高效液相色譜法電子講義

高效液相色譜法電子講義三、色譜流程和儀器第2頁,共69頁，2024年2月25日，星期天四、HPLC的特點(diǎn)速度快，分辨率高，靈敏度高、柱子可反復(fù)使用第3頁,共69頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)基本理論一、色譜分離過程（一）液-固吸附色譜流動相為液體，固定相為固體吸附劑，根據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來分離物質(zhì)。第4頁,共69頁，2024年2月25日，星期天流動相和固定相都是液體的色譜法即為液-液色譜，是利用樣品組分在兩種不相溶的液相間的分配來進(jìn)行分離。一種液相為流動相，另一種是涂漬于載體上的固定相。（二）液-液分配色譜流動相極性小于固定相極性的液-液色譜法稱為正相分配色譜法流動相極性大于固定相極性的液-液色譜法稱為反相分配色譜法第5頁,共69頁，2024年2月25日，星期天（三）離子交換色譜（四）離子對色譜法（五）分子排阻色譜法第6頁,共69頁，2024年2月25日，星期天二、色譜流出曲線和保留值（一）色譜流出曲線及相關(guān)術(shù)語（二）保留值第7頁,共69頁，2024年2月25日，星期天第8頁,共69頁，2024年2月25日，星期天三、分離度第9頁,共69頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)定性和定量分析一、定性分析（一）利用已知物對照法定性1、利用保留特性2、利用不同柱比較第10頁,共69頁，2024年2月25日，星期天（二）色譜法和其他方法結(jié)合定性1、利用化學(xué)反應(yīng)定性2、利用二極管陳列檢測器3、收集峰的流出物4、HPLC-MS第11頁,共69頁，2024年2月25日，星期天二、定量分析（一）峰面積或峰高的測量方法1、手測峰高2、峰高乘半峰寬3、剪紙稱重4、積分儀測定5、微處理機(jī)測定第12頁,共69頁，2024年2月25日，星期天（二）定量方法1、峰面積歸一法2、外標(biāo)法3、內(nèi)標(biāo)法4、內(nèi)加法（或追加法）第13頁,共69頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)高效液相色譜的分離模式一、基本原理二、分類1、吸附色譜2、分配色譜3、離子交換色譜第14頁,共69頁，2024年2月25日，星期天4、分子排阻色譜5、親和色譜三、HPLC在生物大分子中的應(yīng)用在生物大分子中的HPLC中，體積排阻色譜，離子交換、反相液相和親和色譜是最常用的分離模式。第15頁,共69頁，2024年2月25日，星期天第五節(jié)液-固色譜法液-固色譜法通常稱為吸附色譜1、載體：硅膠2、吸附劑吸附試樣的能力3、原理第16頁,共69頁，2024年2月25日，星期天第六節(jié)鍵合相色譜法一、正相色譜法1、在正相色譜法中共價結(jié)合到載體上的基團(tuán)都是極性基團(tuán)。2、分離機(jī)制屬于分配色譜3、主要用于分離極性不同的化合物，特別是用來分離不同類型的化合物。第17頁,共69頁，2024年2月25日，星期天二、反相色譜1、分離機(jī)理2、固定相3、流動相第18頁,共69頁，2024年2月25日，星期天第七節(jié)離子交換色譜離子交換色譜是以離子交換樹脂作為固定相，樹脂上具有固定離子基團(tuán)及可交換的離子基團(tuán)，當(dāng)流動相帶著組分電離生成的離子通過固定相時，組分離子與樹脂上可交換的離子基團(tuán)進(jìn)行可逆交換，根據(jù)組分離子對樹脂親和力不同而得到分離。按結(jié)合的基團(tuán)不同，離子交換樹脂可分為陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂。第19頁,共69頁，2024年2月25日，星期天

種類陽離子交換樹脂強(qiáng)酸性弱酸性陰離子交換樹脂強(qiáng)堿性弱堿性第20頁,共69頁，2024年2月25日，星期天離子交換層析適用性

能在水溶液或含水極性溶劑中產(chǎn)生游離離子基團(tuán)的酸、堿及兩性成分?？捎糜诎被?、肽類、生物堿、有機(jī)酸、酚類等水溶性成分的分離。第21頁,共69頁，2024年2月25日，星期天使用離子交換劑使物質(zhì)分離表

樣品

強(qiáng)酸型(磺酸型)

稀NH4OH洗脫

通過液

酸性、中性化合物解離型、兩性化合物

稀NaOH洗脫強(qiáng)堿型(季銨型)強(qiáng)堿型稀HCl洗脫

通過液

通過液

酸性化合物中性化合物解離型物質(zhì)兩性化合物

(鹽、生物堿)第22頁,共69頁，2024年2月25日，星期天一、離子交換色譜的分離機(jī)理1、不足之處：忽略了在填料表面上形成復(fù)合物時溶質(zhì)被流動相中小分子飽和并不斷進(jìn)行計量置換反應(yīng)的重要因素。第23頁,共69頁，2024年2月25日，星期天2、P0：流動相中溶質(zhì)的濃度Pb：填料表面上被吸附的溶質(zhì)濃度D0：流動相中洗脫劑的濃度Db：填料表面上洗脫劑的濃度Z：是蛋白質(zhì)在吸附過程中從填料表面上被置換的洗脫劑的數(shù)目。第24頁,共69頁，2024年2月25日，星期天①Z可以小到忽略不計，反應(yīng)常數(shù)變?yōu)榉峙湎禂?shù)②在Z值不能忽略時第25頁,共69頁，2024年2月25日，星期天在等度洗脫蛋白質(zhì)的過程中，容量因子K’與保留體積成比例，同時洗脫過程中，Kd，Db是常數(shù)，用Kz表示。第26頁,共69頁，2024年2月25日，星期天3結(jié)論二、離子交換色譜的固定相1、高分子類型填料①優(yōu)點(diǎn)a填料的使用壽命長b具有較高的色譜容量c很少有非特異性吸附，對于保持樣品生物活性有利。第27頁,共69頁，2024年2月25日，星期天②結(jié)構(gòu)以交聯(lián)共聚的苯乙烯-二乙烯苯為基質(zhì)，同時也出現(xiàn)了許多其他交聯(lián)高聚物基質(zhì)的固定相。③類型MonoBeadsTSK-gelDEAE-5PWSP-5PWCM-5PW第28頁,共69頁，2024年2月25日，星期天2、無機(jī)基質(zhì)型三、離子交換色譜的流動相1、流動相的PH值①離子交換容量受流動相的PH值影響第29頁,共69頁，2024年2月25日，星期天②改變流動相PH值，也會影響弱電離的酸性或堿性組分的電離情況，因而改變組分的保留值。③流動相PH值的變化也能改變分離的選擇性④對流動相PH值的控制，通常采用緩沖溶液來實現(xiàn)。第30頁,共69頁，2024年2月25日，星期天2、流動相的離子強(qiáng)度四、離子交換色譜的影響因素1、填料孔徑的影響2、柱長的影響3、流速的影響4、PH值的影響第31頁,共69頁，2024年2月25日，星期天無論在強(qiáng)的還是弱的陰離子交換柱上，蛋白質(zhì)均顯示不同PH值影響結(jié)果，因此決定了它的保留選擇性、分離度和回收率等因素。第32頁,共69頁，2024年2月25日，星期天5、離子強(qiáng)度的影響第八節(jié)體積排阻色譜法一、分離機(jī)理1、體積排阻色譜法（SEC）或空間排阻色譜法（SEC）或凝膠色譜法2、凝膠過濾色譜法（GFC）第33頁,共69頁，2024年2月25日，星期天Sephadex葡聚糖凝膠第34頁,共69頁，2024年2月25日，星期天3、凝膠滲透色譜法（GPC）4、空間排斥理論①第35頁,共69頁，2024年2月25日，星期天②V0

死體積，相當(dāng)于凝膠的粒間體積Vs色譜柱中凝膠的孔穴總體積第36頁,共69頁，2024年2月25日，星期天二、體積排阻色譜法的特點(diǎn)第37頁,共69頁，2024年2月25日，星期天三、體積排阻色譜法的固定相（一）固定相的分類1、按固定相基質(zhì)分類2、按固定相機(jī)械強(qiáng)度分類第38頁,共69頁，2024年2月25日，星期天（二）凝膠固定相的特性參數(shù)1、滲透極限2、分離范圍第39頁,共69頁，2024年2月25日，星期天3、固流相比在SEC中常將柱中凝膠孔體積中的溶劑稱為固定相，而將柱中凝膠顆粒間空隙體積中稱為流動相，而凝膠孔體積與凝膠顆粒間空隙體積的比值稱作固流相比。4、柱效第40頁,共69頁，2024年2月25日，星期天（三）凝膠色譜柱的制備及譜圖的特點(diǎn)①物理因素——影響凝膠色譜柱的性能

②擴(kuò)大分離范圍——使用兩根以上的串聯(lián)色譜柱。③更換流動相第41頁,共69頁，2024年2月25日，星期天譜圖的特點(diǎn)：在凝膠滲透色譜中，對不同分子量聚合物色譜峰的譜帶展寬不同于其它液相色譜。①在低效排租色譜法，樣品分子大小隨V的增加而急劇減小，而柱效卻隨樣品分子量的增加而增大因此在色譜圖上，不同分子量組分的譜帶寬度保持不變。②

在高效排租色譜法，峰寬卻是個變量。第42頁,共69頁，2024年2月25日，星期天四、體積排租色譜法的流動相在體積排租色譜法中，流動相的性質(zhì)對保留值和分離選擇性無影響。①溶解樣品的良溶劑②低黏度溶劑③柱填料不能在溶劑作用下收縮或溶脹第43頁,共69頁，2024年2月25日，星期天④控制流動相的PH值和離子強(qiáng)度⑤凝膠滲透色譜——示差折光檢測器流動相的折射率必須盡可能與樣品的折射率有較大的差別。凝膠過濾色譜——紫外吸收檢測器使用在檢測波長無紫外吸收的溶劑作流動相。第44頁,共69頁，2024年2月25日，星期天（一）凝膠滲透色譜的流動相凝膠滲透色譜常采用甲苯，四氫呋喃和氯仿等有機(jī)溶劑作流動相。在用于高聚物分子量測定的凝膠滲透色譜中，四氫呋喃是最常用的流動相，它對樣品有良好的溶解性能和低的黏度，并可使小孔徑聚苯乙烯凝膠溶脹，因此被優(yōu)先推薦使用。第45頁,共69頁，2024年2月25日，星期天第46頁,共69頁，2024年2月25日，星期天（二）凝膠過濾色譜的流動相在凝膠過濾色譜中，使用以水作基體具有不同PH值的多種緩沖溶液作流動相。五、體積排租色譜的影響因素1、填料①化學(xué)鍵合的硅膠②親水樹脂凝膠第47頁,共69頁，2024年2月25日，星期天2、柱長體積排租色譜的分離度與柱長的平方根成正比。3、洗脫液①以硅膠為基質(zhì)的填料，PH值范圍在2.0-8.0。②鍵合硅膠如TSK系列凝膠柱在分離蛋白質(zhì)時保留時間主要取決于填料表面上的硅醇基與離子的反應(yīng)。第48頁,共69頁，2024年2月25日，星期天a)洗脫液離子強(qiáng)度低時b)洗脫液離子強(qiáng)度低增加到0.3-0.5mol/Lc)常用磷酸鹽和硫酸鹽進(jìn)行離子強(qiáng)度的調(diào)節(jié)d)用氯化鈉作離子劑，疏水作用最小e)PH值不能太低，因為H+會腐蝕不銹鋼柱第49頁,共69頁，2024年2月25日，星期天4、流速蛋白質(zhì)分離時，流速對分離度的影響是一個很重要的因素，一般在低流速下蛋白質(zhì)分離是比較理想。5、樣品容量進(jìn)樣體積和樣品的濃度將明顯地影響蛋白質(zhì)的分離度。樣品的濃度范圍一般在0.01%----0.5%.第50頁,共69頁，2024年2月25日，星期天最好是高濃度、小體積、在一般范圍內(nèi)可以得到好的分離效果。蛋白質(zhì)的樣品體積為柱體積的1%---3%比較合適。6、蛋白質(zhì)在變性條件下的分離①變性溶劑如6mol/L鹽酸胍、8mol/L脲、0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)等有助于精確地確定蛋白質(zhì)的分子量。②在變性溶劑中，柱的分離范圍因此而移到低分子量范圍內(nèi)。第51頁,共69頁，2024年2月25日，星期天示例：用高效凝膠過濾色譜法(HPGFC)測定重組人腫瘤壞死因子(rh-TNF)衍生物的相對分子量rh-TNF屬基因工程藥物，其相對分子量的測定是該藥質(zhì)量控制的主要指標(biāo)之一。儀器與色譜條件：島津LC-10AHPLC色譜柱：BeckmanUltraspherogelSEC3000(30cm×7.5cm)流動相0.1mmol/LKH2PO4:0.1mmol/LNa2SO4(1:1)+0.05%NaN3流速:1mL/min檢測波長:280nm第52頁,共69頁，2024年2月25日，星期天標(biāo)準(zhǔn)蛋白相對分子量曲線的制備：選用四種蛋白：醛縮酶、血清白蛋白、碳酸酐酶及抑蛋白酶肽制成的混合標(biāo)樣?？紤]流速等因素對保留時間T的影響而選用了內(nèi)標(biāo)法、既在混合標(biāo)樣中加入右旋糖酐藍(lán)和酪氨酸作為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)樣后可同時測的完全排阻和完全進(jìn)入填料孔的兩種內(nèi)標(biāo)的保留時間T0和Tt，用分配系數(shù)Kd對相對分子量對數(shù)作圖，從而保證結(jié)果有良好的重現(xiàn)性。第53頁,共69頁，2024年2月25日，星期天第54頁,共69頁，2024年2月25日，星期天樣品測定:根據(jù)樣品的保留時間T求出其分配系數(shù)Kd，由Kd從標(biāo)準(zhǔn)蛋白相對分子質(zhì)量曲線上查出相應(yīng)的lgMr，計算相對分子質(zhì)量。第55頁,共69頁，2024年2月25日，星期天第九節(jié)親合色譜法親合色譜法是利用或模擬生物分子之間的專一性作用，從復(fù)雜生物樣品中分離和分析特殊物質(zhì)的一種色譜方法。親合色譜的概念可以理解為配位體以共價鍵形式與不溶性載體連接作為色譜介質(zhì)，高選擇性地吸附分離具有生物活性的物質(zhì)，它將傳統(tǒng)親合色譜的專一性與HPLC的快速，穩(wěn)定，檢測方便等優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來。第56頁,共69頁，2024年2月25日，星期天一、親合色譜分離機(jī)理親合色譜是基于樣品中各種物質(zhì)與固定在載體的配基之間的親合作用的差別而實現(xiàn)分離的。親合色譜的過程是待分離物質(zhì)與配基間的親合復(fù)合物形成及其解離的過程。第57頁,共69頁，2024年2月25日，星期天載體LX配基待分離物質(zhì)第58頁,共69頁，2024年2月25日，星期天通過選擇適當(dāng)?shù)牧鲃酉鄬⒔Y(jié)合在配基固定相的組分洗脫下來：a)如果親合復(fù)合物的親合力不強(qiáng)b)當(dāng)配基與被分離組分的親合力較強(qiáng)c)非常緊密地結(jié)合在固定相配基上的物質(zhì)洗脫第59頁,共69頁，2024年2月25日，星期天配基與待分離物質(zhì)的親合作用的強(qiáng)弱可以用親合復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)來表示。這一常數(shù)不宜太低，也不宜太高。太低專一性太差，太高則洗脫困難。R：結(jié)合在親合色譜固定相上的生物分子的活力K：復(fù)合物的離解常數(shù)L：固定化配基的濃度第60頁,共69頁，2024年2月25日，星期天二、親合色譜的固定相親合色譜作為液相色譜的一個重要分支，對于生物大分子的分離具有特殊的意義。原則上講，如果在固相載體上連接一種具有生物特異性的配基，就可以建立一種親合色譜方法，用于分離與配基相對應(yīng)的物質(zhì)。第61頁,共69頁，2024年2月25日，星期天1、有機(jī)高分子類：多孔的硬質(zhì)凝膠——交聯(lián)聚苯乙烯，交聯(lián)聚甲基丙烯酸酯，親水性高聚性等樹脂。優(yōu)點(diǎn)①具有均勻的粒度、較大的孔徑、良好的剛性，廣泛的PH值的適應(yīng)性②對于生物大分子樣品都有較好的相溶性。③填料容易合成第62頁,共69頁，2024年2月25日，星期天2、無機(jī)基質(zhì)①多孔硅膠②可控孔徑玻璃第63頁