分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

《分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)學(xué)》

實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

供口腔、護(hù)理、藥學(xué)各專業(yè)用

（第一版）

佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院編

2008年6月

編寫說(shuō)明

《分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)學(xué)》是一門集生物化學(xué)、免疫學(xué)、生物化學(xué)技術(shù)

和分子生物學(xué)基本實(shí)驗(yàn)、科研探索和醫(yī)學(xué)應(yīng)用于一體的全新的綜合性

實(shí)驗(yàn)課程。其實(shí)驗(yàn)技術(shù)反映現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)發(fā)展趨勢(shì)?！斗肿俞t(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)》

是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的重要組成部分，是醫(yī)學(xué)各本科專業(yè)的專業(yè)基礎(chǔ)

必修課。課程內(nèi)容包括分子醫(yī)學(xué)基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)、基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及綜合和設(shè)

計(jì)性實(shí)驗(yàn)等部分。課程的主要目的一是強(qiáng)化基礎(chǔ)知識(shí)教育，突出基本

技能訓(xùn)練，是使學(xué)生能掌握分子醫(yī)學(xué)的經(jīng)典理論和基本實(shí)驗(yàn)，二是培

養(yǎng)學(xué)生綜合性素質(zhì)，開(kāi)發(fā)學(xué)生的科研潛能和創(chuàng)新思維。開(kāi)設(shè)分子醫(yī)學(xué)

實(shí)驗(yàn)學(xué)的目的在于：1、驗(yàn)證和鞏固理論知識(shí)，加深對(duì)理論知識(shí)的全

面理解，加強(qiáng)記憶。2、通過(guò)實(shí)驗(yàn)，掌握分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)學(xué)的基本操作

技術(shù)，掌握層析法，電泳法,分光光度法和生物大分子制備等常用的實(shí)

驗(yàn)方法的基本原理，熟悉分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)的一般知識(shí)。3、培養(yǎng)學(xué)生觀

察、比較、思考及分析問(wèn)題和解決問(wèn)題的能力，使學(xué)生具備一定的動(dòng)

手操作能力、創(chuàng)新能力培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)、認(rèn)真工作態(tài)度及理論聯(lián)

系實(shí)際、實(shí)事求是的工作作風(fēng)。

本實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)11個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目涵蓋了分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)學(xué)中沉淀、離心、

層析、電泳、分光光度測(cè)定等分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本方法，可依實(shí)驗(yàn)所

需時(shí)間作合理組合實(shí)驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件和教學(xué)安排適時(shí)開(kāi)課。

實(shí)驗(yàn)室規(guī)則

1.實(shí)驗(yàn)前必須預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)和相關(guān)理論知識(shí)，明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒃?/p>

理、預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果、操作關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)，計(jì)劃安排實(shí)驗(yàn)工作

時(shí)間。

2.穿白大衣準(zhǔn)時(shí)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，保持實(shí)驗(yàn)室整潔安靜，不得談笑和

大聲說(shuō)話，不準(zhǔn)做與實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)的事情。

3.實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)持“三嚴(yán)”作風(fēng)——態(tài)度嚴(yán)謹(jǐn)、思維嚴(yán)密、操作嚴(yán)格。

實(shí)驗(yàn)中認(rèn)真、仔細(xì)觀察實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和結(jié)果，及時(shí)如實(shí)的做

好原始記錄。實(shí)驗(yàn)失敗須重做。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行科學(xué)分析，寫好實(shí)

驗(yàn)報(bào)告，交指導(dǎo)教師批閱。

4.注意安全，不得擅自離開(kāi)。使用易燃、易爆、有毒試劑和材料

進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，防止火災(zāi)、中毒、污染、觸電等

事故發(fā)生，一旦發(fā)生，果斷處理并立即報(bào)告教師

5.愛(ài)護(hù)公物，防止損壞，若有損壞及時(shí)報(bào)告原因并登記。公用儀

器就原處使用，了解使用方法及遵守操作規(guī)程，使用后必須在儀器登

記本上登記并簽名。公用試劑就近量取、用畢隨時(shí)放回原處。要節(jié)約

水、電、煤氣及試劑藥品

6.實(shí)驗(yàn)結(jié)束，洗凈器材，清整實(shí)驗(yàn)室，打掃衛(wèi)生，檢查門、窗、

水、電和煤氣的安全。

目錄

實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)室基本知識(shí)和技術(shù)(5)

實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)濃度測(cè)定(雙縮胭法)(21)

實(shí)驗(yàn)三醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)(23)

附：電泳技術(shù)(27)

實(shí)驗(yàn)四血漿清蛋白的分離純化與鑒定(35)

附：層析技術(shù)(37)

實(shí)驗(yàn)五胰島素及腎上腺素對(duì)血糖濃度的影響(45)

實(shí)驗(yàn)六脫氧核糖核酸(DNA)的提取及成分鑒定(48)

實(shí)驗(yàn)七質(zhì)粒DNA提取與純化(51)

實(shí)驗(yàn)八DNA重組質(zhì)粒的設(shè)計(jì)與構(gòu)建(54)

實(shí)驗(yàn)九凝集試驗(yàn)(61)

實(shí)驗(yàn)十肝功能組合實(shí)驗(yàn)(65)

附I：血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)測(cè)定

附2：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

實(shí)驗(yàn)十一免疫血清的制備(71)

實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)室基本知識(shí)和技術(shù)

(Thebasicknowledgeandtechnologyoflab)

【目的和要求】

1.掌握各種基本的生化技術(shù)、常用儀器的分類、使用及注意事項(xiàng)

2.熟悉生化實(shí)驗(yàn)室規(guī)則

3.清點(diǎn)洗刷實(shí)驗(yàn)用具。

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】

1.實(shí)驗(yàn)室規(guī)則

2.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)各種基本技術(shù)

3.722型分光光度計(jì)的使用

4.實(shí)驗(yàn)記錄和實(shí)驗(yàn)報(bào)告

【儀器、設(shè)備】

1.燒杯

2.試管

3.刻度吸量管

4.離心管

5.滴管

6.攪棒

7.槍式移液器及其配適吸頭

8.混勻器

9.恒溫水浴箱

10.離心機(jī)

11.722型分光光度計(jì)，721型分光光度計(jì)

第一部分基本知識(shí)與操作

一、常用的玻璃儀器

(-)分類：常用的玻璃儀器分類有量器和容器，“量器”主要包括：量筒、量杯、容量

瓶、吸管等?！叭萜鳌敝饕袩?、燒杯、試管、試劑瓶、離心管等。量器有量入式和量出

式兩種形式?！傲咳胧健庇谩癟C”、“E”、“人”表示，定量標(biāo)記由下往上遞增，測(cè)量注入

量器中的液體；“量出式”用“TD”、“A”表示；定量標(biāo)記由上而下遞增；測(cè)量從量器中傾

出的液體。

(-)玻璃儀器的洗滌、干燥

1、洗滌液：

①洗潔精，肥皂水，洗衣粉。

②玻璃儀器專用洗滌液：主要成份為中性稀氯氧化劑，上海II化研究所出品

2、洗滌的要求與步驟：

要求：潔凈的玻璃器皿表面應(yīng)不掛任何水滴。

步驟：

不凈的器皿

洗衣粉或肥皂水刷洗

自來(lái)水沖凈

達(dá)到要求？

是浸入洗液（數(shù)小I時(shí)至過(guò)夜）

I

.自來(lái)水沖凈

蒸儲(chǔ)水涮洗2-3次?—1

（其目的是去除自來(lái)水中的雜質(zhì)，故應(yīng)少量多次，全面充分）

I

烤干或晾干、備用

注意：

對(duì)使用過(guò)的儀器應(yīng)養(yǎng)成及時(shí)清洗的習(xí)慣，特別是血液分析時(shí)用以吸取血液樣本的

吸管，用過(guò)后應(yīng)當(dāng)立即用水將所沾的血液沖去，否則放置過(guò)久，血液干燥硬結(jié)，就很不容易

清除。

①新購(gòu)置的玻儀：合成洗滌劑洗刷--?OUmol/L鹽酸浸泡（去除游離堿）2-6

小時(shí)-一自來(lái)水沖洗-fDS沖洗2一—3次。

②-一般容器：如試管、燒杯、三角燒瓶等。流水沖洗-一合成洗滌劑洗刷--?自來(lái)

水多次沖洗-一DS沖洗。

③容量分析儀器：如吸管、容量瓶、量筒、滴定管等。使用后立即浸泡水中。自

來(lái)水多次沖洗ff瀝干一f銘酸洗液浸泡數(shù)小時(shí)一一自來(lái)水多次沖洗一一DS沖洗2一—

3次。（不能刷洗）

④比色杯：用畢立即用DS反復(fù)沖洗。洗不凈時(shí)，用鹽酸沖洗，再用自來(lái)水沖洗

和蒸儲(chǔ)水沖洗。避免用堿液或強(qiáng)氧化劑清洗，切忌用試管刷或粗糙紙?jiān)嚥?/p>

3、玻璃儀器的干燥

一般的玻璃儀器均可洗凈后倒置架上，讓其水分蒸發(fā)自然干燥，如需迅速干燥者應(yīng)按儀器

的不同類型按下述不同方法處理：

①試管、離心管、燒杯、燒瓶等普通玻璃器皿可置烤箱中100-105℃烘烤

②少量?jī)x器如需急用也可在電爐上或酒精燈上烘烤。烘烤時(shí)應(yīng)將器皿時(shí)時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)，務(wù)使受

熱緩慢且均勻，并將管口（或杯口）傾斜向下，以便水蒸氣冷凝成水滴,，順口流出，不致使水

滴接觸烘熱了的器壁而使儀器爆裂。

③使用電吹風(fēng)干燥一般玻璃儀器也很便利常用。

④下列玻璃儀器應(yīng)避免烘烤：

各種計(jì)量玻儀：不可烘烤，自然干燥（容易造成器壁變形而致容量不準(zhǔn)）。常用定量吸

管很難自然干燥，可在80至100℃烘箱烤干。

厚壁玻儀（研缽、量筒比色杯：等）及結(jié)構(gòu)復(fù)查的玻儀：易在烘烤時(shí)發(fā)生破裂，不可烘

烤，自然干燥。

（自然干燥適應(yīng)于不急于使用和各種計(jì)量玻儀；烘烤干燥除結(jié)構(gòu)復(fù)雜、厚壁及計(jì)量玻儀外，

均可。溫度在120℃,刻度吸管溫度應(yīng)小于10

二、常規(guī)操作技術(shù)及注意

（-）移液操作

用于移液操作的有奧氏吸管、移液管、刻度吸管三種吸量管及槍式移液器。

________________三種吸量管比較________________________________

奧氏吸管移液管刻度吸管

特點(diǎn)管中有?球形膨起管中有棱形膨出直筒狀

只有一個(gè)刻度只有一個(gè)刻度有多個(gè)刻度

準(zhǔn)確度最I(lǐng)WJ次之再次之

應(yīng)用適用于吸取標(biāo)準(zhǔn)液吸取標(biāo)準(zhǔn)液生化實(shí)驗(yàn)中廣泛使用

或粘稠性血標(biāo)本

管尖液吹不吹吹（完全流出式）

停留15秒不吹（不完全流出式）

流速愈慢愈好慢流出

快流出

1、吸量管的使用

①吸量管的選擇：

-在一次完成轉(zhuǎn)移的前提下，應(yīng)選用容量較小的吸量管

?對(duì)于同一次實(shí)驗(yàn)中同一種試劑的移取，應(yīng)選用同一支吸量管

②操作（見(jiàn)圖1—1）

?用洗耳球?qū)⒁后w吸至超過(guò)標(biāo)線

?移開(kāi)洗耳球，迅速用食指壓緊管口

?必要時(shí)將管尖端外圍拭凈

?調(diào)液面至標(biāo)線

?放開(kāi)食指，使液體流入容器

?將最后液滴沿器壁而下或吹出

③讀數(shù)（見(jiàn)圖1—2）

?吸量管保持垂直

?視線與液面應(yīng)水平

?管中液面與刻度線應(yīng)呈切線

使用注意：持管方式；管尖插入液血的深度；吸液；讀數(shù)（認(rèn)刻度，準(zhǔn)確讀數(shù)，注意

無(wú)色液與有色液讀數(shù)之區(qū)別）；放液（吹與不吹之分，注：對(duì)于刻度由上至下的吸量管應(yīng)盡

量使用上端刻度管尖殘液是否需吹出，看清標(biāo)記）。

2、槍式定量移液器的使用

①搶式移液器的結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖3）（1.液體吸放鈕2.體積選取鈕3.體積、顯示4.槍頭

排放鈕5.槍頭排放器6.槍頭接嘴）

其內(nèi)部柱塞分2段行程，第1檔為吸液，第2檔為放液，手感十分清楚。

種類：固定式和可調(diào)式

規(guī)格：0.5——10000畝不等

②操作(見(jiàn)圖1一4)

?正式使用之前，要連續(xù)按動(dòng)數(shù)次，使管內(nèi)空氣同工作環(huán)境空氣交換，保持管內(nèi)工作

負(fù)壓恒定

?調(diào)體積選取鈕至所需值，在移液管下端插上塑料吸嘴，輕輕扭轉(zhuǎn)以保證所密

?垂直持握槍式移液器外殼，按下大拇指至第1檔

?將吸嘴垂直地浸入所需取樣液內(nèi)，深度為2~3毫米，徐徐松開(kāi)大拇指，使之返回原

來(lái)位置。

?停留1一一2秒，平緩地將移液管取出，同時(shí)應(yīng)避免吸嘴與任何東西碰撞。

?將吸液嘴移至加樣容器壁上，緩慢按動(dòng)按手至第一檔，將液體排了。停留1秒(粘

性較高的溶液停留時(shí)間可長(zhǎng)些)。緊接著再將按手按至第二檔，排出吸嘴里的

全部液體。(要求動(dòng)作連)。

?完全排出液體后，小心地連同吸嘴沿著容器壁向上滑動(dòng)取出。

?再放松按手，使之返回原來(lái)位置，即完成一次操作。

如需移取另一樣品，按槍頭排放鈕，更換槍頭

注意：

-移液器是精密量取，不允許將移液器直接與液體接觸。

?不使用時(shí)也應(yīng)插上塑料吸嘴，以免液體或染色液吸入移液器內(nèi)，導(dǎo)致阻塞。

?移取過(guò)程中應(yīng)控制速度，力度。

?塑料吸嘴可經(jīng)受100C高溫高壓消毒。

(-)混勻操作

(1)旋轉(zhuǎn)法：手持容器，使溶液作離心旋轉(zhuǎn)

(2)指彈法：一手執(zhí)試管上端，另一手輕彈試管下部，：使其中液體作渦旋運(yùn)動(dòng)。

(3)攪動(dòng)法：使用玻璃棒攪邊；多用于溶解燒杯中的固體。

(4)混勻器法：將試管置于混勻器的振動(dòng)盤上，逐漸用力下壓，使內(nèi)容物旋轉(zhuǎn)。

(5)倒轉(zhuǎn)混勻：適用于具塞的容器，如容量瓶、具塞量筒及具塞離心管等。操作時(shí)，將容

器反復(fù)倒轉(zhuǎn)。試管內(nèi)的液量太多，也可利用倒轉(zhuǎn)混勻法，外面包以玻璃紙塞住管口，然后用

手指按住橡皮塞將試管反復(fù)倒轉(zhuǎn)，溶液即可充分混勻。

（6）吸管混勻法：用吸管將溶液反愛(ài)吸吹數(shù)次，以達(dá)到混勻的目的。

（三）加熱與保溫操作

1、加熱（見(jiàn)圖1-5；圖1~6）

2、保溫

①使用恒溫水浴箱，調(diào)節(jié)溫度設(shè)定鈕至需要的溫度。

②水浴箱中水要足量。

③實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)隨時(shí)監(jiān)測(cè)溫度，并及時(shí)調(diào)節(jié)。

圖1-4槍式移液器操作圖解

①直接加熱②水浴加熱

圖1-5直接加熱圖1-6水浴加熱

（管口切勿對(duì)著自己或他人）（加熱用水要適量）

（四）離心操作

離心沉淀法：

當(dāng)顆粒小而不均一，沉淀粘稠或容積小又需精確定量時(shí)，往往采用離心沉降法。

1、離心前檢查：

①取出所有套管，起動(dòng)空載的離心機(jī)，看是否轉(zhuǎn)動(dòng)平穩(wěn)。

②檢查套管有無(wú)軟墊，是否完好，內(nèi)部有無(wú)異物。

③離心管與套管是否匹配。

2、平衡：

將一對(duì)離心管放入套管，置于天平兩側(cè)，用滴管較輕一側(cè)的離心管與套管之間加水至兩

側(cè)平衡（離心管及其內(nèi)溶液量不能差別過(guò)大）

3、離心：

將等重的兩管置于離心機(jī)中的對(duì)稱位置，調(diào)轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)鈕，逐漸增加轉(zhuǎn)速至所需值，計(jì)時(shí)，

離心結(jié)束后，將套管中的水倒凈，所有套管放回離心機(jī)中。

4、使用注意

①根據(jù)需要選擇合適的轉(zhuǎn)速、時(shí)間；

②選擇合適的離心管，做到對(duì)稱平衡；

③啟動(dòng)時(shí)應(yīng)由低速慢慢加至所需速度

④離心結(jié)束關(guān)機(jī)后，應(yīng)讓其自然停止，不可用手或其它物品強(qiáng)迫停止

（五）點(diǎn)收儀器

根據(jù)儀器清單?，逐項(xiàng)查點(diǎn)是否完好（如有缺損向教師聲明及時(shí)補(bǔ)充更換）

第二部分分光光度法

當(dāng)光線通過(guò)透明溶液介質(zhì)時(shí)，其幅射能量有部分被溶液吸收，一部分透過(guò)，所以光線

射出溶液介質(zhì)之后光能被減少。對(duì)溶液來(lái)說(shuō)，溶液呈現(xiàn)不同的顏色，是由于溶液中的質(zhì)點(diǎn)（分

子或離子）選擇性地吸收某種顏色的光所引起的。如果各種顏色的透過(guò)程度相同，這種物質(zhì)

就是無(wú)色透明的，若只讓一部分波長(zhǎng)的光透過(guò)，其它波長(zhǎng)的光被吸收，則溶液就呈現(xiàn)出透過(guò)

光的顏色，并與被吸收的光的顏色完全互補(bǔ)。任何一種溶液，對(duì)不同波長(zhǎng)的光的吸收程度是

不相等的，一些有色物質(zhì)可以選擇性地吸收一部分可見(jiàn)光區(qū)的光的能量而呈現(xiàn)不同顏色，一

些物質(zhì)卻能特征性地選擇吸收紫外線的能量。物質(zhì)吸收由光源發(fā)出的某些波長(zhǎng)的光可形成特

定的吸收光譜。山于物質(zhì)的吸收光譜與物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，而且在一定條件下其吸收程度

與該物質(zhì)的濃度成正比，所以可利用物質(zhì)的特定吸收光譜對(duì)其進(jìn)行定性和定量分析。分光光

度法是利用各種物質(zhì)所具有的這種吸收特征所建立起來(lái)的分析方法。

一、分光光度分析法的基本原理

勞伯一比爾定律(Lambert-Beerlaw)是討論吸收光能與溶液濃度和溶質(zhì)層厚度之間

關(guān)系的基本定律，是分光分析的理論基礎(chǔ)。

勞伯一比爾定律適用于可見(jiàn)光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體

B2-1光線通過(guò)溶液介質(zhì)示意圖

(一)Lambert氏定律

一束單色光通過(guò)透明溶液介質(zhì)時(shí)，光能被吸收一部分，被吸收光能的量與溶液介質(zhì)厚

度有一定比例關(guān)系(見(jiàn)圖2—1)。表達(dá)式為

logy=kL

這里卜為入射光強(qiáng)度

I為通過(guò)溶液介質(zhì)后的光強(qiáng)度

L為溶液介質(zhì)的徑長(zhǎng)(pathlength)

k為吸光系數(shù)(absorptioncoefficient)(g,cm-1)

(二)Beer氏定律

以溶液介質(zhì)濃度變化代替溶液介質(zhì)厚度的改變，光能的吸收與濃度改變有類同的關(guān)系，

即一束單色光通過(guò)溶液介質(zhì)時(shí)，光能被溶液介質(zhì)吸收?部分，吸收多少與溶液介質(zhì)濃度有一

定的比例關(guān)系。

log4=kC

⑵

得出下式：1

這里C(Concentration)為溶液介質(zhì)的濃度(g?L1)

log~~=kCL⑶

將Lambent氏定律和Beer氏定律合并，即(1)和(2)合并為1

令A(yù)=logjT=-r

則A=-1081或人=女(^…(4)

式中A(Absorbance)為吸光度

T(Transmittance)為透光度

(4)式也可表達(dá)為A=eCb(5)

式中e(epsilon)稱之摩爾吸光率(Molarabsorptivity)(mol/L'cm1)

C(concentration)濃度(mol/L)

b(pathlength)溶液樣品的長(zhǎng)度cm(或比色皿內(nèi)徑長(zhǎng)cm)

(5)式為lambert—Beer定律的物理表示式，其含義為一束單色光通過(guò)溶液介質(zhì)后，

光能被吸收一部分，吸收多少與溶液的濃度和厚度成正比。此式為分光分析法的基本計(jì)算式。

透光度與溶液濃度的關(guān)系透光度與溶液濃度的關(guān)系吸光度與溶液濃度的關(guān)系

(方格坐標(biāo)紙)(半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙),(方格坐標(biāo)紙)

S2-2吸光度(A)、透光度(T)和溶液濃度(C)的關(guān)系

圖2—2表明，在溶液介質(zhì)厚度一定的情況下，吸光度(A)、透光度(T)和溶液介質(zhì)濃度

(C)之間的關(guān)系。

摩爾吸光率(e)實(shí)際上是物質(zhì)在單位濃變和單位厚度下對(duì)入射光的吸光度，在一定波長(zhǎng)

下，e越大表示物質(zhì)對(duì)光的吸收越強(qiáng)。

二、分光光度法的定性定量方法

許多對(duì)光有吸收的物質(zhì)可以直接用分光光度法進(jìn)行定量分析：一些對(duì)光，包括紫外、

可見(jiàn)或近紅外都無(wú)吸收的物質(zhì)亦可通過(guò)和某些化學(xué)試劑作用而呈色，在一定的反應(yīng)條件下和

一定的濃度范圍內(nèi)，溶液顏色的深淺(對(duì)光吸收的程度)和該溶液中顯色物質(zhì)的濃度呈正比。

(一)測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

表2-2測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

選用分光波長(zhǎng)選用分光波長(zhǎng)

待測(cè)溶液顏色待測(cè)溶液顏色

范圍(nm)范圍(nm)

—

綠400-420紫青540-560

綠帶黃430-440藍(lán)

---570~600

黃440?450藍(lán)帶綠600~630

橙紅450-480綠帶藍(lán)630?760

紅490-530

使用分光法測(cè)定溶液中物質(zhì)的含量，首先耍選擇最適單色波長(zhǎng)，因?yàn)橹挥幸阅鼙蝗芤?/p>

吸收的光束作為入射光才能符合Lambert—Beer定律。測(cè)定有色物質(zhì)時(shí)，不同顏色的待測(cè)溶

液，則應(yīng)選擇不同波長(zhǎng)的單色光束。在分光光度計(jì)上,單色光波長(zhǎng)的選擇原則一般是使被測(cè)

溶液的單位濃度的吸光度變化最大，同時(shí)還要具有最小的空白及干擾讀數(shù)，借以獲得最高的

靈敏度和正確性。最理想的辦法是對(duì)每種物質(zhì)的測(cè)定都應(yīng)先傲它的光譜吸收曲線及有關(guān)干擾

物的吸收曲線，根據(jù)這些光譜吸收曲線來(lái)選擇最佳測(cè)定波長(zhǎng)。表2—2可供波長(zhǎng)選擇的參考。

(二)分光光度法定量方法

1、利用標(biāo)準(zhǔn)管計(jì)算測(cè)定物含量

最適波長(zhǎng)選定以后可進(jìn)行溶液物質(zhì)含量的測(cè)定。通常都采用對(duì)比測(cè)定法，即以巳知精

確含量的待測(cè)物質(zhì)的溶液作為參考標(biāo)準(zhǔn)物(Cs)和未知待測(cè)樣品(Cx)用同一方法，在同一條件

下、同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，讀取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的吸光度(As)和未知含量的樣品吸光度(Ax),由于標(biāo)準(zhǔn)物

質(zhì)和未知物質(zhì)是同一物質(zhì)，其摩爾吸光率(巨)相同和進(jìn)行測(cè)定用的比色皿內(nèi)徑長(zhǎng)(b)相同即

bs=bx,根據(jù)A=￡Cb式，可得到

As=Cs換算成下式

Cx=髻?Cs

Ax=CxAs

式中Cs是標(biāo)準(zhǔn)管中物質(zhì)的實(shí)際含量，是標(biāo)準(zhǔn)液的濃度與實(shí)際用量的乘積；Cx是測(cè)

定管中物質(zhì)的實(shí)際含量。還應(yīng)換寫到法定單位mmol/L、mg/m1o

2、利用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行換算

配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)的溶液(至少五個(gè))按測(cè)定管同樣方法處理顯色，在選定的波

長(zhǎng)分別測(cè)定各管的吸光度(A),以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(C)為橫坐標(biāo)，在方格坐

標(biāo)紙上作圖，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以后在同樣條件下進(jìn)行測(cè)定時(shí)，測(cè)定被測(cè)溶液的吸光度，從標(biāo)

準(zhǔn)曲線上可找出相應(yīng)的濃度。

根據(jù)Lambert—Beer定律，標(biāo)準(zhǔn)液的濃度在一定范圍內(nèi)與吸光度呈直線關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線

是這種直線關(guān)系的描述，一般認(rèn)為，標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍在測(cè)定物濃度的一半到二倍之間，并使吸

光度在0.05—1.0范圍內(nèi)為宜。

還須注意：曲線制作與測(cè)定管的測(cè)定應(yīng)在同一儀器上進(jìn)行，由于曲線的建立與實(shí)驗(yàn)室

當(dāng)時(shí)的條件如溫度，濕度和氣壓及電壓穩(wěn)定性等有關(guān)，因此標(biāo)準(zhǔn)曲線常因各種變化而需校正

或重做。

3、摩爾吸光率e求取測(cè)定物濃度

當(dāng)濃度為1M/L時(shí)，溶液厚度為1cm,吸光率用￡表示，在已知測(cè)定物的e,則可根

據(jù)下式求得測(cè)定物的物質(zhì)濃度。

C「=—A

t

此計(jì)算法常用于紫外吸收，如核甘酸溶液含量測(cè)定，如UTP在262nm具有最大吸收峰,

利用已知UTP在262nm時(shí)的摩爾吸光率e,讀取待測(cè)UTP溶液吸光度A,即可求出該UTP

濃度。

二種以上被測(cè)物的混合液，也可利用不同e進(jìn)行定量測(cè)定。例如a,b兩種物質(zhì)在波長(zhǎng)

X1時(shí)，摩爾吸光率分別為eal和ebl：,在波長(zhǎng)入2時(shí)摩爾吸光率分別為￡a2和eb2,a

和b混合的溶液在入1時(shí)吸光度為Al,在入2時(shí)的吸光度為A2(圖2—3),各自濃度分別為

Ca和Cb,則

A]=Ea]Ca+eb|Cb

A2=eajCa+tb2cb

解上式，得a,b兩物濃度

G二山內(nèi)-cb2Al

ea2ebi-帆屯

Q=cajA2-ea2Al

Edict-eaatbi

如有三種以上成分的混合液，也可通過(guò)三種不同波長(zhǎng)情況下的吸光度，以各自特有的￡

值，依據(jù)三元一次方程，同樣可求出未分離的三種混合物的各自濃度-'

（三）、物質(zhì)的定性分析

以不同波長(zhǎng)的單色光作為入射光，測(cè)定某一溶液的吸光度，然后以入射光的不同波長(zhǎng)

為橫軸，各相應(yīng)的吸光度為縱軸作圖，可得到溶液的吸收光譜曲線。吸收光譜曲線是物質(zhì)的

特征性曲線，它和分子結(jié)構(gòu)有嚴(yán)格的對(duì)應(yīng)關(guān)系故可作為定性分析的依據(jù)。不同的物質(zhì)，分子

結(jié)構(gòu)不同，其吸收光譜曲線也有其特殊形狀（圖2—4）。

吸.15

光

_0,10

慶

A0.4）5

：00

Xife(nm)

圖2-4維生素B12水溶液的吸收光譜

在吸收光譜中，往往可以找到一個(gè)或幾個(gè)吸收最大值,該處的波長(zhǎng)稱為最大吸收波長(zhǎng)（入

max）。物質(zhì)不同，它們的波長(zhǎng)（nm）最大吸收波長(zhǎng)也往往不同，圖1-4為維生素B12溶液的

吸收光譜曲線。

物質(zhì)用分光分析定性主要依據(jù)吸收光譜存在的特征吸收。

①比較吸收光譜曲線，在相同情況下，吸收光譜曲線不同，表明物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，

因?yàn)椴煌奈镔|(zhì)有各自的特征性曲線。如ATP和GTP都屬于核甘酸，它們的溶液在紫外光

區(qū)均有吸收，但由于化學(xué)結(jié)構(gòu)不很一樣，它們的吸收光譜就有差別。需要注意的是在不同條

件（如選擇不同溶劑）下，即使是同一物質(zhì)也可呈現(xiàn)不同的吸收光譜。

②比較最大的吸收波長(zhǎng)。不同的物質(zhì)可有不同的最大吸收波長(zhǎng)（kmax）。如ATP、GTP、

CTP和UTP的Xmax分別為259nm、253nm、271nm和262nm。Lnlax可作為物質(zhì)定量測(cè)定

的最適波長(zhǎng)，此時(shí)測(cè)定靈敏度最高。有些物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)相近，可產(chǎn)生相同的入max,但它們

的吸收系數(shù)都不一致，可據(jù)此鑒別之。

③比較吸光度比值。可根據(jù)物質(zhì)兩個(gè)或幾個(gè)不同波長(zhǎng)的吸光度比值來(lái)鑒別不同的物質(zhì),

同時(shí)也可檢查物質(zhì)的純度。如DNA溶液kmax為260nm?在260nm的吸收度和在280nm的

吸收度比值為L(zhǎng)8。但溶液中混進(jìn)了蛋白質(zhì)，則比值會(huì)降低（蛋白質(zhì)在280nm處有最大吸收）。

三、分光光度計(jì)基本結(jié)構(gòu)與使用

分光光度計(jì)的類型很多，最常用的是可見(jiàn)分光光度計(jì)和紫外一可見(jiàn)分光光度計(jì)。

各種類型的分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)和原理基本相同，一般包括光源、單色器、比色杯、檢測(cè)

器和顯示器幾大部分。

光源一?單色器一啾縫__?吸收杯__?檢測(cè)器一?顯示器

鹵鴇燈濾光片玻璃杯將光信號(hào)檢流計(jì)

氫燈棱鏡石英杯轉(zhuǎn)換為電信號(hào)微安表

光柵(光電管和數(shù)字顯示器

光電倍增管)

吸收林

狹縫

圖2—3光皮計(jì)或分光光省:計(jì)結(jié)構(gòu)原理

(一)光源

一個(gè)良好的光源要求具備發(fā)光強(qiáng)度高、光亮穩(wěn)定、光譜范圍廣和使用壽命長(zhǎng)等特點(diǎn)?？?/p>

見(jiàn)光分光光度計(jì)常用的光源是采用穩(wěn)壓調(diào)控的鴇燈(tungstenlamp),能發(fā)射出350nm?2500nm

波長(zhǎng)范圍的連續(xù)光譜，適用于340-900nm范圍的光源?，F(xiàn)在常用的鹵鴿燈。紫外光光度常

用氫燈(hydrogenlamp)作光源，其發(fā)射波長(zhǎng)的范圍為150nm?400nm。它適用于做200-360nm

的紫外分光分析。

(-)單色器

將來(lái)自光源的復(fù)合光分散為單色光的裝置稱為分光系統(tǒng)或單色器。分光光度法測(cè)定某?

物質(zhì)的吸光度需要在某一特定波長(zhǎng)下進(jìn)行，單色光器的作用在于根據(jù)需要選擇一定波長(zhǎng)范圍

的單色光。在實(shí)際工作中欲選擇出單個(gè)某波長(zhǎng)的光

線是困難的。所謂單色光是指在此波長(zhǎng)有最大發(fā)射,

而在相鄰較長(zhǎng)和較短波長(zhǎng)范圍內(nèi)的發(fā)射能量較少而

言。單色光的波長(zhǎng)范圍愈窄，儀器的敏感度愈高，

測(cè)量的結(jié)果愈可靠。

單色器可分為濾光片、棱鏡和光柵。濾光片可

分為吸收濾光片、截止濾光片、復(fù)合濾光片和干涉

濾光片。棱鏡是用玻璃或石英材料制成的一種分光

裝置。其原理是利用光從一種介質(zhì)進(jìn)入另一種介質(zhì)

時(shí)，光的波長(zhǎng)不同在棱鏡內(nèi)的傳播速度不同，其折

射率不同而將不同波長(zhǎng)的光分開(kāi)。見(jiàn)圖2—4

通過(guò)單色光器的發(fā)射光的強(qiáng)度可能過(guò)強(qiáng)也可能

過(guò)弱不利于進(jìn)一步檢測(cè)。狹縫是由一對(duì)隔板在光通

路上形成的狹縫。通過(guò)調(diào)節(jié)狹縫的大小來(lái)調(diào)節(jié)入射

單色光強(qiáng)度并使入射光形成平行光線，以適應(yīng)檢測(cè)器的需要。光電比色計(jì)的狹縫是固定的,

而光度計(jì)和分光光度計(jì)的狹縫大小是可調(diào)的。

（三）比色杯

比色杯又吸收杯，是光度測(cè)量系統(tǒng)的最重要部分之一。在可見(jiàn)光范圍內(nèi)測(cè)量時(shí)選用光

學(xué)玻璃吸收杯，在紫外線范圍內(nèi)測(cè)量時(shí)要選用石英吸收杯。比色杯的光徑0.1?10cm,?般

為1cm。注意保護(hù)比色杯的質(zhì)量是取得好的分析結(jié)果的重要條件之一。不得用粗糙、堅(jiān)硬

物質(zhì)接觸吸收杯，不能用手指握取吸收杯的光學(xué)面；用后要用水及時(shí)沖洗，不得殘留測(cè)定

液，尤其是蛋白質(zhì)和核酸溶液。

（四）檢測(cè)器

硒光電池、光電管或光電倍增管等光電元件常用來(lái)作為受光器，將通過(guò)比色杯的光信號(hào)

轉(zhuǎn)變成電信號(hào)。進(jìn)一步再用適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)量所產(chǎn)生的電流。

（五）顯示器

顯示器是將光電管或光電倍增管放大的電流通過(guò)儀表顯示出來(lái)的裝置。常用的顯示器是

有檢流計(jì)、微安表、記錄器和數(shù)字顯示器。

四、幾種常用的國(guó)產(chǎn)分光光度計(jì)

（-）72—1型分光光度計(jì)該機(jī)光譜范圍在360—800nm（可見(jiàn)光區(qū)），該機(jī)靈敏度較高，而

且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作方便，可用于有色物質(zhì)溶液的測(cè)定。

1、72—1型分光光度計(jì)光路圖和外形圖

光源燈

光電窗￡祖轉(zhuǎn)

1.波長(zhǎng)選擇鈕2.“0”電位鈕3.“100”電位鈕4.比色杯拉桿5.靈敏選擇鈕6.電

源開(kāi)關(guān)7.電源指示燈8.暗箱蓋9.讀數(shù)表10.波長(zhǎng)讀數(shù)窗

2.使用方法

(1)接通電源,打開(kāi)機(jī)器開(kāi)關(guān)，打開(kāi)箱蓋，預(yù)熱10分鐘。

(2)將空白液或?qū)φ找?往往是溶解測(cè)定物質(zhì)的溶劑)及測(cè)定液分別裝入比色杯(3/4體

積并用軟紙擦清外壁,放入樣品室內(nèi)。

(3)調(diào)節(jié)電流計(jì)上零點(diǎn)調(diào)節(jié)器，使讀數(shù)盤上指針的吸光度為8或透光率為0,調(diào)節(jié)測(cè)定

所用波長(zhǎng)。

(4)蓋上箱蓋，光徑開(kāi)關(guān)自動(dòng)打開(kāi)。轉(zhuǎn)動(dòng)光量調(diào)節(jié)器使空白對(duì)照管的吸光度為0,或透

光率為100%,待讀數(shù)指針?lè)€(wěn)定后,逐步拉出樣品盒滑桿，通過(guò)讀數(shù)的指針，讀取測(cè)定管上的

吸光度。

有時(shí)需調(diào)節(jié)靈敏度開(kāi)關(guān),才能正確讀得吸光度。此時(shí)應(yīng)重新轉(zhuǎn)動(dòng)零點(diǎn)調(diào)節(jié)器至吸光度

為8。

(5)讀數(shù)完畢,打開(kāi)儀器蓋板，關(guān)閉開(kāi)關(guān),將比色杯沖洗干凈。

(-)72-2型分光光度計(jì)該機(jī)光度范圍在360?800nm，特用單光束、衍射光柵光學(xué)

系統(tǒng)，靈敏度高。

1.72-2型分光光度計(jì)光路圖和外形圖

對(duì)

數(shù)

放

大

3

S

.數(shù)顯2.消零鈕開(kāi)關(guān)吸調(diào)電5.鈕

1字示器光旋3.選擇4.光度斜率位器濃度旋

.室電源開(kāi)波手輪0樣架手11%

6光源7.關(guān)8.長(zhǎng)9.波長(zhǎng)刻度窗1.試?yán)?100

.0T旋鈕1.靈調(diào)旋鈕.器

T旋鈕12%3敏度節(jié)14干燥

方

、使

2用法

①電指亮擇開(kāi)”，長(zhǎng)調(diào)試用波儀器預(yù)熱2

開(kāi)啟源，示燈，選關(guān)置于“T波置測(cè)長(zhǎng)。0分鐘。

②打試樣蓋關(guān)閉調(diào)，數(shù)“0樣

開(kāi)室（光門自動(dòng)）。節(jié)“0”旋鈕使字顯示為00.”蓋上試室

旋

蓋將比處于蒸正位置光電管受光，調(diào)節(jié)透光率1鈕使字

，色皿架儲(chǔ)水校，使“00%”，數(shù)

顯示為“.0”

100。

選擇。調(diào)節(jié)使得字顯為0將被

③將開(kāi)關(guān)置于“A”消光零旋鈕，數(shù)示“.00”，然后測(cè)樣

品移路顯值為測(cè)品吸光的

入光，示即被樣的度值。

大幅度改變測(cè)在調(diào)“0和“00”稍等，光能化

④如果試波長(zhǎng)時(shí)，整”1%后片刻（因量變

光

，受后響緩需平時(shí)穩(wěn)定，00

急劇光電管光應(yīng)慢，一段響應(yīng)衡間），當(dāng)后重新調(diào)整“0”和1%

工

即可作。

⑤每臺(tái)配套的，不與其儀上色單調(diào)

儀器所比色皿能它器的比皿個(gè)換。

長(zhǎng)測(cè)試開(kāi)關(guān)“T"戴和操

⑥換一波時(shí)，應(yīng)將選擇置，（2）（3）作。

測(cè)試，關(guān)，電，將比色皿沖。

⑦完畢關(guān)閉開(kāi)源洗干凈

(三)UV—7