食品微生物學(xué)第六章

食品微生物學(xué)第六章微生物檢測(cè)技術(shù)：定量：微生物數(shù)量的測(cè)定定性：根據(jù)各種性狀特征，對(duì)微生物的種類鑒別。第2頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天傳統(tǒng)食品微生物檢測(cè)：以分離、純化、培養(yǎng)為基礎(chǔ)現(xiàn)代食品微生物檢測(cè)：新理論、新技術(shù)遺傳學(xué)特性、細(xì)胞組分、數(shù)值分類快速、靈敏、特異第3頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天第一節(jié)食品中微生物數(shù)量的檢測(cè)方法檢測(cè)食品中微生物總數(shù)的方法：1）活細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)法（Standardplatecount,SPC）2）最近似數(shù)測(cè)定法（mostprobablenumber,MPN）第4頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天檢測(cè)食品中微生物總數(shù)的方法：3）染色還原技術(shù)估算具有還原能力的各種細(xì)胞的總數(shù)4）顯微鏡直接計(jì)數(shù)法（DMC）第5頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、傳統(tǒng)的SPC方法活細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)法（Standardplatecount,SPC）菌落總數(shù)計(jì)數(shù)法“活菌”標(biāo)準(zhǔn)方法意義：判定食品被微生物污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量，也可觀察微生物在食品中生長(zhǎng)繁殖的動(dòng)態(tài)。第6頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天菌落總數(shù)：在一定條件下（需氧、溫度、時(shí)間、pH…)每克（每毫升）食品檢驗(yàn)所生長(zhǎng)出來(lái)的CFU（菌落形成單位）。第7頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天國(guó)標(biāo)規(guī)定：在需氧條件下：細(xì)菌NA37℃48h

霉菌酵母PDA25~28℃5天第8頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天測(cè)定方法

檢測(cè)樣品的處理稀釋傾注（涂布）瓊脂平板計(jì)數(shù)報(bào)告第9頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天（一）樣品采集1、采樣原則：代表性防止污染2、采樣的種類：大樣一整批樣品中樣200g

小樣分析的樣品（檢樣）25g第10頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、采樣方法：

無(wú)菌操作采樣用具必須無(wú)菌盡量采集有包裝的食品粉末狀樣品邊取樣邊混合液體樣品邊振搖邊混合冷凍食品保持冷凍狀態(tài)非冷凍食品保存在0~5℃

第11頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、采樣數(shù)量和部位：

200g/件乳制品一瓶（個(gè)、罐、聽(tīng)）糧三層五點(diǎn)（表、中、下）油重點(diǎn)采取表層及底層油5、采樣標(biāo)簽：名稱來(lái)源數(shù)量編號(hào)時(shí)間..（二）送檢從采樣到實(shí)驗(yàn)室越快越好

不得超過(guò)3h第12頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天（三）樣品的處理和稀釋1）取樣無(wú)菌操作25g放入225mL滅菌生理鹽水的無(wú)菌瓶?jī)?nèi)（1：10稀釋液）2）均勻混合均質(zhì)器第13頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天3）稀釋4）傾注1ml1ml1ml1ml9ml9ml9ml9ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml第14頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天5）傾注平板

稀釋液移入平皿后，將46℃~的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15mL,轉(zhuǎn)動(dòng)平皿?？瞻讓?duì)照第15頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天6）倒置

培養(yǎng)瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板細(xì)菌37℃48h~

霉菌28℃5天第16頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天（四）菌落計(jì)數(shù)法

肉眼觀察放大鏡

TTC（氯化三苯基四氮唑)顯色（五）菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告報(bào)告單位：cfu/g(mL)1、平板菌落數(shù)的選擇：

30~3002、稀釋度的選擇：第17頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天（五）菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告3、菌落數(shù)的報(bào)告：

100以內(nèi)時(shí)按實(shí)數(shù)報(bào)告大于100時(shí)兩位有效數(shù)字

1640016000第18頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天涂布平板法

先倒平板待凝固后，吸取0.1ml稀釋液于平板表面上，用滅菌涂布棒在整個(gè)平板上均勻涂布，培養(yǎng)觀察。第19頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天涂布法的優(yōu)缺點(diǎn)可檢測(cè)到熱敏性菌體菌落形態(tài)比較明顯更適合于嚴(yán)格的好氧菌沒(méi)有傾注法簡(jiǎn)便，易出現(xiàn)菌落重疊、混雜現(xiàn)象第20頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、旋轉(zhuǎn)接種法（Spiralplatemethod）

1970年FDA原理：接種針將樣品液以螺旋方式從平板中央往外連續(xù)接種。接種量：0.05mL第21頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天優(yōu)點(diǎn)：可測(cè)定50~500000cfu/mL的菌數(shù)樣品不需事先稀釋不需做2個(gè)重復(fù)接種速度快結(jié)果可人工計(jì)數(shù)，也可用激光計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)人力與物力花費(fèi)成本低廉測(cè)定結(jié)果與傳統(tǒng)方法相關(guān)性高第22頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天缺點(diǎn)：設(shè)備投資較高含顆粒樣品容易堵塞管道如果樣品的帶菌量超出范圍則結(jié)果準(zhǔn)確性降低對(duì)瓊脂平板表面要求高第23頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天菌落計(jì)數(shù)的其它方法

膜過(guò)濾

MPN

染色還原計(jì)數(shù)法

DMC第24頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、膜過(guò)濾SPC方法的改良過(guò)濾膜的孔徑0.45um

收集菌體提高檢出率直接顯微計(jì)數(shù)膜過(guò)濾與熒光染色方法結(jié)合第25頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天

直接熒光膜技術(shù)計(jì)數(shù)法（DEFT

）

DirectEpifluorescentFilterTechnique第26頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天DEFT—微菌落計(jì)數(shù)

僅用于活細(xì)胞的檢測(cè)原理：食品勻液經(jīng)DEFT膜過(guò)濾，膜放在培養(yǎng)基表面，恒溫培養(yǎng)至微菌落長(zhǎng)出，顯微鏡觀察

G-3hG+6h第27頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天快速檢測(cè)技術(shù)特殊濾膜（0.5um）過(guò)濾樣品液濾膜經(jīng)啶橙染色紫外光顯微鏡觀察活細(xì)胞橙色熒光死細(xì)胞綠色熒光

20~30min第28頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、最近似數(shù)測(cè)定法（MPN）

選擇3個(gè)稀釋梯度的稀釋液，每種稀釋液接種3管（5管）裝有培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果查MPN檢索表，得到樣品中微生物數(shù)量。第29頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天

1915年McCrady發(fā)明MPN的優(yōu)點(diǎn)：方法相對(duì)簡(jiǎn)單與SPC相比，相似率較高用選擇性培養(yǎng)基可檢測(cè)特殊的微生物類群測(cè)定大腸菌群數(shù)量的方法第30頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天

MPN的缺點(diǎn)：需要大量的玻璃器皿（特別是5試管實(shí)驗(yàn)）不能觀察微生物菌落的形態(tài)準(zhǔn)確性不高第31頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、大腸菌群（coliformgroup）

領(lǐng)域用語(yǔ)與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌定義：一群需氧及兼性厭氧，在37℃經(jīng)24h能分解乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。

第32頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天主要包括：大腸埃希氏菌屬（Escherichia）檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）克雷氏菌屬（Klebsiella）產(chǎn)氣腸桿菌屬（Enterobacter）非典型大腸桿菌典型大腸桿菌第33頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天

目前，大腸菌群已被我國(guó)和許多國(guó)家用作食品質(zhì)量評(píng)價(jià)的指示菌。一般認(rèn)為，大腸菌群都是直接或間接來(lái)自人與溫血?jiǎng)游锏募S便。

第34頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、檢測(cè)大腸菌群的意義

糞便污染食品的指示菌大腸菌群數(shù)的高低，表明糞便污染的程度和對(duì)人體健康危害性的大小腸道致病菌污染食品的指示菌

大腸菌群數(shù)的高低，表明腸道致病菌存在的可能性大?。ú⒎且欢ㄆ叫校。?/p>

第35頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、大腸菌群檢測(cè)方法與檢驗(yàn)結(jié)果

檢驗(yàn)結(jié)果：用每100mL（g）樣品中大腸菌群最近似數(shù)來(lái)表示，簡(jiǎn)稱大腸菌群MPN.檢測(cè)方法：乳糖發(fā)酵試驗(yàn)、分離培養(yǎng)、證實(shí)試驗(yàn)見(jiàn)GB4789.3-1994第36頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天五、染色還原計(jì)數(shù)法一種估計(jì)活性微生物數(shù)量的方法。原理：活細(xì)胞內(nèi)含有還原酶，可把特定的染料從一種顏色還原為另外一種顏色。第37頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天亞甲基藍(lán)（蘭色）白色刃天青（暗蘭色）粉紅色或白色染色還原的時(shí)間與樣品中微生物濃度成反比兩種染料：第38頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天應(yīng)用：乳品工業(yè)上原料乳中的微生物檢測(cè)優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快捷和經(jīng)濟(jì)缺點(diǎn)：不同的微生物還原能力不同，給估算帶來(lái)了一定的困難。不適用于含有還原酶的食品應(yīng)用及優(yōu)、缺點(diǎn)第39頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天六、顯微直接計(jì)數(shù)法

（Directmicroscopecount,DMC）一定量的食品（0.001mL）顯微鏡載玻片（1cm2）烘干、固定、脫脂、染色復(fù)式顯微鏡計(jì)數(shù)換算第40頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天DMC方法的優(yōu)點(diǎn)

快捷、簡(jiǎn)便能對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行分析載玻片易保存，作參考可使用熒光技術(shù)增強(qiáng)效果第41頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天DMC方法的缺點(diǎn)

僅適于檢含大量菌體的樣品準(zhǔn)確性差易造成操作人員的疲勞第42頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天七、棉拭子涂抹法

表層微生物的檢測(cè)應(yīng)用于食品、公共場(chǎng)所第43頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天方法：1）無(wú)菌棉拭子蘸取滅菌生理鹽水（10mL試管）均勻涂抹樣品表面一定面積（5cmX5cm，1cmX1cm）后，放回試管中，及時(shí)送檢；第44頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天2）試管振蕩，使微生物懸浮于稀釋液中；3）按SPC方法進(jìn)行梯度稀釋、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。

此外，紙片法……第45頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天第二節(jié)物理、化學(xué)、分子和免疫方法第46頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、物理方法

阻抗測(cè)定法微量量熱法第47頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天（一）阻抗測(cè)定法（impedance）

1899年G.N,Stewart

估算20世紀(jì)70年代應(yīng)用阻抗：交流電路中導(dǎo)電物質(zhì)對(duì)電流所起的阻礙和抵抗作用，可由電導(dǎo)和電容計(jì)算。第48頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天原理：微生物可使培養(yǎng)基中電惰性底物，如碳水化合物、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝成為電活性產(chǎn)物（乳酸鹽或氨等）當(dāng)微生物生長(zhǎng)繁殖時(shí)，培養(yǎng)基中的電惰性分子即為許多電活性分子所取代，從而使培養(yǎng)基的電導(dǎo)性增大，培養(yǎng)基的阻抗降低。第49頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天檢測(cè)時(shí)間（detectiontime)

樣品接種后從開(kāi)始培養(yǎng)到阻抗值發(fā)生急劇變化的時(shí)間。與原始菌數(shù)成反比

Bactomer細(xì)菌計(jì)數(shù)器準(zhǔn)確率93%10~100個(gè)

5h~第50頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）微量量熱法（Microcalorimetry）細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生熱量測(cè)定微小溫度變化的儀器—量熱計(jì)批次型：早期應(yīng)用流動(dòng)型：靈敏、快速第51頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、化學(xué)方法（一）熱穩(wěn)定性核酸酶（DNAse）

S.aureusG（+）凝固酶（+）產(chǎn)腸毒素菌株95%產(chǎn)熱穩(wěn)定性核酸酶耐高溫第52頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天原理：檢測(cè)食品中熱穩(wěn)定性核酸酶的含量，可以精確計(jì)算出金黃色葡萄球菌的數(shù)量。第53頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天

分光光度法

熱穩(wěn)定性核酸酶是S.aureus生長(zhǎng)的標(biāo)志凝固酵素是產(chǎn)腸毒素菌株的標(biāo)志第54頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）ATP的測(cè)定生命體的主要能源細(xì)胞中ATP含量恒定ATP測(cè)定計(jì)數(shù)法的原理根據(jù)ATP可與從熒火蟲(chóng)中提取的熒光素酶作用發(fā)光，發(fā)光的總光量與ATP的量成正比。第55頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天

光強(qiáng)度推算出細(xì)菌細(xì)胞數(shù)液體發(fā)光分光計(jì)照度計(jì)結(jié)果與SPC法一致10~25min第56頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天ATP檢測(cè)法的應(yīng)用：

檢測(cè)微生物數(shù)量的快速方法醫(yī)學(xué)：尿樣的檢驗(yàn)環(huán)境衛(wèi)生：表面微生物的測(cè)定第57頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天（三）輻射測(cè)量法（Radiometric）

原理

利用細(xì)菌在代謝碳水化合物時(shí)產(chǎn)生CO2的原理，把微量元素標(biāo)記到葡萄糖或其他糖類分子中。放射能計(jì)數(shù)器第58頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天放射物的種類

C-14葡萄糖C-14甲酸鹽

C14-谷氨酸鹽放射量與菌數(shù)成正比檢測(cè)C-14所需的時(shí)間與食品中微生物的含量成反比。第59頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天應(yīng)用醫(yī)學(xué)：“吹口氣，查胃病”

30min

食品：微生物含量高5~6h

微生物含量低更廠第60頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、食品微生物的指紋識(shí)別和鑒定

“指紋”概念由于每種微生物的化學(xué)組分（DNA、蛋白質(zhì)）結(jié)構(gòu)、性能有差別及其特異性代謝產(chǎn)物等通過(guò)分析技術(shù)出現(xiàn)的特征性的圖譜第61頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天（一）血清學(xué)方法特殊的抗體鑒定同源抗原

G-菌體（O）抗原鞭毛（H）抗原熱穩(wěn)定性好熱穩(wěn)定性差第62頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天抗原（Antigen，Ag）Antigensaremacromoleculesthatelicitanimmuneresponseinthebody.Antigenscanbeproteins

polysaccharides

conjugatesoflipidswithproteins(lipoproteins)andpolysaccharides(glycolipids).第63頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天Antibodiesareimmunesystem-relatedproteinscalledimmunoglobulins（Ig）.Eachantibodyconsistsoffourpolypeptides–twoheavychainsandtwolightchainsjoinedtoforma"Y"shapedmolecule.抗體（Antibody，Ab）第64頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天Structureofantibody第65頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）噬菌體（phage）類型原理：根據(jù)噬菌體和它的宿主細(xì)菌之間的特殊關(guān)系，用已知的噬菌體鑒定其特定的宿主細(xì)菌。第66頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天（三）分子生物學(xué)方法

基因探針技術(shù)

DNA擴(kuò)增法限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)脈沖場(chǎng)凝膠電泳第67頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.基因探針技術(shù)探針（Probe）：經(jīng)過(guò)標(biāo)記的一段短核苷酸，用于檢測(cè)與之同源的核苷酸序列。Probeisashortlabellednucleotideusedtodetecthomologousnucleotidesequence.第68頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天Lengthofprobe：

20-1000bpTypeofprobe：

Oligonucleotideprobes

（20-40bp）SinglestrandedDNAprobes

（200-500bp

）DoublestrandedDNAprobes

RNAprobesorRiboprobes第69頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天

Radioactive：32P、35S、3H、14CDigoxigenin

（Dig）BiotinFluorescentdyeChoiceofLabelling：

Non-radioactive：第70頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天UnknownDNA第71頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天Colony

hybridization第72頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天

可檢測(cè)的細(xì)胞數(shù)量：106-107

必須進(jìn)行細(xì)胞富集！

探針檢測(cè)的靈敏度與檢測(cè)時(shí)間細(xì)胞數(shù)量為108，檢測(cè)需要10-12h第73頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.DNA擴(kuò)增法（1）多聚酶鏈反應(yīng)

PolymeraseChainReaction，PCR1985年，美國(guó)PE-Cetus公司人類遺傳學(xué)研究室的KaryMullis發(fā)明

1993年，Mullis獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)第74頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天PCR的基本原理DNA的結(jié)構(gòu)DNAdoublehelix第75頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天DNA的復(fù)制DNAsemi-conservedreplication第76頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天第77頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天第78頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天三步曲：變性（Denaturation）退火（Annealling）延伸（Extension）一個(gè)循環(huán)（cycle）一般進(jìn)行25-30個(gè)循環(huán)PCR反應(yīng)的三步曲與五要素第79頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天Step1：雙鏈DNA熱變性（94℃）；Step2：引物與模板單鏈DNA退火（55℃）；Step3：DNA的聚合延伸反應(yīng)（72℃）；Step4：擴(kuò)增的雙鏈DNA再次熱變性（返回Step1）。第80頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天五要素：●模板DNA（template）●引物（Primer）●DNA聚合酶（Polymerase）●緩沖液（Buffer，Mg++）●脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）第81頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天第82頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天循環(huán)次數(shù)與產(chǎn)物的量實(shí)際：Nf=N0（1+Y）N其中Y為擴(kuò)增效率理論：Nf=N0X2N

其中N為循環(huán)次數(shù)，N0為起始拷貝數(shù)，Nf為最終拷貝數(shù)第83頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳第84頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天Denaturing94oCTemperature100055Time5’3’3’5’第85頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天PCRDenaturing94oCTemperature100055Time3’5’5’3’Heat第86頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天Denaturing94oCAnnealingPrimers55oCExtension72oCTemperature100055Time3’5’5’3’5’5’Denaturing94oC第87頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天Denaturing94oCDenaturingng94oCAnnealingPrimers55oCExtension72oCTemperature100055Time30x3’5’5’3’HeatHeat5’5’5’第88頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天Denaturing94oCDenaturing94oCAnnealingPrimers55oCExtension72oCTemperature100055Time30x3’5’5’3’5’5’5’5’5’5’第89頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天PCRProductsWithEachThermalCycle0CyclesNumber1382412416532664第90頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA

RandomAmplifiedPolymorphicDNA

（RAPD）DevelopedbyWilliamsetal.(1990)using10baseprimerstogeneraterandomfragmentsfromtemplateDNAsRAPDfragmentscanbeseparatedandusedasgeneticmarkersorakindofDNAfingerprint第91頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天Tworelatedtechniques:

1.ArbitraryPrimedPCR(AP-PCR)WelshandMcClelland(1990)longerprimers(18-25bases)2.DNAAmplificationFingerprinting(DAF)Caetano-Anollesetal.(1991)veryshortprimers(8bases)第92頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天ComponentsofPCRandRAPDRAPD1.Buffer(Mg++)–usuallyhighMg++concentration2.TemplateDNA1shortprimer(10bases)annealstoanyspecificpartofthetemplateDNA4.dNTPs5.TaqPCR1.Buffer(Mg++)2.TemplateDNA2PrimersthatflankthefragmentofDNAtobeamplifieddNTPs5.Taq第93頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天TwomodificationsmadetotypicalthermalcyclingwhenRAPDisbeingdone:Annealingtemperaturesaregenerallyverylow,around36°C-ThisallowsveryshortprimerstoannealtotemplateDNAMorethermalcyclesareused,typically45-Thiscompensatesfortheinefficiencywhichresultsfromusingsuchshortprimers.第94頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天TemplateDNAPrimerbindstomanylocationsonthetemplateDNAOnlywhenprimerbindingsitesarecloseandorientedinoppositedirectionsotheprimerspointtowardeachotherwillamplificationtakeplaceRAPD第95頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天TemplateDNAPrimerspointawayfromeachother,soamplificationwon’thappenRAPD第96頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天TemplateDNAPrimerspointinthesamedirection,soamplificationwon’thappenRAPD第97頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天TemplateDNAPrimerstoofarapart,soamplificationwon’thappen>2,000basesRAPD第98頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天TemplateDNAPrimersarejusttherightdistanceapart,sofragmentisamplified100-1,500basesRAPD第99頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天MM2345678910RAPD產(chǎn)物的電泳圖譜第100頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天PCRMachine第101頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)（RFLP）RestrictionFragmentLengthPolymorphism（1）限制性內(nèi)切酶

(Restrictionendonuclease）保護(hù)細(xì)菌不受外來(lái)DNA侵入來(lái)自細(xì)菌的一種內(nèi)切酶第102頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn)：識(shí)別4-8bp特定序列(sitespecific)兩股DNA上各產(chǎn)生一個(gè)切口回文序列(palindromesequence)5’-GTTACATGAGATCACGGATTC-3’3’-CAATGTACTCTAGTGCCTAAG-5’第103頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天產(chǎn)生粘性末端(cohesiveend,stickyend)5’-GTTACATGAG3’-CAATGTACTCTTAAEcoRI5’-TTACATGC3’-AATGTACGGCMspIAATTCACGGATTC-3’GTGCCTAAG-5’CGGACGGAT-3’CTGCCTA-5’5’-GTTACATGAG3’-CAATGTACTCTTAAAATTCACGGATTC–3’GTGCCTAAG-5’5’-TTACATGC3’-AATGTACGGCCGGACGGAT-3’CTGCCTA-5’第104頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天5’-ACGGATTCGTT3’-TGCCTAAGCAAHpaI5’-AACTGTCGG3’-TTGACAGCCHaeIIIAACGTTACATGA

3’TTGCAATGTACT

5’CCAGGCTG-3’GGTCCGAC-5’產(chǎn)生平末端(bluntend)5’-ACGGATTCGTT3’-TGCCTAAGCAAAACGTTACATGA

3’TTGCAATGTACT

5’5’-AACTGTCGG3’-TTGACAGCCCCAGGCTG-3’GGTCCGAC-5’第105頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）限制性圖譜

(Restrictionmap）第106頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天（3）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性

(RFLP）第107頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天第108頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)

PulsedFieldGelElectrophoresis（PFGE）第109頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天第110頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、免疫學(xué)方法精確性(Accurate)靈敏性(Sensitive)特異性(Specific)第111頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天（一）熒光抗體法（FA）（Fluorescenceantibody）

1942年創(chuàng)立，在食品和醫(yī)學(xué)微生物中應(yīng)用廣泛。原理：抗體與熒光物質(zhì)結(jié)合而帶有熒光，與相應(yīng)抗原結(jié)合后，在熒光顯微鏡下可以觀察，也可計(jì)數(shù)。第112頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天熒光素：異硫氰酸熒光素（FITC）若丹名B（RhodamineB）第113頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）沙門氏菌1-2實(shí)驗(yàn)（1-2Test）原理：血清學(xué)原理,即抗原抗體結(jié)合形成肉眼可見(jiàn)的免疫帶。一種檢測(cè)有動(dòng)力的沙門氏菌的方法第114頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天

在一個(gè)特殊的含兩個(gè)容器的塑料設(shè)備中進(jìn)行：一個(gè)容器中裝有選擇性液體培養(yǎng)基，另一個(gè)中裝有非選擇性運(yùn)動(dòng)性培養(yǎng)基（半固體），并含有鞭毛抗體。恒溫培養(yǎng)時(shí)，運(yùn)動(dòng)性沙門氏菌經(jīng)選擇性培養(yǎng)后進(jìn)入非選擇性培養(yǎng)基，并與其中的抗體結(jié)合形成免疫帶。第115頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天Inoculationchamber第116頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天優(yōu)點(diǎn)：將血清學(xué)反應(yīng)和生化增菌過(guò)程結(jié)合起來(lái)，特異性強(qiáng)；不需特殊實(shí)驗(yàn)室條件，簡(jiǎn)便；

8-14小時(shí)內(nèi)得出結(jié)果，快速。缺點(diǎn)：不能檢測(cè)非運(yùn)動(dòng)型沙門氏菌，免疫條帶的判斷有主觀因素。第117頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天（三）酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定

EnzymeLinkedImmunosorbentAssay1971年Engvall和Perlmann（ELISA）canmeasureantibodiesorantigensinexpensive,rapid,quantitative,specificsensitive(pg/ml)expensiveequipmentnotrequiredcanbeautomated第118頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。原理：第119頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天待測(cè)樣品與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)，加入酶標(biāo)記的抗原或抗體也結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與樣品中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與樣品中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。第120頁(yè),共137頁(yè)，2024年2月25日，星期天ELISA可用于測(cè)定抗原或抗體。測(cè)定中有三個(gè)必要的試劑：（1）固相的抗原或抗體，即“免疫吸附劑”