A，也可以是T或C，選擇性強(qiáng)；在載體中具有兩個(gè)Th111Ⅰ位點(diǎn)，可對克隆在載體上的片段任何一段作選擇性標(biāo)記2024/5/2化學(xué)修飾法的優(yōu)點(diǎn)：不需要體外酶切；只要有末端標(biāo)記，無論單雙鏈都可用來測序。限制因素：測序膠的分辨率2024/5/2DNA雜交測序原理：如果一段短的DNA探針能夠與較長的靶DNA片段雜交，并形成完全的雙鏈分子，可據(jù)此推斷靶DNA序列相對應(yīng)的互補(bǔ)序列步驟：將待測的靶DNA分子與一組核苷酸序列的寡核苷酸探針進(jìn)行雜交比較分析與待測DNA雜交的探針之間的堿基重疊關(guān)系，據(jù)此推算靶DNA的核苷酸序列2024/5/22024/5/2兩種操作方式：1.將不同的寡核苷酸與固定在濾膜上的靶DNA序列樣品進(jìn)行雜交2.應(yīng)用寡核苷酸矩陣芯片的DNA雜交測序法2024/5/2雜交測序的應(yīng)用2024/5/2毛細(xì)管電泳2024/5/22024/5/22024/5/2〔三〕陣列毛細(xì)管電泳CAE，Capillaryarrayelectrophoresis將毛細(xì)管電泳與板凝膠電泳的優(yōu)勢相結(jié)合，采用毛細(xì)管凝膠電泳的裝置，將多支毛細(xì)管并列進(jìn)行別離與檢測，以板凝膠電泳的優(yōu)勢彌補(bǔ)了毛細(xì)管凝膠電泳的缺乏，可一次檢測多個(gè)樣品；陣列毛細(xì)管電泳散熱效率高，適于高電場強(qiáng)度電泳，是一種高速、高通量的測序法；使用非凝膠基質(zhì)，毛細(xì)管壁可以抑制橫向擴(kuò)散，具有易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)。2024/5/2DNA序列分析的自動(dòng)化激光測序法終止標(biāo)記系統(tǒng)用4種不同的熒光染料標(biāo)記不同的ddNTP；測序反響在同一反響管內(nèi)進(jìn)行，不必分成4管；反響產(chǎn)物按終止位置的堿基不同其3’末端帶有不同的熒光基團(tuán)，被激發(fā)后產(chǎn)生不同的熒光；將反響產(chǎn)物加樣于凝膠的同一加樣孔，電泳別離后，經(jīng)過DNA測序儀分析系統(tǒng)識(shí)別，將檢測將信號不斷傳送到計(jì)算機(jī)，通過軟件分析，自動(dòng)讀出待測DNA的全部核苷酸序列。2024/5/2激光測序法終止標(biāo)記系統(tǒng)測序原理示意圖2024/5/2測序儀原理1.熒光標(biāo)記BigDyeTerminators--美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司專利，四色熒光分別標(biāo)記的起鏈終止劑作用的四種ddNTPs；一個(gè)反響管中完成循環(huán)測序反響，通過一個(gè)電泳道電泳即可完成測序任務(wù)；傳統(tǒng)雙脫氧鏈終止法：四個(gè)反響管循環(huán)測序反響，四個(gè)泳道電泳檢測2024/5/22.循環(huán)測序2024/5/2377型遺傳分析儀310型遺傳分析儀3100遺傳分析儀

3730遺傳分析儀

2024/5/22024/5/2NextGenerationSequencingSamplefragmentationLibrarypreparationSequencingreactionDataanalysisRoche454焦磷酸測序PyrophosphateSequencingIlluminaSolexa合成測序SequencebySynthesizeABISOLiD連接法測序SequencebyLigation2024/5/2表目前使用最廣泛的三大第二代測序平臺(tái)測序能力統(tǒng)計(jì)信息〔2021年年初數(shù)據(jù)〕廠商RocheIlluminaABI技術(shù)454SolexaGASOLiD測序儀GS20FLXTiIIIIIx123序列數(shù)目（百萬）0.50.51.252810025040115320單末端測序（Single-end）讀長（bp）1002004003550100253550運(yùn)行時(shí)間（天）0.250.30.4335658通量（Gb）0.050.10.515251416配對末端測序（Paired-end）3個(gè)水稻基因組/天12個(gè)水稻基因組/天10個(gè)水稻基因組/天讀長（bp）

2004002×352×502×1002×252×352×50庫序列長度（kb）

3.53.50.20.20.2332運(yùn)行時(shí)間（天）

0.30.461010121016通量（Gb）

0.10.529502832Solexa和SOLiD配對末端測序所需時(shí)間和產(chǎn)出是單末端的兩倍，454的配對末端和單末端差異在于建庫方法，所需時(shí)間和測序量不變。ABISOLiD包含兩張芯片，這里的數(shù)據(jù)是一張芯片的量。2024/5/2Roche454焦磷酸測序2024/5/2原理熒光素酶硫酸化酶焦磷酸熒光素氧化熒光素可見光2024/5/22024/5/2測序原理體外構(gòu)建好的兩端帶接頭的單鏈DNA文庫；單鏈DNA文庫在一個(gè)油包水的乳液環(huán)境中進(jìn)行PCR擴(kuò)增由于起始階段模板濃度非常低，因此大局部包含磁珠的乳液滴都只含有一種模板；經(jīng)PCR擴(kuò)增，每個(gè)磁珠只連有一種模板的擴(kuò)增產(chǎn)物打破為乳液滴，收集磁珠，參加芯片中；2024/5/2測序原理經(jīng)乳液PCR法擴(kuò)增后攜帶有大量模板的磁珠被置于芯片上的微孔中；焦磷酸法測序每一輪反響都會(huì)摻入一個(gè)核苷酸，同時(shí)釋放一個(gè)焦磷酸；焦磷酸和腺苷酰硫酸在硫酸化酶的催化下生成ATP；熒光素酶在ATP參與下將熒光素轉(zhuǎn)化為氧化熒光素，同時(shí)發(fā)出熒光被檢測器檢測到。2024/5/2工作流程文庫制備乳液PCR焦磷酸測序參加含酶小微珠芯片制備2024/5/2工作流程一、樣品輸入并片段化基因組DNA、BAC等被打斷成300－800bp的片段；對于小分子非編碼RNA或者PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，直接使用二、文庫制備將A和B接頭〔3’和5’端具有特異性〕連接到DNA片段上；接頭將用于后續(xù)的純化、擴(kuò)增和測序步驟；具有A、B接頭的單鏈DNA片段組成了樣品文庫。2024/5/2工作流程三、一個(gè)DNA片段連接一個(gè)磁珠單鏈DNA文庫被固定在特別設(shè)計(jì)的DNA捕獲磁珠上，每一個(gè)磁珠攜帶了一個(gè)獨(dú)特的單鏈DNA片段；磁珠結(jié)合的文庫被擴(kuò)增試劑乳化，形成油包水的混合物，成為只包含一個(gè)磁珠和一個(gè)獨(dú)特片段的微反響器。四、乳液PCR擴(kuò)增每個(gè)獨(dú)特的片段在自己的微反響器里進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增，沒有其他的競爭性或者污染性序列的影響；整個(gè)片段文庫的擴(kuò)增平行進(jìn)行；每一個(gè)片段擴(kuò)增后產(chǎn)生幾百萬個(gè)相同的拷貝；乳液混合物被打破，擴(kuò)增的片段結(jié)合在磁珠上。2024/5/2工作流程五、測序攜帶DNA的捕獲磁珠〔20m〕隨后放入PTP板〔Pico

TiterPlate〕的微孔〔29m〕中進(jìn)行后繼的測序反響；反響釋放出的光信號實(shí)時(shí)被儀器配置的高靈敏度CCD捕獲到，有一個(gè)堿基和測序模板進(jìn)行配對，就會(huì)捕獲到一分子的光信號；由此一一對應(yīng)，可以準(zhǔn)確快速地確定待測模板的堿基序列六、數(shù)據(jù)分析454測序系統(tǒng)可以在10小時(shí)的運(yùn)行當(dāng)中獲得100多萬個(gè)讀長，讀取超過4-6億個(gè)堿基信息；提供兩種不同的生物信息學(xué)工具對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，適用于不同的應(yīng)用：達(dá)400MB的從頭拼接和任何大小基因組的重測序。2024/5/2454sequencing：EmulsionPCR(emPCR)GenerationofmillionsofclonallyamplifiedtemplatesoneachbeadNocloningandcolonypickingMixDNALibrary&capturebeads(limiteddilution)“Breakmicro-reactors”IsolateDNAcontainingbeadsCreate“Water-in-oil”emulsion+PCRReagents+EmulsionOilPerformemulsionPCRAdaptercarryinglibraryDNAABMicro-reactorsAdaptercomplementEnrichAnnealSeqprimer2024/5/2454sequencing：DepositionofDNAbeadsinto thePicoTiter?PlateCentrifugeStepLoadEnzymeBeadsLoadbeadsintoPicoTiter?Plate2024/5/2454測序系統(tǒng)圖示A為液體試劑供給裝置B為反響池C為光線檢測成像系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)2024/5/2測序質(zhì)量2024/5/2圖a為高通量鳥槍Sanger測序法策略圖b為鳥槍循環(huán)芯片測序法策略2024/5/22024/5/2一個(gè)4Mb基因組和3個(gè)6Mb基因組測序傳統(tǒng)的Sanger測序法：需要好幾個(gè)月的時(shí)間，454測序儀，一位實(shí)驗(yàn)人員，包括樣品制備等步驟在內(nèi)所用的時(shí)間僅需要一周使用454測序儀還防止了傳統(tǒng)測序方法中細(xì)菌克隆階段可能出現(xiàn)的錯(cuò)誤，獲得了高質(zhì)量的測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對R207910產(chǎn)生抗藥性的兩個(gè)點(diǎn)突變位點(diǎn)，此研究成果使得人類最近的40年內(nèi)第一次找到了特異性治療結(jié)核病的藥物2024/5/22007年6月，JamesWatson的基因組序列登錄到了GenBank數(shù)據(jù)庫當(dāng)中，這是第一次使用非Sanger測序法獲得了人類個(gè)體基因組序列，且第一次將個(gè)人基因組序列公之于眾整個(gè)測序在兩個(gè)月之內(nèi)完成，花費(fèi)不到100萬美元，僅占耗時(shí)10年之久的人類基因組方案使用經(jīng)費(fèi)的千分之一，Venter基因組方案費(fèi)用的百分之一2024/5/22024/5/2IlluminaSolexa合成測序IlluminaSolexa合成測序根本原理2024/5/2ClonalSingleMoleculeArrays

單分子克隆PrepareDNAfragmentsLigateadaptersAttachsinglemoleculestosurfaceAmplifytoformclusters20micronsSequence~1000moleculesper~1μmcluster

~1000clustersper100μmsquare~40millionclustersperexperiment2024/5/2ReversibleTerminatorChemistry

可逆終止反響All4labellednucleotidesin1reactionOPPPHNNOOcleavagesitefluor3’blockNextcycleIncorporationDetectionDeblock;fluorremovalODNAHNNOO3’O5’free3’endXOH2024/5/2Sequencing-by-Synthesis(SBS)Cycle1:Addsequencingreagents Firstbaseincorporated Removeunincorporatedbases Detectsignal