酶聯(lián)免疫分析法

酶聯(lián)免疫分析法第七章

酶聯(lián)免疫分析法基本要求：了解免疫分析發(fā)展史，掌握抗原、抗體和免疫反應(yīng)的原理，了解免疫分析法的分類，熟悉酶標(biāo)記免疫分析法中使用的酶，熟悉ELISA的原理，掌握ELISA的固相載體、包被與封閉、稀釋液、洗滌液、酶反應(yīng)終止液及ELISA法常用酶的底物系統(tǒng)，掌握ELISA的酶聯(lián)方法和試驗方法，熟悉ELISA反應(yīng)條件的選擇，掌握ELISA的定量計算，了解ELISA的靈敏度提高途徑，熟悉ELISA放大系統(tǒng)。了解化學(xué)發(fā)光分析的原理，熟悉化學(xué)發(fā)光劑的種類，熟悉化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析常用的標(biāo)記酶和發(fā)光增強劑，熟悉生物發(fā)光酶聯(lián)免疫分析常用的生物發(fā)光反應(yīng)體系。第2頁,共88頁，2024年2月25日，星期天第七章

酶聯(lián)免疫分析法第一節(jié)

酶聯(lián)免疫分析概述第二節(jié)

光度酶聯(lián)免疫分析第三節(jié)

發(fā)光酶聯(lián)免疫分析第3頁,共88頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)

酶聯(lián)免疫分析概述一、免疫分析1、免疫分析發(fā)展史免疫分析（Immunoassay，IA）是利用待測物質(zhì)（抗原或抗體）與其相對應(yīng)物質(zhì)（抗體或抗原）之間專一特異性反應(yīng)而建立起來的一種高選擇性分析方法。免疫分析主要基于用抗體（或抗原）作為選擇性化學(xué)試劑以分析測定抗原（或抗體）及半抗原。宋代

人工痘苗預(yù)防烈性傳染病天花1971年

第一屆國際免疫學(xué)會議

將免疫學(xué)與微生物學(xué)分開發(fā)展成一門獨立的學(xué)科。第4頁,共88頁，2024年2月25日，星期天“免疫（immunity）”一詞源于“immunitas”，原意是免除稅賦和差役。研究早期免疫學(xué)多集中在抗體抗感染能力研究。20世紀(jì)中期以后，人們逐漸開始對各種抗原、微生物的作用進行研究，發(fā)展出基礎(chǔ)免疫學(xué)、臨床免疫學(xué)、免疫學(xué)檢測、醫(yī)學(xué)免疫學(xué)等多個分支。現(xiàn)代免疫學(xué)將“免疫”定義為：機體對“自己”和“異己”識別、應(yīng)答過程中所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)的總和，正常情況下是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一種生理性功能。第一節(jié)

酶聯(lián)免疫分析概述第5頁,共88頁，2024年2月25日，星期天2、抗原、抗體與免疫反應(yīng)抗原是能夠引起免疫反應(yīng)的分子。免疫原性（immunogenicity）指誘導(dǎo)刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞的能力。具有免疫原性的物質(zhì)稱為免疫原（immunogen）。免疫反應(yīng)原性（immunoreactivity）或抗原性（antigenicity），指能與相應(yīng)抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合，引起免疫反應(yīng)的性能。具備上述兩種特性的物質(zhì)為完全抗原，僅具有免疫反應(yīng)性的物質(zhì)被稱為半抗原（hapten）。第一節(jié)

酶聯(lián)免疫分析概述第6頁,共88頁，2024年2月25日，星期天抗體是能與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。所有的抗體都是免疫球蛋白，但并非所有的免疫球蛋白都是抗體。例如無免疫活性的免疫球蛋白（如骨髓瘤蛋白）就不是抗體，盡管其結(jié)構(gòu)與抗體相似。抗體主要存在于血清內(nèi)，但在其他體液及外分泌液中也有存在?？乖贵w分子之間存在著結(jié)構(gòu)互補性和親和性，使得抗原與相應(yīng)抗體之間極易發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，這種反應(yīng)具有高特異性（即專一性）和可逆性。第一節(jié)

酶聯(lián)免疫分析概述第7頁,共88頁，2024年2月25日，星期天抗原、抗體發(fā)生如下免疫反應(yīng)：Ag+AbAg-Ab該免疫反應(yīng)遵循可逆生物大分子相互作用的熱動力學(xué)基本原理，其反應(yīng)式為式中：[Ab]為游離的抗體結(jié)合位點的濃度；[Ag]為游離的抗原結(jié)合位點的濃度；[Ab-Ag]為抗原-抗體復(fù)合物的濃度；k1為正反應(yīng)速率常數(shù)；k2為負(fù)反應(yīng)速率常數(shù)；K為反應(yīng)平衡常數(shù)（親和常數(shù)）。第一節(jié)

酶聯(lián)免疫分析概述第8頁,共88頁，2024年2月25日，星期天這種抗原-抗體反應(yīng)既可發(fā)生于體內(nèi)（invivo），也可發(fā)生于體外（invitro）?？贵w主要存在于血清中，在抗原、抗體的檢測中多采用血清做試驗，所以體外抗原-抗體反應(yīng)也稱為血清學(xué)反應(yīng)（serologicreaction）?；诳乖?抗體反應(yīng)的檢測技術(shù)主要應(yīng)用于以下幾個方面：①用已知抗原檢測未知抗體；②用已知抗體檢測未知抗原；③定性或定量檢測體內(nèi)各種大分子物質(zhì)；④用已知抗體檢測某些藥物、激素等各種半抗原物質(zhì)。第一節(jié)

酶聯(lián)免疫分析概述第9頁,共88頁，2024年2月25日，星期天二、酶標(biāo)記免疫分析法及常用標(biāo)記酶1、免疫分析法分類第一節(jié)

酶聯(lián)免疫分析概述第10頁,共88頁，2024年2月25日，星期天2、酶標(biāo)記免疫分析法中使用的酶（1）酶聯(lián)免疫分析中使用的酶應(yīng)符合下列條件：①純度高、催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化速率高、專一性強；②具有足夠的偶聯(lián)用標(biāo)記基團，與抗原、抗體蛋白分子偶聯(lián)后仍保持較高的催化活性；③使用穩(wěn)定性和保存穩(wěn)定性好；④測定酶活性的方法簡便、靈敏、快速；⑤待測體液中不存在與標(biāo)記酶相同的酶；第一節(jié)

酶聯(lián)免疫分析概述第11頁,共88頁，2024年2月25日，星期天⑥待測溶液中應(yīng)該無底物、反應(yīng)抑制劑和其他與酶發(fā)生反應(yīng)的干擾物質(zhì)；⑦酶的來源、純化和供應(yīng)較方便，價格較低廉；⑧均相酶免疫測定法中使用的酶，還要求當(dāng)抗體與半抗原-酶結(jié)合物結(jié)合后，酶活性表現(xiàn)出抑制或激活。第一節(jié)

酶聯(lián)免疫分析概述第12頁,共88頁，2024年2月25日，星期天（2）酶的評價指標(biāo)

通常用RZ和酶的比活力評價標(biāo)記酶的質(zhì)量。RZ表示酶蛋白中活性部分與非活性部分最大吸光度的比值。酶的比活力指在特定條件下，每1mg酶或每1ml酶液所具有的酶活性單位數(shù)。（3）酶聯(lián)免疫分析中的常用酶

下表列出了酶聯(lián)免疫分析中的常用酶。其中EC編號是根據(jù)國際酶學(xué)委員會的規(guī)定采用四碼編號法確定的每個酶的系統(tǒng)編號。第一節(jié)

酶聯(lián)免疫分析概述第13頁,共88頁，2024年2月25日，星期天酶來源EC編號辣根過氧化物酶辣根1.11.1.7酸性磷酸酶動植物3.1.3.2堿性磷酸酶牛腸3.1.3.1β-D-半乳糖苷酶大腸桿菌3.2.1.23葡萄糖氧化酶曲霉菌1.1.3.4脲酶Jack豆3.5.1.5青霉素酶—3.5.2.6過氧化氫酶肝1.11.1.6葡萄糖淀粉酶根霉菌3.2.1.3碳酸苷酶牛紅細(xì)胞4.2.1.1乙酰膽堿酶—3.1.1.7葡萄糖-6-磷酸脫氫酶腸系膜明串細(xì)菌1.1.1.49溶菌酶雞卵白3.2.1.17蘋果酸脫氫酶豬心線粒體1.1.1.49無機焦磷酸酶大腸桿菌3.6.1.1熒光素酶發(fā)光生物1.3.12.7丙酮酸激酶哺乳動物組織2.7.1.40酶聯(lián)免疫分析常用酶第一節(jié)

酶聯(lián)免疫分析概述第14頁,共88頁，2024年2月25日，星期天①辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）是一種提取自辣根中，相對分子質(zhì)量為44kDa的糖蛋白。其酶學(xué)活性部分包括脫輔基蛋白和血紅素基團，輔基亞鐵血紅素在403nm波長呈現(xiàn)最大光吸收值。HRP的純度以RZ值即A403nm/A275nm的值來衡量，高純度HRP制劑的RZ≥3.0。通常以能在20℃、pH為6.0、20s的時間內(nèi)催化底物鄰苯三酚產(chǎn)生1mg紅桔酚（purpurogallin）作為HRP酶的1個活性單位。用于標(biāo)記的HRP比活性應(yīng)大于250U/mg。第一節(jié)

酶聯(lián)免疫分析概述第15頁,共88頁，2024年2月25日，星期天②堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，AP）幾乎存在于動物和人體的所有組織中，尤其在肝臟、胎盤、白細(xì)胞、腎小管中含量高。AP是一種磷酸酯的水解酶，它能夠催化磷酸單酯、磷酸核苷及6-磷酸糖類等的水解，在釋放磷酸鹽的同時產(chǎn)生有色的或熒光的產(chǎn)物。堿性磷酸酶的分子質(zhì)量為80～100kDa，最適pH為8.0～10.0，隨酶源和底物的不同而變化。AP活性的測定以對硝基磷酸苯酯（PNP）作為底物。用作標(biāo)記的AP比活力應(yīng)大于1000U/mg。第一節(jié)

酶聯(lián)免疫分析概述第16頁,共88頁，2024年2月25日，星期天③葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase，GOD）即β-D-葡萄糖氧化還原酶，一般由黑曲霉和青霉產(chǎn)生。它催化O2和β-D-葡萄糖的反應(yīng)形成H2O2和D-葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯，酯再與水反應(yīng)生成葡糖酸。其反應(yīng)最適pH范圍為4.0～7.0，pH5.5時，反應(yīng)速率最大。葡萄糖氧化酶對β-D-葡萄糖的β-異頭碳有高度專一性。葡萄糖氧化酶的比活力至少為20U/mg。葡萄糖氧化酶在4℃下可穩(wěn)定存在6～12個月。第一節(jié)

酶聯(lián)免疫分析概述第17頁,共88頁，2024年2月25日，星期天④β-D-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase，Gal）即乳糖酶（β-lactase），廣泛存在于植物、動物器官、細(xì)菌、酵母和真菌中。當(dāng)Gal催化水解β-D-半乳糖苷時，若得到的半乳糖殘基轉(zhuǎn)移到水分子受體，稱為水解；若受體是糖或醇時，稱為轉(zhuǎn)半乳糖苷。Gal催化β-D-半乳糖苷水解反應(yīng)的最適pH為7.5，轉(zhuǎn)化效率很高，且比HRP易于標(biāo)記，背景值低，穩(wěn)定性好。Gal比活力應(yīng)不少于30U/mg，5℃能保存1～2年。第一節(jié)

酶聯(lián)免疫分析概述第18頁,共88頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法一、光度酶聯(lián)免疫分析1、酶聯(lián)免疫吸附分析（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）原理①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面；②抗原或抗體與某種酶聯(lián)結(jié)成酶標(biāo)抗原或抗體；③在測定時，使受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相抗原或固相抗體起反應(yīng)；④用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例；⑤加入酶反應(yīng)底物，底物被酶催化為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物量與標(biāo)本中受檢物的量相關(guān)，用分光光度法進行定量。第19頁,共88頁，2024年2月25日，星期天*Ag是酶標(biāo)志抗原，Ag是未標(biāo)志抗原，Ab是特異性抗體，(F)表示游離型的*Ag，(B)表示結(jié)合型的*Ag-Ab。第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第20頁,共88頁，2024年2月25日，星期天2、ELISA的固相載體良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近。最常用的是聚苯乙烯。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。ELISA載體的形式有小試管、小珠和微量反應(yīng)板。第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第21頁,共88頁，2024年2月25日，星期天3、固相載體的包被與封閉（1）包被（coating）指將抗原或抗體連接到固相載體上的過程。以聚苯乙烯微量反應(yīng)板為例，通常先將抗原或抗體溶于pH9.6的碳酸鹽緩沖液（或pH7.2的磷酸鹽緩沖液，pH7～8的Tris-HCl緩沖液）中，加滿反應(yīng)孔，置4℃過夜，洗滌即可。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為0.1～20μg/ml。第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第22頁,共88頁，2024年2月25日，星期天（2）封閉（blocking）指繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。所有的ELISA固相載體均需封閉。常用封閉劑有0.05%～0.5%BSA；10%小牛血清或1%明膠；脫脂奶粉，比較價廉，可高濃度使用（5%）。第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第23頁,共88頁，2024年2月25日，星期天4、稀釋液、洗滌液和酶反應(yīng)終止液（1）稀釋液用于稀釋酶標(biāo)抗體及標(biāo)本。常用中性PBS或Tris-HCl緩沖液，其中含有無關(guān)高濃度蛋白（如10％動物血清、1％BSA（牛血清白蛋白）、1％明膠等）和非離子型表面活性劑（如0.05％Tween20或TritonX-100等）。（2）洗滌液一般與稀釋液相同，常用PBS或Tris-HCl緩沖液。四種常用的抗體稀釋液和三種常用的洗滌液列于表7-2。第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第24頁,共88頁，2024年2月25日，星期天編號吐溫20/%組成稀釋液10.05PBS0.01mol/L，pH7.42PBS0.05mol/L，pH7.43PBS0.05mol/L，pH7.4，含EDTA10mmol/L4PBS0.05mol/L，pH6.9，含EDTA10mmol/L洗滌液10.1PBS0.01mol/L，pH7.22PBS0.01mol/L，pH8.03Tris-HCl緩沖液0.01mol/L，pH8.0，NaCl0.15mol/L表7-2常用的抗體稀釋液和洗滌液第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第25頁,共88頁，2024年2月25日，星期天（3）酶反應(yīng)終止液

辣根過氧化物酶（HRP）反應(yīng)終止液為2mol/L～4mol/LH2SO4（HRP在酸性條件下喪失酶活性）。很多ELISA試劑采用堿性磷酸酶（AP）作為標(biāo)記酶，用3mol/LNaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一段時間。第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第26頁,共88頁，2024年2月25日，星期天5、ELISA法常用酶的底物系統(tǒng)ELISA法對底物的要求：價廉易得、安全；顯色性和穩(wěn)定性好；底物本身最好為無色物質(zhì)；終止酶催化反應(yīng)后，底物不應(yīng)再繼續(xù)地自發(fā)性變性；其最終產(chǎn)物可溶、易于測定及光吸收值高。第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第27頁,共88頁，2024年2月25日，星期天（1）辣根過氧化物酶的底物系統(tǒng)

常見底物有鄰苯二胺（OPD，產(chǎn)物橙紅色，測定波長492nm）、5-氨基水楊酸（5-AS，產(chǎn)物橙色，測定波長550nm）、3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB，產(chǎn)物紅色，測定波長450nm）、2,2′-連氮-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸鹽）（ABTS）等。ABTS的反應(yīng)曲線不好。OPD溶液具有光敏性，相對來說不穩(wěn)定，且具有誘變特性。TMB的背景值低，溶液穩(wěn)定，沒有誘變特性。第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第28頁,共88頁，2024年2月25日，星期天（2）堿性磷酸酶的底物系統(tǒng)

常用的底物為對硝基磷酸苯酯（PNP），水解的產(chǎn)物為黃色的對硝基苯酚，可在405nm處檢測其吸光度的變化，該底物的轉(zhuǎn)化效率高，線性關(guān)系好。用酚酞磷酸酯為底物，水解生成的酚酞在堿性條件下呈紅色，可在530nm處光度法測定。此外還可以百里酚酞單磷酸酯等為底物。第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第29頁,共88頁，2024年2月25日，星期天（3）β-D-半乳糖苷酶的底物系統(tǒng)

常見底物有鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷（ONPG），其水解的產(chǎn)物鄰硝基苯酚在405nm處具有最大吸光度值。其他的底物有對硝基苯-β-D-半乳糖苷（PNPG）、苯基-β-D-半乳糖苷、氯酚紅-β-D-半乳糖苷（CPRG）、9-羥基-3-異吩噁唑酮-β-D-半乳糖苷（RG）等。（4）青霉素酶（PNC）的底物系統(tǒng)

常用底物有溴麝香草酚藍(lán)（BTB）、青霉酮酸還原淀粉-碘復(fù)合物（SIC）、溴甲酚紫（BCP）和溴麝香草酚藍(lán)（2︰1）等。第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第30頁,共88頁，2024年2月25日，星期天二、ELISA酶聯(lián)方法和試驗方法1、ELISA酶聯(lián)方法ELISA酶聯(lián)方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。（1）戊二醛交聯(lián)法

戊二醛是一種雙功能團試劑，它可以聯(lián)結(jié)具有氨基的酶和蛋白質(zhì)。戊二醛交聯(lián)法有一步法、兩步法兩種。第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第31頁,共88頁，2024年2月25日，星期天圖7-2戊二醛一步法反應(yīng)原理①一步法

將戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中，反應(yīng)后即得酶標(biāo)記抗體。該法操作簡便、有效，重復(fù)性好。缺點是交聯(lián)反應(yīng)是隨機的，酶與酶、抗體與抗體之間有可能交聯(lián)。第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第32頁,共88頁，2024年2月25日，星期天圖7-3戊二醛二步法反應(yīng)原理②兩步法

先將酶與戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再與抗體作用而形成酶標(biāo)抗體；或先將抗體與戊二醛作用，再與酶聯(lián)結(jié)。兩步法的產(chǎn)物中絕大部分的酶與蛋白質(zhì)是以1:1的比例結(jié)合的，有助于本底的改善。第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第33頁,共88頁，2024年2月25日，星期天（2）過碘酸鹽氧化法

本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過氧化物酶（HRP）的標(biāo)記常用此法。反應(yīng)時，過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為活潑的醛基，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成Schiff氏堿而結(jié)合。圖7-4過碘酸鹽氧化法

第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第34頁,共88頁，2024年2月25日，星期天2、ELISA試驗方法ELISA法中有三個必要試劑：①固相抗原或抗體；②酶標(biāo)記抗原或抗體；③酶反應(yīng)底物。根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀以及檢測的具體條件，可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。如雙抗體夾心法、間接法、競爭法、異種動物抗體雙夾心法、抗酶抗體法、競爭性抑制法、雙夾心法和抗原直接包被法等方法。第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第35頁,共88頁，2024年2月25日，星期天（1）雙抗體夾心法雙抗體夾心法（doubleantibodysandwich，DAS-ELISA）由Clark和Adams于1977年建立，是最經(jīng)典的ELISA檢測法。該法的靈敏度高，特異性強，但提純免疫球蛋白和制備酶標(biāo)記物要求技術(shù)性強，成本較高。該法只適用于二價或二價以上較大分子抗原的檢出和定量分析，而不能用于半抗原等小分子的測定。第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第36頁,共88頁，2024年2月25日，星期天圖7-5雙抗體夾心法第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第37頁,共88頁，2024年2月25日，星期天（2）間接法間接法（indirectELISA）是最常用的ELISA檢測方法，其原理是利用酶標(biāo)記的抗體和已與固相抗原結(jié)合的受檢抗體相結(jié)合。該法只要更換不同的固相抗原，就可以用一種酶標(biāo)抗抗體檢測各種與抗原相應(yīng)的抗體。該方法不必為每個待測抗體（或抗原）制備特異性的酶標(biāo)抗抗體（或酶標(biāo)抗體），極大地簡化了實驗。第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第38頁,共88頁，2024年2月25日，星期天圖7-6間接法第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第39頁,共88頁，2024年2月25日，星期天（3）競爭法競爭法（competingELISA）是利用待測抗原和酶標(biāo)抗原與特異性抗體競爭結(jié)合，或待測抗體和酶標(biāo)抗體與特異性抗原競爭結(jié)合而進行測定的一種方法（圖7-7）。第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第40頁,共88頁，2024年2月25日，星期天圖7-7競爭法第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第41頁,共88頁，2024年2月25日，星期天（4）異種動物抗體雙夾心法異種動物抗體雙夾心法（圖7-8），又稱間接雙抗體夾心法（indirectDAS-ELISA）或三抗體夾心法（tripleantibodiessandwich，TAS-ELISA）。此法可用通用的酶標(biāo)記抗體檢驗多種病毒，它不僅免去了標(biāo)記每種抗體，而且靈敏度有所提高。第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第42頁,共88頁，2024年2月25日，星期天圖7-8異種動物抗體夾心法第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第43頁,共88頁，2024年2月25日，星期天（5）抗酶抗體法抗酶抗體法（圖7-9）是利用免疫學(xué)反應(yīng)而不是用化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)來制備酶結(jié)合物，常用HRP為標(biāo)記酶作為抗原免疫動物制備抗HRP抗體?？捎靡环N動物（如兔）制備特異性抗體（第一抗體）和抗酶抗體（第三抗體），再用另一種動物（如羊）制備抗第一種動物（兔）IgG的抗體（第二抗體）。讓這種抗IgG的第二抗體把第一抗體（兔IgG）和抗酶抗體（也為兔IgG）通過免疫學(xué)反應(yīng)連接起來。最后讓酶與抗酶抗體結(jié)合，通過對底物的作用而揭示在固相載體上待測抗原的存在。第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第44頁,共88頁，2024年2月25日，星期天優(yōu)點:HRP通過免疫學(xué)反應(yīng)與抗體結(jié)合，避免了用化學(xué)方法交聯(lián)時抗體活性的改變，也避免了HRP與其他蛋白質(zhì)分子結(jié)合，防止標(biāo)記抗體和游離的未標(biāo)記抗體之間的競爭，提高了標(biāo)記抗體的質(zhì)量。在純化化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)制備的酶結(jié)合物的過程中，除去未標(biāo)記抗體比較困難，而且該法僅在制備抗酶抗體時用少量純HRP作抗原，所以用較粗制的HRP與抗酶抗體形成免疫復(fù)合物，并不影響其質(zhì)量，這大大節(jié)約了價格較昂貴的精制HRP。因為制備抗酶抗體必須在動物中進行，故抗酶抗體法多適用于檢測動物中的抗體。第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第45頁,共88頁，2024年2月25日，星期天圖7-9抗酶抗體法第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第46頁,共88頁，2024年2月25日，星期天三、ELISA反應(yīng)條件的選擇1、酶標(biāo)抗體濃度的選擇先用200μLIgG（100mg/ml）包被小孔，再將酶標(biāo)記抗體球蛋白系列稀釋并加入小孔中，洗滌后，加底物反應(yīng)，終止后測定吸光度。選擇吸光度為1的稀釋度作為酶標(biāo)抗體最適濃度。圖7-10酶標(biāo)抗體濃度的選擇第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第47頁,共88頁，2024年2月25日，星期天2、包被濃度的選擇當(dāng)包被抗原的濃度較低時，包被量隨抗原濃度的增加而增大；當(dāng)包被抗原達(dá)到一定濃度后，包被量為定值，不再隨抗原濃度的增加而增大。此濃度稱為抗原的飽和包被濃度。圖7-11抗原包被量和ELISA反應(yīng)的關(guān)系第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第48頁,共88頁，2024年2月25日，星期天表7-3SM-EDA-GA包被法中鏈霉素包被質(zhì)量濃度對ELISA實驗誤差的影響包被質(zhì)量濃度（mg/ml）ELISA測定結(jié)果（A492±SD）（n=4）41.098±0.06281*1.011±0.03020.50.969±0.08760.250.792±0.1023第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第49頁,共88頁，2024年2月25日，星期天3、酶-底物反應(yīng)時間的選擇抗原與抗體、抗體與酶標(biāo)抗體反應(yīng)一般在37℃反應(yīng)2～3h達(dá)到高峰。時間太短，敏感性下降，時間太長，吸附的抗原或復(fù)合物（在這個溫度下）可能脫落。酶-底物反應(yīng)時間一般采用15min、30min或45min，也可以標(biāo)準(zhǔn)陽性血清為準(zhǔn)，隨時測定其OD值，當(dāng)達(dá)到規(guī)定的OD值時，即終止反應(yīng)。第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第50頁,共88頁，2024年2月25日，星期天四、ELISA的定量計算與靈敏度1、ELISA的定量計算一般采用分光光度計測定結(jié)合物中的酶量和抗體蛋白（IgG）量，酶量和IgG計算方法如下。其中，0.4表示酶的A403nm值為1時，酶量為0.4mg/ml；0.42表示酶的A403nm值為1時，其相應(yīng)A280nm值為0.42；0.62表示在A280nm值為1時，IgG量為0.62mg/ml；0.94表示酶、戊二醛結(jié)合后，A280nm增加約6％。第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第51頁,共88頁，2024年2月25日，星期天酶結(jié)合物中結(jié)合的酶量、酶結(jié)合率計算方法：以采用過碘酸鈉氧化法進行酶聯(lián)為例，摩爾比值計算方法：酶量為1mg/ml，摩爾比值為1.5～2.0，酶結(jié)合率在30%以上時，可獲得較好的ELISA分析結(jié)果。第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第52頁,共88頁，2024年2月25日，星期天2、ELISA的靈敏度與ELISA放大系統(tǒng)（1）ELISA的靈敏度

ELISA的檢出限已經(jīng)達(dá)到10-8～10-12g，但對某些測定仍需更高的靈敏度。傳統(tǒng)ELISA中顯色劑發(fā)色團的吸光度是限制ELISA靈敏度的主要因素。改用熒光標(biāo)記或其他化學(xué)發(fā)光物標(biāo)記抗體替代酶標(biāo)記抗體可以提高靈敏度。改變傳統(tǒng)ELISA的操作程序也可以提高靈敏度，如SIMIT技術(shù)。采用放大系統(tǒng)是提高ELISA靈敏度的主要途徑。第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第53頁,共88頁，2024年2月25日，星期天（2）ELISA放大系統(tǒng)①生物素-親和素放大系統(tǒng)可增加抗體（或抗原）的標(biāo)記率。生物素與親和素結(jié)合速率較快且結(jié)合物的穩(wěn)定性高（K=1015），不會在孵育和各種洗滌過程中脫落。生物素對抗體和酶的標(biāo)記率高（10個生物素分子/抗體分子），且生物素分子易于活化，標(biāo)記后不影響抗體和酶的活性。每個親和素分子能結(jié)合4個生物素，因而可偶聯(lián)更多的聯(lián)結(jié)生物素的酶分子，從而提高ELISA的敏感性。生物素-親和素標(biāo)記體系有靈活多變的運用方式，可以適應(yīng)不同的分析設(shè)計。第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第54頁,共88頁，2024年2月25日，星期天②微粒放大。用適當(dāng)?shù)奈⒘４婷?抗體結(jié)合物也可以獲得放大效果。每個微粒表面可以同時結(jié)合大量記酶和抗體分子。在包含微粒放大的夾心ELISA法中，微粒通過結(jié)合于其上的第二抗體結(jié)合于抗原。微粒上又結(jié)合著標(biāo)記酶，其數(shù)量遠(yuǎn)比第二抗體能結(jié)合的標(biāo)記酶多，因此得以放大。例如，微顆粒放大系統(tǒng)用微顆粒硅膠（直徑約40nm）作為中間體連接酶和抗體，避免酶和抗體直接連接。酶微顆粒硅膠可連接上千個酶分子，可使體系增敏，已用于測定甲胎蛋白，靈敏度放大兩個數(shù)量級。第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第55頁,共88頁，2024年2月25日，星期天五、ELISA法的應(yīng)用酶免疫測定具有高度的特異性和敏感性，幾乎所有的可溶性抗原-抗體系統(tǒng)均可用以檢測，它的最小可測值達(dá)ng甚至pg水平。酶免疫測定在各應(yīng)用領(lǐng)域中的普及，應(yīng)歸功于商品試劑盒和自動或半自動檢測儀器的問世。目前應(yīng)用較廣的酶免疫檢測項目一般有試劑盒出售。完整的ELISA試劑盒應(yīng)包含包被好的固相載體、酶結(jié)合物、底物和各種濃縮的稀釋液、緩沖液等。這些試劑在冰箱中可保存半年以上，因此實驗室中只需要用蒸餾水稀釋全套試劑即可。第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第56頁,共88頁，2024年2月25日，星期天六、微量致敏性雜質(zhì)青霉噻唑蛋白的測定基因工程藥品在生產(chǎn)過程中為防止污染，在細(xì)胞培養(yǎng)或發(fā)酵過程中常需加入一定量的青霉素。青霉素在水溶液中很容易和蛋白質(zhì)結(jié)合形成過敏性雜質(zhì)青霉噻唑（benzylpenicilloyl，BPO）蛋白，為確?；蚬こ趟幤返漠a(chǎn)品質(zhì)量，可以用ELISA對基因工程藥品中是否殘存有青霉噻唑蛋白進行檢測，其對樣品中結(jié)合青霉素的絕對檢出量小于0.3×10-6。第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第57頁,共88頁，2024年2月25日，星期天其實驗步驟如下：（1）包被：用碳酸緩沖液（0.1mol/L，pH9.6）直接包被待測抗原，200μL/孔；包被BPO4-CY作為陽性對照，并設(shè)有包被抗原不加抗BPO血清和不包被抗原但加抗BPO血清兩組陰性對照；此外，實驗中還設(shè)有待測抗原-BSA抗血清相互作用組作為陰性血清對照；4℃冰箱過夜。（2）用洗滌液（BPS0.01mol/L，pH7.2）洗滌三次，每次3min。第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第58頁,共88頁，2024年2月25日，星期天（3）與特異性抗體反應(yīng)：在經(jīng)洗滌好的酶標(biāo)板中加入稀釋至一定滴度的抗BPO血清或抗BPO單克隆抗體，200μL/孔，37℃保溫2h。（4）洗滌三次。（5）與酶聯(lián)抗抗體反應(yīng)：再加入1︰50稀釋的GAR-IgG-HRP200μL/孔，37℃保溫1h。（6）洗滌三次。（7）顯色：加入OPD底物液，200μL/孔，37℃顯色。第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第59頁,共88頁，2024年2月25日，星期天（8）用1mol/L的硫酸終止反應(yīng)，50μL/孔，用酶標(biāo)儀測定其在492nm波長處的光吸收值。（9）結(jié)果判斷：當(dāng)陽性孔呈陽性，陰性血清呈陰性時實驗成立。若當(dāng)待測抗原的測定結(jié)果大于陰性對照均值（X）與其2倍標(biāo)準(zhǔn)差（SD）之和（X+2SD），判為陽性；若小于X+SD，判為陰性；若在X+2SD與X+SD之間需要調(diào)整試驗條件重新測試。ELISA測定125SerIL-2中青霉噻唑蛋白的結(jié)果如下（見表7-4）：第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第60頁,共88頁，2024年2月25日，星期天表7-4ELISA實驗測定125SerIL-2*中青霉噻唑蛋白第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第61頁,共88頁，2024年2月25日，星期天包被樣品稀釋至約2×10-6mg（1×10-16mol）/孔時，ELISA反應(yīng)仍為陽性，提示樣品中BPO的量大于1×10-5mol，即待測樣品中含有結(jié)合青霉素的絕對含量為千分之一左右。第二節(jié)

酶聯(lián)免疫吸附分析法第62頁,共88頁，2024年2月25日，星期天一、化學(xué)發(fā)光分析1、化學(xué)發(fā)光（chemiluminescence，CL）一些物質(zhì)在進行化學(xué)反應(yīng)時，吸收了化學(xué)反應(yīng)過程中產(chǎn)生的化學(xué)能，使得分子外層電子激發(fā)到激發(fā)態(tài)，生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物。當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)的最低振動能級回到基態(tài)的各個振動能級時，以光輻射的形式釋放能量，這個發(fā)光過程稱為化學(xué)發(fā)光，其反應(yīng)過程如下：

發(fā)光效率表示一個化學(xué)發(fā)光分子的量子產(chǎn)率，指每摩爾反應(yīng)物輻射出光子的量。第三節(jié)

發(fā)光酶聯(lián)免疫分析

第63頁,共88頁，2024年2月25日，星期天2、化學(xué)發(fā)光分析化學(xué)發(fā)光分析是根據(jù)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的光輻射確定物質(zhì)含量的一種痕量分析方法?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）是將化學(xué)發(fā)光反應(yīng)與免疫反應(yīng)相結(jié)合而對抗體、抗原或半抗原進行測定的一種免疫分析方法。

第三節(jié)

發(fā)光酶聯(lián)免疫分析第64頁,共88頁，2024年2月25日，星期天3、化學(xué)發(fā)光劑用作標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光劑應(yīng)符合以下條件：①能參與化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；②與抗原或抗體偶聯(lián)后能形成穩(wěn)定結(jié)合物；③偶聯(lián)后仍保留高的量子產(chǎn)率和反應(yīng)動力；④不改變或極少改變被標(biāo)記物的物理化學(xué)特性，特別是免疫活性。常用的化學(xué)發(fā)光劑有吖啶酯類化合物、氨基苯二酰肼類化合物、咪唑類化合物、苯酚類化合物、芳基草酸酯類化合物等。

第三節(jié)

發(fā)光酶聯(lián)免疫分析第65頁,共88頁，2024年2月25日，星期天（1）吖啶酯類化合物

吖啶酯是三環(huán)有機化合物，很容易氧化。當(dāng)其在堿性介質(zhì)中氧化時，經(jīng)歷共價鍵的斷裂，產(chǎn)生二氧酮的中間體，然后形成電激發(fā)的N-甲基吖啶酮。當(dāng)它回復(fù)到基態(tài)時在430nm處釋放出光子。在加入H2O2及隨后加入NaOH調(diào)節(jié)至所需pH之前維持一低pH以實現(xiàn)最佳氧化過程，可加速其氧化反應(yīng)。吖啶酯氧化反應(yīng)如圖7-12所示。

第三節(jié)

發(fā)光酶聯(lián)免疫分析第66頁,共88頁，2024年2月25日，星期天

圖7-12吖啶酯氧化反應(yīng)過程第三節(jié)

發(fā)光酶聯(lián)免疫分析第67頁,共88頁，2024年2月25日，星期天吖啶酯類化學(xué)發(fā)光劑的典型代表是光澤精（N,N′-二甲基吖啶硝酸酯）。它在堿性條件下，與H2O2等過氧化物作用形成發(fā)光體激發(fā)態(tài)N-甲基吖啶酮。能促使光澤精激發(fā)的物質(zhì)還有丙酮、次黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶、羥胺及抗壞血酸等。光澤精的氧化反應(yīng)如圖7-13所示。

第三節(jié)

發(fā)光酶聯(lián)免疫分析第68頁,共88頁，2024年2月25日，星期天

圖7-13光澤精的氧化反應(yīng)第三節(jié)

發(fā)光酶聯(lián)免疫分析第69頁,共88頁，2024年2月25日，星期天吖啶酯類化合物作為化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物有顯著的優(yōu)點：①氧化反應(yīng)不需催化劑，只需要在堿性環(huán)境中就可以進行，發(fā)光反應(yīng)快速，在1s內(nèi)光子散射達(dá)到高峰，整個過程在2s內(nèi)完成，可充分計數(shù)，背景噪聲低。②這類化合物與被標(biāo)記物的結(jié)合發(fā)生在分子一定部位，在氧化反應(yīng)過程中，結(jié)合物被分解，吖啶酯分子從發(fā)光的部分?jǐn)嗔巡⒎蛛x下來，所以吖啶酯的發(fā)光不受抑制，敏感度不受標(biāo)記反應(yīng)的影響，試劑穩(wěn)定性好。

第三節(jié)

發(fā)光酶聯(lián)免疫分析第70頁,共88頁，2024年2月25日，星期天（2）氨基苯二酰肼類化合物

魯米諾（5-氨基-2,3-二氫-1,4-酞嗪二酮）、異魯米諾（6-氨基-2,3-二氫-1,4-酞嗪二酮）及其衍生物如氨丁基乙基異魯米諾（ABEI）、氨己基乙基異魯米諾（AHEI）、氨丁基乙基魯米諾（ABENH）等均屬于這一類化學(xué)發(fā)光劑。魯米諾類化合物的發(fā)光反應(yīng)必須有催化劑（如過氧化物酶）催化，且與蛋白或肽結(jié)合后其發(fā)光作用減弱，因此魯米諾類化合物在CLIA中是很好的底物，但已較少用于CLIA的標(biāo)記。

第三節(jié)

發(fā)光酶聯(lián)免疫分析第71頁,共88頁，2024年2月25日，星期天

圖7-14魯米諾、異魯米諾及其某些衍生物的結(jié)構(gòu)式第三節(jié)

發(fā)光酶聯(lián)免疫分析第72頁,共88頁，2024年2月25日，星期天

圖7-15魯米諾化學(xué)發(fā)光反應(yīng)過程第三節(jié)

發(fā)光酶聯(lián)免疫分析第73頁,共88頁，2024年2月25日，星期天（3）咪唑類化合物

咪唑類發(fā)光劑主要是咯吩堿。其反應(yīng)過程首先是咯吩堿在堿性二甲亞砜水溶液中形成過氧化物中間體，再進行重排，降解，伴隨產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，如圖7-16所示。

第三節(jié)

發(fā)光酶聯(lián)免疫分析第74頁,共88頁，2024年2月25日，星期天

圖7-16咯吩堿的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)第三節(jié)

發(fā)光酶聯(lián)免疫分析第75頁,共88頁，2024年2月25日，星期天（4）苯酚類化合物

用于化學(xué)發(fā)光免疫測定的酚類物質(zhì)主要是鄰苯三酚（焦性沒食子酸），它是一種強還原劑，在催化劑（如HRP、血紅素）催化下，與H2O2反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。（5）芳基草酸酯類化合物

這類化合物主要有雙-（2,4,6-三氯苯基）草酸酯（TCPO）和雙-（2,4-二硝基苯基）草酸酯（DNPO）。此類物質(zhì)的發(fā)光反應(yīng)是在反應(yīng)體系中加入一種熒光染料如8-苯胺基-1-萘磺酸（ANS）作為熒光載體，通過過氧化草酸酯中間產(chǎn)物捕獲化學(xué)能，使熒光體處于激發(fā)態(tài)，退激至基態(tài)時，放出光子。

第三節(jié)

發(fā)光酶聯(lián)免疫分析第76頁,共88頁，2024年2月25日，星期天二、化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析1、化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析以在酶催化反應(yīng)中可以產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的發(fā)光物質(zhì)作為底物，以化學(xué)發(fā)光法檢測酶的活性，則為化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析（chemiluminescentenzymeimmuno-assay，CLEIA）。CLEIA方法的檢測限低至10-17mol/L，達(dá)到或超過放射免疫分析的靈敏度。化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析實際上是一種酶聯(lián)免疫測定過程。

第三節(jié)

發(fā)光酶聯(lián)免疫分析第77頁,共88頁，2024年2月25日，星期天2、CLEIA常用的標(biāo)記酶CLEIA方法中最常用的是辣根過氧化物酶和葡萄糖氧化酶（GOD）。此外還有丙酮酸激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、螢火蟲素酶、堿性磷酸酶（AP）和β-D-半乳糖苷酶等。HRP標(biāo)記的CLEIA，常用的底物為魯米諾或其衍生物。

第三節(jié)

發(fā)光酶聯(lián)免疫分析第78頁,共88頁，2024年2月25日，星期天魯米諾的氧化反應(yīng)在堿性緩沖液中進行，通常以0.1mol/L、pH8.6的Tris緩沖液作底物液，魯米諾和H2O2在無HRP催化時也能緩慢自發(fā)發(fā)光，而在最后光強度測定中造成空白干擾，因而宜分別配制成兩瓶試劑溶液，只在用前即刻混合。HRP催化魯米諾的氧化反應(yīng)可被某些酚類物質(zhì)（如對碘苯酚）或螢火蟲熒光素酶等增強。增強劑的作用是增強發(fā)光和延長發(fā)光時間，由此可提高敏感度。另外一些金屬配合物能催化魯米諾的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。

第三節(jié)

發(fā)光酶聯(lián)免疫分析第79頁,共88頁，2024年2月25日，星期天利用GOD對葡萄糖的催化氧化產(chǎn)生H2O2，用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)底物檢測產(chǎn)生的H2O2，可間接測定GOD的活性。常見發(fā)光反應(yīng)底物有魯米諾、TCPO等。如Masako和Akio以GOD為標(biāo)記酶，魯米諾-H2O2作為發(fā)光底物，以流動注射化學(xué)發(fā)光分析測定17-α-羥基孕甾酮、甲胎蛋白和胰島素，檢測限分別為0.5pg/ml、0.1ng/ml和0.1ng/ml，而且分析速度快，測定結(jié)果精密度好。

第三節(jié)

發(fā)光酶聯(lián)免疫分析第80頁,共88頁，2024年2月25日，星期天3、CLEIA常用的發(fā)光增強劑在反應(yīng)體系中引入增強劑，可增強化學(xué)發(fā)光強度，提高化學(xué)發(fā)光測定的信噪比，提高化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析靈敏度。最常用的增強劑有螢火蟲熒光素、苯并噻唑、苯酚取代物、取代聯(lián)苯胺、酸類衍生物、萘酚等。例如，螢火蟲素、6-羥基苯噻唑衍生物等能加強HRP催化魯米諾等的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使其強度提高80倍；某些酸類衍生物尤其是對碘酸、苯甲酸等的增強效果更佳，可使其發(fā)光強度提高1000倍，且延長發(fā)光持續(xù)時間。

第三節(jié)

發(fā)光酶聯(lián)免疫分析第81頁,共88頁，2024年2月25日，星期天三、生物發(fā)光酶聯(lián)免疫分析在1885～1887年，Dubois從發(fā)光昆蟲和有