藥典高效液相色譜

藥典高效液相色譜定義高效液相色譜法

系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進行分離測定的色譜方法。

注入的供試品，由流動相帶入柱內,各組分在柱內被分離，并依次進入檢測器，由積分儀或數(shù)據處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號。2第2頁,共28頁，2024年2月25日，星期天一、對儀器的一般要求和色譜條件所用的儀器為高效液相色譜儀。儀器應定期檢定并符合有關規(guī)定

3儀器包括：儲液器泵進樣器

色譜柱

檢測器第3頁,共28頁，2024年2月25日，星期天色譜柱反相色譜系統(tǒng)使用非極性填充劑，常用的色譜柱填充劑為化學鍵合硅膠，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠也有使用。正相色譜系統(tǒng)使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換色譜系統(tǒng)使用離子交換填充劑；分子排阻色譜系統(tǒng)使用凝膠或高分子多孔微球等填充劑；對映異構體的分離通常使用手性填充劑。4第4頁,共28頁，2024年2月25日，星期天色譜柱填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、含炭量和鍵合類型等）以及色譜柱的填充，直接影響供試品的保留行為和分離效果。分析分子量小于2000的化合物應選擇孔徑在15nm以下的填料，分析分子量大于2000的化合物則應選擇孔徑在30nm以上的填料。普通分析柱的填充劑粒徑一般在3~10μm之間。粒徑更小（約2μm）的填充劑常用于填裝微徑柱（內徑約2mm）。5第5頁,共28頁，2024年2月25日，星期天注意以硅膠為載體的鍵合固定相的使用溫度通常不超過40℃，為改善分離效果可適當提高色譜柱的使用溫度，但不宜超過60℃流動相的PH值應控制在2~8的。當PH大于8時，可使載體硅膠溶解；當PH小于2時，與硅膠相連的化學鍵合相易水解脫落。當色譜系統(tǒng)中需使用PH值大于8的流動相時，應選用耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠填充劑、有機-無機雜化填充劑當需使用PH值小于2的流動相時，應選用耐酸的填充劑，如具有大體積側鏈能產生空間位阻保護作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠填充劑6第6頁,共28頁，2024年2月25日，星期天檢測器最常用的檢測器為紫外檢測器，包括二極管陣列檢測器、其他常見的檢測器有熒光檢測器、示差折光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、電化學檢測器和質譜檢測器等。紫外、熒光、電化學檢測器為選擇性檢測器，其響應值不僅與供試品溶液的濃度有關，還與化合物的結構有關；示差折光檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器為通用型檢測器，對所有的化合物均有響應；蒸發(fā)光散檢測器對結構類似的化合物，其響應值幾乎僅與供試品的質量有關；二極管陣列檢測器可以同時記錄供試品的吸收光譜，故可用于供試品的光譜鑒定和色譜峰的純度檢查。7第7頁,共28頁，2024年2月25日，星期天檢測器紫外、熒光、電化學和示差折光檢測器的響應值與供試品溶液的濃度在一定范圍內呈線性關系，但蒸發(fā)光散射檢測器響應值與供試品溶液的濃度通常呈指數(shù)關系，故進行計算時，一般需經對數(shù)轉換。不同的檢測器，對流動相的要求不同。如采用紫外檢測器，所用流動相應符合紫外—可見分光光度法（附錄VA）項下對溶劑的要求；采用低波長檢測時，還應考慮有機相中有機溶劑的截止使用波長，并選用色譜級有機溶劑。蒸發(fā)光散射檢測器和質譜檢測器通常不允許使用含不揮發(fā)鹽組分的流動相。8第8頁,共28頁，2024年2月25日，星期天二極管陣列檢測器（diodearraydetector，DAD）第9頁,共28頁，2024年2月25日，星期天特點：在任一時間內，均可同時得到物質在不同波長下的吸收情況，即三維圖譜第10頁,共28頁，2024年2月25日，星期天多組分混合物的三維圖譜第11頁,共28頁，2024年2月25日，星期天第12頁,共28頁，2024年2月25日，星期天第13頁,共28頁，2024年2月25日，星期天流動相反相色譜系統(tǒng)的流動相首選甲醇-水系統(tǒng)（采用紫外末端波長檢測時，首選乙腈-水系統(tǒng)），如經試用不適合時，再選用其他溶劑系統(tǒng)。應盡可能少用含有緩沖液的流動相由于C18鏈在水相環(huán)境中不易保持伸展狀態(tài)，故對于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動相中有機溶劑的比例通常應不低于5%，否則C18鏈的隨機卷曲將導致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。14第14頁,共28頁，2024年2月25日，星期天二、系統(tǒng)適用性試驗

色譜系統(tǒng)的適用性試驗通包括理論板數(shù)分離度重復性拖尾因子

分離度和重復性是尤為重要。15第15頁,共28頁，2024年2月25日，星期天色譜柱的理論板數(shù)(n)用于評價色譜柱的分離效能。由于不同物質在同一色譜柱上的色譜行為不同，采用理論板數(shù)作為衡量柱效能的指標時，應指明測定物質，一般為待測組分或內標物質的理論板數(shù)。在規(guī)定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項下規(guī)定的內標物質溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分峰或內標物質峰的保留時間tR（以分鐘或長度計，下同，但應取相同單位）和峰寬（W）或半高峰寬（Wh/2）,按n＝16（tR/w）2或n=5.54(tR/Wh/2)2計算色譜柱的理論板數(shù)。16第16頁,共28頁，2024年2月25日，星期天分離度(R)

用于評價待測組分與相鄰共存物或難分離物質之間的分離程度，是衡量色譜系統(tǒng)效能的關鍵指標。可以通過測定待測物質與已知雜質的分離度，也可以通過測定待測組分與某一添加的指標性成分（內標物質或其他難分離物質）的分離度，或將供試品或對照品用適當?shù)姆椒ń到?，通過測定待測組分與某一降解產物的分離度，對色譜系統(tǒng)進行評價與控制。17第17頁,共28頁，2024年2月25日，星期天無論是定性鑒別還是定量分析，均要求待測峰與其他峰、內標峰或特定的雜質對照峰之間有較好的分離度。除另外有規(guī)定外，待測組分與相鄰共存物之間的分離度應大于1.5。分離度的計算公式為：2(tR2－tR1)2(tR2－tR1)R＝───────

或R＝──────────W1＋W21.70（W1，h/2＋W2,h/2）式中tR2為相鄰兩峰中后一峰的保留時間；tR1為相鄰兩峰中前一峰的保留時間；W1、W2及W1，h/2、W2,h/2分別為此相鄰兩峰的峰寬及半高峰寬。當對測定結果有異議時，色譜柱的理論板數(shù)（n）和分離度（R）均以峰寬（W）的計算結果為準。18第18頁,共28頁，2024年2月25日，星期天重復性用于評價連續(xù)進樣中，色譜系統(tǒng)響應值的重復性能。采用外標法時，通常取各品種項下的對照品溶液，連續(xù)進樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標準偏差應不大于2.0％；采用內標法時，通常配制相當于80％、100％和120％的對照品溶液，加入規(guī)定量的內標溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別至少進樣2次，計算平均校正因子。其相對標準偏差也應不大于2.0％。19第19頁,共28頁，2024年2月25日，星期天拖尾因子（T）用于評價色譜峰的對稱性。為保證分離效果和測量精度，應檢查待測峰的拖尾因子是否符合各品種項下的規(guī)定。拖尾因子計算公式為：W0.05hT＝──────2d1式中W0.05h為0.05峰高處的峰寬；d1為峰極大至峰前沿之間的距離。除另有規(guī)定外，峰高法定量時T應在0.95～1.05之間。峰面積法測定時，若拖尾嚴重，將影響峰面積的準確測量。必要時，應在各品種項下對拖尾因子作出規(guī)定。20第20頁,共28頁，2024年2月25日，星期天測定法

(1)內標法按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和內標物質，分別配成溶液，精密量取各適量，混合配成校正因子測定用的對照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量對照品和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算校正因子：As／Cs校正因子（f）＝─────AR／CR式中As為內標物質的峰面積或峰高；AR為對照品的峰面積或峰高；Cs為內標物質的濃度；CR為對照品的濃度。21第21頁,共28頁，2024年2月25日，星期天再取各品種項下含有內標物質的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算含量：Ax含量（Cx）＝f·─────As內／Cs內式中Ax為供試品（或其雜質）峰面積或峰高；Cx為供試品（或其雜質）的濃度；As內為內標物質的峰面積或峰高；Cs內為內標物質的濃度；f為較正因子。22第22頁,共28頁，2024年2月25日，星期天（2）外標法：按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品溶液和供試品溶液中待測成分的峰面積（或峰高），按下式計算含量含量（cX）=cR(AX/AR)式中各符號意義同上。由于微量注射器不易精確控制進樣量，當采用外標法測定供試品中成分或雜質含量時，以定量環(huán)或或自動進樣器進樣為好。23第23頁,共28頁，2024年2月25日，星期天（3）面積歸一化法按各品種項下的規(guī)定，配制供試品溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量各峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計算各峰面積占總峰面積的百分率。用于雜質檢查時，由于峰面積歸一化法測定誤差大，因此，通常只能用于粗略考察供試品中的雜質含量。除另有規(guī)定外，一般不宜用于微量雜質的檢查。

24第24頁,共28頁，2024年2月25日，星期天美國藥典第24版通法中的高效液相色譜法，簡要說明了本法的特點，指出了本法用于大多數(shù)藥物分析是以分配色譜法為基礎，可在30min內完成。敘述分儀器和方法兩部分。在儀器項下，詳細分述了泵系統(tǒng)、進樣器、柱、檢測器和數(shù)據收集裝置。關于檢測器，重點討論了常用的分光光度檢測器。對于配有單色器的可變波長檢測器的波長準確度，應該用該儀器制造廠提供的方法進行校正，如果觀察到的波長與正確的波長相差3nm以上，則提示需進行再校正。

25第25頁,共28頁，2024年2月25日，星期天美國藥典還討論了多波長檢測器，特別是二極管陣列多波長檢測器的特點，指出，二極管陣列檢測器比固定波長檢測器或可變波長檢測器的信噪比低，不適宜于低濃度化合物的分析。在討論示差折光檢測器中，認為該檢測器不如紫外光檢測器靈敏，且受溶劑組成、流速、溫度變化的影響大，要得到滿意的基線，需用參比柱。在方法項下，強調要用高純度的試劑和HPLC級的有機溶劑，色譜用水的電導率和紫外吸收應低，并指出，流動相的組成對容量因子的影響遠大于溫度的影響。本部分還討論了梯度洗脫的應用、檢測器的線性動態(tài)范圍（即檢測器信號響應與被測成分量呈比例的范圍）、自動進樣測定、外標法和內標法測定和系統(tǒng)適用性試驗。在通法中還有專門一節(jié)討論系統(tǒng)適用性試驗。26第26頁,共28頁，2024年2月25日，星期天英國藥典2000年版附錄ID液相色譜法，簡要敘述了儀器、方法、歸一化法、效能及與正文有關的內容。在方法項下，說明要用對照溶液測試，以決定儀器的設置和獲得適當響應的注樣量，進行