酶在食品分析中的應(yīng)用

酶在食品分析中的應(yīng)用主要內(nèi)容1酶法分析的特點及應(yīng)用類型

2酶聯(lián)免疫測定（ELISA）

3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

4酶生物傳感器

5酶抑制率法重點第2頁,共104頁，2024年2月25日，星期天酶法分析的定義酶法分析是以酶作為分析試劑，利用酶催化反應(yīng)的特異性和高效性的特點，定性、定量的檢測待測物。酶活力測定：測定樣品中酶的含量或酶活力酶法分析：定性或定量的檢測分析物第3頁,共104頁，2024年2月25日，星期天酶法分析的發(fā)展酶在定量分析中的應(yīng)用可以追溯到19世紀(jì)中期。當(dāng)時，曾采用麥芽提取物作為過氧化物酶源，以愈創(chuàng)木酚作為共底物或指示劑測定過氧化氫。然而，酶法分析真正的發(fā)展應(yīng)歸于它在臨床實驗室中的廣泛應(yīng)用。第4頁,共104頁，2024年2月25日，星期天酶法分析的發(fā)展如早在1914年臨床上就開始采用脲酶測定尿中的尿素，但是在臨床實驗室中酶分析的真正突破要推遲到1958年，當(dāng)時轉(zhuǎn)氨酶分析發(fā)展成為診斷肝病和心臟病的一個有效手段。到了20世紀(jì)50年代前已有60種物質(zhì)能借助于酶法分析。近年來，酶法分析發(fā)展迅速，廣泛應(yīng)用于臨床檢驗、食品、環(huán)境等生物及其它樣品的檢測。第5頁,共104頁，2024年2月25日，星期天1.酶法分析的特點及應(yīng)用類型酶的特性酶法檢測的特點催化效率高專一性靈敏性強快速特異性、準(zhǔn)確不需要物理分離，干擾少第6頁,共104頁，2024年2月25日，星期天酶法定量檢測動力學(xué)法：單位時間內(nèi)酶促反應(yīng)速率要求：底物、pH、溫度、樣品、空白與對照測定方法：取樣測定法、連續(xù)測定法第7頁,共104頁，2024年2月25日，星期天酶偶聯(lián)反應(yīng)法酶偶聯(lián)法測定，即在反應(yīng)體系中加入一個或幾個工具酶，將待測酶生成的某一產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為新的可直接測定的產(chǎn)物，當(dāng)加入酶的反應(yīng)速度與待測酶反應(yīng)速度達(dá)到平衡時，可以用指示酶的反應(yīng)速度來代表待測酶的活性。在酶活性測定時，如果底物或產(chǎn)物不能直接測定或難于準(zhǔn)確測定，可采用此方法。ExEaEi

A→B→C→p式中A為底物，B、C為中間產(chǎn)物，P為可直接測定的產(chǎn)物；Ex為待測酶，Ea和Ei都為工具酶，依據(jù)工具酶作用的不同又分別稱為輔助酶和指示酶；輔助酶在酶偶聯(lián)反應(yīng)中可以一個或多個，也可以不需要；指示酶是指能監(jiān)測反應(yīng)速度的酶。臨床酶學(xué)分析中，以NAD（P）H/NAD（P）+為輔酶的脫氫酶和以H2O2為底物的過氧化物酶（POD）是常用的指示酶。

第8頁,共104頁，2024年2月25日，星期天①比色法如果酶反應(yīng)的產(chǎn)物可與特定的化學(xué)試劑反應(yīng)而生成穩(wěn)定的有色溶液，且生成顏色的深淺與產(chǎn)物的濃度在一定的范圍內(nèi)有線性關(guān)系可用此法。如蛋白酶的活力測定：蛋白酶可水解酪蛋白，產(chǎn)生的酪氨酸可與福林試劑反應(yīng)生成穩(wěn)定的藍(lán)色化合物，在一定的濃度范圍內(nèi)，所生成藍(lán)色化合物顏色的深淺與酪氨酸的量之間有線性關(guān)系，可用于定量測定。②量氣法主要用于有氣體產(chǎn)生的酶促反應(yīng)。如氨基酸脫羧酶、脲酶的活力測定。產(chǎn)生的二氧化碳量可用特制的儀器如瓦氏呼吸儀測定之。根據(jù)氣體變化和時間的關(guān)系，即可求得酶反應(yīng)的速度。③滴定法如果產(chǎn)物之一是自由的酸性物質(zhì)可用此法。如脂肪酶催化脂肪水解，脂肪酸的增加量代表脂肪酶的活力。第9頁,共104頁，2024年2月25日，星期天④分光光度法

利用底物和產(chǎn)物光吸收性質(zhì)的不同，可直接測定反應(yīng)混合物中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量。幾乎所有的氧化還原酶都使用該法測定。如還原型輔酶Ⅰ(NADH2)和輔酶Ⅱ(NADPH2)在340nm有吸收，而NAD和NADP在該波長下無吸收，脫氫酶類可用該法測定。該法測定迅速簡便，自動掃描分光光度計的使用對酶活力的快速準(zhǔn)確的測定提供的極大的方便。⑤放射測量法是酶活力測定中較常用的一種方法。一般用放射性同位素標(biāo)記底物，在反應(yīng)進(jìn)行到一定程度時，分離帶放射性同位素標(biāo)記的產(chǎn)物并進(jìn)行測定，就可測知反應(yīng)進(jìn)行的速度。常用的同位素有3H，14C，32P，35S，131I等。如脲酶，將底物尿素用14C標(biāo)記，產(chǎn)生的帶放射性的CO2氣體可用標(biāo)準(zhǔn)計數(shù)法進(jìn)行測定。第10頁,共104頁，2024年2月25日，星期天⑥酶偶聯(lián)分析某些酶本身沒有合適的測定方法，但可偶聯(lián)另一個酶反應(yīng)進(jìn)行測定。其基本方法為：應(yīng)用某一高度專一性的工具酶使被測酶反應(yīng)能繼續(xù)進(jìn)行到某一可直接連續(xù)且簡便準(zhǔn)確測定階段的方法。如：被測E1反應(yīng)的產(chǎn)物B是某一脫氫酶(E2)的底物，向反應(yīng)體系中加入足量的脫氫酶和NAD+或NADPH+，使反應(yīng)由A經(jīng)B繼續(xù)進(jìn)行到C，然后測定NADH或NADPH的特征吸收光譜的變化，即可間接地測定E1的活力大小。如己糖激酶的活力測定即應(yīng)用這一方法。注意：使用該法要求指示酶必須很純，且具有高度的專一性，以免干擾反應(yīng)而給測定帶來麻煩。第11頁,共104頁，2024年2月25日，星期天終點法：完成一定量反應(yīng)所需要的時間。如α-淀粉酶的活力測定。因為碘對淀粉呈現(xiàn)藍(lán)色反應(yīng)，當(dāng)?shù)矸廴芤褐屑尤氲矸勖负螅獾乃{(lán)色反應(yīng)消失而呈現(xiàn)紅棕色；碘對淀粉顏色反應(yīng)消失的時間可表示淀粉酶活力的大小。碘對淀粉顏色反應(yīng)消失花的時間越短，表示酶的活力越高第12頁,共104頁，2024年2月25日，星期天對酶法分析來說，其適用范圍僅限于與酶促反應(yīng)相關(guān)的物質(zhì)的檢測分析，包括酶的底物、輔酶、酶的抑制劑或激活劑的測定。酶法分析的檢測物質(zhì)范圍有限，但不影響其在臨床診斷、食品分析、環(huán)境檢測和基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用。近年來，酶的固定化技術(shù)和生物傳感器的快速發(fā)展和應(yīng)用，其低成本、高精度、快速檢測和自動化分析的特點拓寬了酶法分析的應(yīng)用領(lǐng)域。第13頁,共104頁，2024年2月25日，星期天

酶在食品分析中的應(yīng)用類型1.去除樣品中的雜質(zhì)。如測定果糖、多糖等。2.催化待測物生成新的產(chǎn)物，而這種產(chǎn)物更容易被定量分析。如：淀粉的測定。3.測定食品中酶的活性作為食品的指標(biāo)，如過氧化物酶的測定。4.利用酶催化反應(yīng)所產(chǎn)生的一些信息。如酶聯(lián)免疫法、酶電極法等。第14頁,共104頁，2024年2月25日，星期天第15頁,共104頁，2024年2月25日，星期天第16頁,共104頁，2024年2月25日，星期天2酶聯(lián)免疫測定（ELISA）酶聯(lián)免疫測定（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）是繼放射免疫測定技術(shù)之后發(fā)展起來的一項新的免疫學(xué)技術(shù)。ELISA自上世紀(jì)70年代出現(xiàn)開始，就因其高度的準(zhǔn)確性、特異性、適用范圍寬、檢測速度快以及費用低等優(yōu)點，在臨床和生物疾病診斷與控制等領(lǐng)域中倍受重視，成為檢驗中最為廣泛應(yīng)用的方法之一。第17頁,共104頁，2024年2月25日，星期天ELISA是將酶分子與抗體分子連接成一個酶標(biāo)分子，當(dāng)它與固相免疫吸附中相應(yīng)抗原或抗體復(fù)合物相遇時形成酶-抗原-抗體結(jié)合物，加入酶底物，底物被催化成可溶性或不溶性顯色產(chǎn)物，可用肉眼或分光光度計定性或定量，根據(jù)顯色深淺，確定待測抗原或抗體的濃度與活性。第18頁,共104頁，2024年2月25日，星期天

免疫學(xué)的基本概念

抗體（antibody）和抗原（antigen）

抗體是一種免疫球蛋白。免疫球蛋白有5種，分別命名為IgG，IgA，IgM，IgD和IgE。無脊椎動物不產(chǎn)生免疫球蛋白，魚有IgM,兩棲類有IgM和IgG，除人類有5種免疫球蛋白外，大多數(shù)哺乳動物只有IgG，IgA，IgM和IgE四種免疫球蛋白。第19頁,共104頁，2024年2月25日，星期天

抗原是一種進(jìn)入機體后能刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的物質(zhì)。它可能是生物體（如各種微生物），也可能是非生物體（如各種異類蛋白、多糖等）。

通常，抗原分子量大于10000，而且具有一定結(jié)構(gòu)（如苯環(huán)或雜環(huán)等結(jié)構(gòu)）的物質(zhì)均可成為抗原性物質(zhì)，都能有效地誘發(fā)產(chǎn)生抗體。

第20頁,共104頁，2024年2月25日，星期天

有些分子量較小的物質(zhì)，如某些藥物和激素在動物體內(nèi)并不產(chǎn)生抗體。但將這種小分子量的物質(zhì)用化學(xué)法結(jié)合到某種載體（通常是大分子蛋白質(zhì)）上，再用這種結(jié)合物可誘發(fā)產(chǎn)生抗體。通常把這樣一些小分子量物質(zhì)稱為半抗原。第21頁,共104頁，2024年2月25日，星期天

用半抗原的結(jié)合物誘發(fā)產(chǎn)生的抗體，其中有些是抗這個半抗原的抗體，可與其半抗原結(jié)合。由此可見，若待測物是具有特定結(jié)構(gòu)的大分子蛋白質(zhì)，可直接用來制備抗體；若為分子量較小的半抗原，則需將它進(jìn)行化學(xué)修飾結(jié)合到大分子載體上才能誘發(fā)產(chǎn)生抗半抗原的抗體。第22頁,共104頁，2024年2月25日，星期天2.1ELISA的基本原理（1）利用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接（或建立關(guān)聯(lián)）。（2）通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定。它將酶促反應(yīng)的高效率和免疫反應(yīng)的高度專一性有機地結(jié)合起來，可對生物體內(nèi)各種微量有機物的含量進(jìn)行測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。重點第23頁,共104頁，2024年2月25日，星期天ELISA試劑盒的組成完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：（1）包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）；（3）酶作用的底物（顯色劑）；（4）陰性和陽性對照品（定性測定），參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測定）；（5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；（6）洗滌液；（含吐溫20磷酸鹽緩沖液）（7）酶反應(yīng)終止液。（常用硫酸）必需第24頁,共104頁，2024年2月25日，星期天酶標(biāo)儀和酶標(biāo)板DNM-9602A酶標(biāo)分析儀酶標(biāo)板第25頁,共104頁，2024年2月25日，星期天第26頁,共104頁，2024年2月25日，星期天第27頁,共104頁，2024年2月25日，星期天第28頁,共104頁，2024年2月25日，星期天第29頁,共104頁，2024年2月25日，星期天第30頁,共104頁，2024年2月25日，星期天第31頁,共104頁，2024年2月25日，星期天第32頁,共104頁，2024年2月25日，星期天第33頁,共104頁，2024年2月25日，星期天第34頁,共104頁，2024年2月25日，星期天第35頁,共104頁，2024年2月25日，星期天第36頁,共104頁，2024年2月25日，星期天第37頁,共104頁，2024年2月25日，星期天第38頁,共104頁，2024年2月25日，星期天第39頁,共104頁，2024年2月25日，星期天ELISA影響因素試劑因素標(biāo)本因素實驗原理或操作方法環(huán)境因素第40頁,共104頁，2024年2月25日，星期天試劑因素抗原抗體的純度標(biāo)準(zhǔn)品定值的準(zhǔn)確性抗體的親和力、滴度和特異性標(biāo)記物的比活性或免疫活性第41頁,共104頁，2024年2月25日，星期天第42頁,共104頁，2024年2月25日，星期天第43頁,共104頁，2024年2月25日，星期天第44頁,共104頁，2024年2月25日，星期天2.2ELISA的基本類型隨著ELISA在生物檢測分析領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的情況以及檢測的具體條件，逐漸演變出了幾種不同類型的檢測方法：（5）捕獲法測IgM抗體；（6）ABS-ELISA法；（7）PCR-酶聯(lián)免疫測定法；（8）斑點免疫酶結(jié)合試驗。（1）夾心法；（2）間接法；（3）競爭法；（4）雙位點一步法；第45頁,共104頁，2024年2月25日，星期天雙抗體夾心法此法常用于測定抗原,將已知抗體吸附于固相載體,加入待檢標(biāo)本(含相應(yīng)抗原)與之結(jié)合。溫育后洗滌，加入酶標(biāo)抗體和底物進(jìn)行測定。（1）雙抗體夾心法乙肝表面抗原。第46頁,共104頁，2024年2月25日，星期天第47頁,共104頁，2024年2月25日，星期天間接法此法是測定抗體最常用的方法。將已知抗原吸附于固相載體，加入待檢標(biāo)本(含相應(yīng)抗體)與之結(jié)合。洗滌后，加入酶標(biāo)抗球蛋白抗體(酶標(biāo)抗抗體)和底物進(jìn)行測定。（2）間接法ELISA第48頁,共104頁，2024年2月25日，星期天第49頁,共104頁，2024年2月25日，星期天第50頁,共104頁，2024年2月25日，星期天競爭法此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體。以測定抗原為例,將抗原吸附于固相載體；加入待測抗原和一定量特異性抗體，使固相抗原與待測抗原二者競爭與抗體結(jié)合；經(jīng)過洗滌分離，最后結(jié)合于固相的抗體與待測抗原含量呈負(fù)相關(guān)。（3）競爭法第51頁,共104頁，2024年2月25日，星期天第52頁,共104頁，2024年2月25日，星期天2.3ELISA測定中酶的作用由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定具有極高的靈敏度。第53頁,共104頁，2024年2月25日，星期天（1）酶標(biāo)記的抗體或抗原的制備酶標(biāo)記的抗體或抗原是ELISA中最關(guān)鍵的試劑。良好的結(jié)合物既保持了酶的催化活性，也保持了抗體或抗原的免疫活性。酶標(biāo)記抗體的制備主要有戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法兩種方法。酶結(jié)合物一般需經(jīng)離子交換層析或分子篩分離純化。第54頁,共104頁，2024年2月25日，星期天（2）常用的酶及底物酶底物顯色反應(yīng)

測定波長

辣根過氧化物酶鄰苯二胺四甲替聯(lián)苯胺氨基水楊酸鄰聯(lián)苯甲胺2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽橘紅色黃色棕色蘭色藍(lán)綠色492460449

425

642堿性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸鹽(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色紅色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色藍(lán)色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶

甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光黃色

360,450

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為什么辣根過氧化物酶可應(yīng)用于ELISA？第55頁,共104頁，2024年2月25日，星期天為什么辣根過氧化物酶可應(yīng)用于ELISA？（1）成本低（2）熱穩(wěn)定性好（3）顯色反應(yīng)類型多第56頁,共104頁，2024年2月25日，星期天2.4ELISA技術(shù)在食品分析中的應(yīng)用近年來，ELISA因其操作程序的規(guī)范化、簡單化和檢測的高靈敏性，在農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、重要有機物污染、生物毒素、食品添加劑和人畜共患疾病病原體的快速檢測和分析等食品安全性檢測領(lǐng)域正逐步推廣應(yīng)用。第57頁,共104頁，2024年2月25日，星期天（1）毒素檢測真菌毒素是真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，其中的十幾種對人類危害較大，它們一般同時具有毒性強和污染頻率高的特點。其中毒性最大、致癌能力最強的是黃曲霉毒素。它在自然界中分布十分廣泛，黃曲霉常常和其他多種微生物在一起，生長在糧食、油料作物的種子、各種食品和飼料中。細(xì)菌毒素——金黃色葡萄球菌毒素第58頁,共104頁，2024年2月25日，星期天自1977年抗黃曲霉素B1的單克隆問世至今，幾乎所有重要真菌毒素如伏馬毒素、赭曲毒素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯酮、展青霉素等的ELISA檢測方法均已建立。在對黃曲霉素B1(AFTB1)的檢測中，其檢測AFTB1的線性范圍0.25～5.Oμg/mL，靈敏度為12.5pg。另外該方法也正在被廣泛地應(yīng)用于各種藻類和貝類毒素的檢測。第59頁,共104頁，2024年2月25日，星期天黃曲霉素B1ELISA試劑盒

本試劑盒包括用于定量檢測黃曲霉素B-G的試劑和方法。檢測數(shù)量：96孔（包括標(biāo)準(zhǔn)）檢測時間：20分鐘第60頁,共104頁，2024年2月25日，星期天（2）農(nóng)藥殘留檢測酶聯(lián)免疫測定已成為許多國際權(quán)威分析機構(gòu)如美國官方分析化學(xué)師協(xié)會(AssociationofAnalyticalCommunities，AOAC)分析農(nóng)藥殘留的首選方法。迄今為止，應(yīng)用酶聯(lián)免疫測定檢測食品中的殘留農(nóng)藥主要為除草劑、殺蟲劑和殺菌劑。草甘膦的ELISA檢出下限為0.07μg/mL，與色譜法測定的結(jié)果一致。第61頁,共104頁，2024年2月25日，星期天從目前來看，盡管ELISA檢測限度還不能完全達(dá)到國外發(fā)達(dá)國家技術(shù)法規(guī)和限量標(biāo)準(zhǔn)的要求，而且有抗體制備不易和不能同時完成多種農(nóng)藥殘留檢測等缺點，但是由于該技術(shù)具有樣本前處理簡單，純化步驟少，大量樣本分析時間短，適合于做成試劑盒現(xiàn)場篩選等優(yōu)點，使其可在蔬菜產(chǎn)區(qū)、蔬菜批發(fā)市場和海關(guān)配備，工商人員可隨身攜帶或建立固定的農(nóng)藥殘留速測點，隨時把殘毒超標(biāo)的蔬菜、水果杜絕在食用之前。第62頁,共104頁，2024年2月25日，星期天（3）細(xì)菌污染檢測食品中的有害細(xì)菌數(shù)量達(dá)到一定數(shù)目，食用后會引起各種疾病。為了有效地控制其傳播，就必須有快速和可靠的檢測方法。目前有許多種方法，其中通過制備單克隆抗體分析食品中細(xì)菌的酶聯(lián)免疫測定技術(shù)研究最多，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。第63頁,共104頁，2024年2月25日，星期天沙門氏菌的ELISA檢測例如對沙門氏菌最低檢測量可達(dá)500CFU/g，僅需22h，比常規(guī)方法縮短了3～4d，與金黃色葡萄球菌、大腸桿菌無交叉反應(yīng)。此外以ELISA技術(shù)為基礎(chǔ)的全自動沙門氏菌檢測系統(tǒng)，實現(xiàn)了整個過程的自動化，全程耗時僅為45min。其原理是將捕捉抗體包被到凹形金屬片的內(nèi)面，可以從前增菌液中吸附被檢的沙門氏菌，對于該系統(tǒng)來說，需要做的只是加樣（生物梅里埃公司）。第64頁,共104頁，2024年2月25日，星期天李斯特氏菌的快速檢測在對李斯特氏菌的快速檢測中，利用三株針對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、無害李斯特氏菌和西里杰氏李斯特氏菌共同表位的單抗，以夾心ELISA法，在48h內(nèi)，可從人工模擬肉中檢測下限為5CFU/g樣品。第65頁,共104頁，2024年2月25日，星期天（4）肉類品質(zhì)檢測ELISA在肉類食品品質(zhì)檢測中的應(yīng)用主要包括加熱終溫判定分析和摻入異種肉的檢測兩個方面。腸道疾病的爆發(fā)和動物性食品有很大關(guān)系，而肉食品加熱煮制不當(dāng)是引起該疾病爆發(fā)的一個主要原因。在加熱過程中一些成分的含量會降低，而一些產(chǎn)物的濃度會提高。第66頁,共104頁，2024年2月25日，星期天當(dāng)用蛋白質(zhì)做指示劑時，可制備抗體，這種抗體對單一蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)或變性狀態(tài)均具有專一性，這樣它就可以指示蛋白質(zhì)在加熱過程中變化。因而ELISA可作為商業(yè)上快速判定分析肉品終溫的一種方法。目前用的最多的是對乳酸脫氫酶的免疫檢測。其次是對摻入異種肉的檢測，利用多克隆抗體對血清白蛋白的酶聯(lián)免疫測定法，對鮮肉進(jìn)行摻假檢測。第67頁,共104頁，2024年2月25日，星期天幾種以單克隆抗體為基礎(chǔ)的ELISA反應(yīng)已得到應(yīng)用，可以檢測出1%～2%的摻假率。目前在商業(yè)上，酶聯(lián)免疫測定已可以檢測十多種動物肉，該方法已為美國農(nóng)業(yè)部使用。同時，ELISA技術(shù)也可以利用對熱穩(wěn)定的肌肉抗原來檢測加熱處理后的肉摻假情況。目前，該技術(shù)可以檢測6種家畜熟肉制品。第68頁,共104頁，2024年2月25日，星期天（5）動物性食品中藥物殘留檢測利用ELISA技術(shù)測定動物性食品中有害殘留成分只是近幾年的事。隨著研究的深入，由原樣品的復(fù)雜處理和抽提發(fā)展為只需要高度純化過程，加速了其在實際檢測中的應(yīng)用。特別是對豬肉、禽肉和水產(chǎn)品中重要禁用獸藥的檢測。第69頁,共104頁，2024年2月25日，星期天如瘦肉精（鹽酸克倫特羅）酶聯(lián)免疫檢測法，基于抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行競爭性抑制測定，不僅可作為一個定性篩選過程，也可以進(jìn)一步進(jìn)行定量測定。檢測靈敏度可達(dá)到0.5×10-9，完全達(dá)到我國農(nóng)業(yè)部目前的1×10-9監(jiān)督檢測標(biāo)準(zhǔn)。ELISA法作為鹽酸克倫特羅殘留量的篩選方法具有操作簡便、準(zhǔn)確快速的特點，適用于大量樣品的測定，并可能成為國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。第70頁,共104頁，2024年2月25日，星期天（6）人畜共患疾病病原體檢測在禽流感病毒檢測方面，我國已完成了禽流感流行株的分離和鑒定、禽流感重組核蛋白診斷抗原的研制及應(yīng)用，建立了禽流感免疫酶診斷方法和技術(shù)，已形成試劑盒生產(chǎn)能力。此外，采用ELISA法可以有效檢測牛及羊朊病毒蛋白，該蛋白可引起牛的病理性海綿狀病毒，是一種致死性神經(jīng)系統(tǒng)疾?。ǒ偱２?，BSE），與人群發(fā)生變異型克雅氏?。╒CJD）有關(guān)。第71頁,共104頁，2024年2月25日，星期天（7）重金屬污染檢測金屬硫蛋白遍存于自然界，細(xì)菌、植物、動物以及人類肌體中，是一類對重金屬離子有很強親和力，含豐富的半胱氨酸（約1/3），不含芳香族氨基酸和組氨酸的低分子量蛋白質(zhì)。金屬硫蛋白含有大量的-SH，能與Hg、Cu、Ag等重金屬離子結(jié)合掩蔽金屬的毒性，對細(xì)胞內(nèi)的金屬離子有重要的解毒作用。第72頁,共104頁，2024年2月25日，星期天生物細(xì)胞，在環(huán)境受重金屬污染（Cu、Hg、Pb、Zn與金屬離子）的情況下，可被誘導(dǎo)合成出大量的金屬硫蛋白，且在一定范圍內(nèi)成正比，是一項對金屬污染具特異性的指標(biāo)。用純化的金屬硫蛋白對兔進(jìn)行免疫，兔抗血清純化后并標(biāo)記辣根過氧化酶，可實現(xiàn)對食品中重金屬污染的超微量檢測。第73頁,共104頁，2024年2月25日，星期天（8）食物中其它成分檢測ELISA技術(shù)同時可以用于食品中其它成分的檢測，如:(1)檢測某些特定的轉(zhuǎn)移基因表達(dá)蛋白，以分析食品是否來自轉(zhuǎn)基因生物或者含有轉(zhuǎn)基因成分；（2）食品中營養(yǎng)素的測定，最小檢出限可達(dá)0.05μg/g；（3）通過合成不同異黃酮的羥酸半抗原，分析植物中含量很低的雌激素；（4）可用于檢測食品加工過程中的酶（如磷酸丙糖異構(gòu)酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶）含量的變化等。第74頁,共104頁，2024年2月25日，星期天3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）第75頁,共104頁，2024年2月25日，星期天PCR檢測的原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）以特定的基因片段為模板，利用人工合成的一段寡聚核苷酸為引物，以四種脫氧核苷酸為底物，在DNA聚合酶的作用下，通過DNA模板的變性，達(dá)到基因擴(kuò)增的目的。PCR是目前轉(zhuǎn)基因食品檢測較為成熟的方法。第76頁,共104頁，2024年2月25日，星期天第77頁,共104頁，2024年2月25日，星期天我國已應(yīng)用PCR-酶聯(lián)免疫測定檢測技術(shù)，建立了轉(zhuǎn)基因大豆與玉米中常用外源基因的快速檢測體系，并應(yīng)用于進(jìn)出境產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因檢測實際工作中，結(jié)果表明，PCR-酶聯(lián)免疫測定法具有操作簡便、靈敏特異、結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)點，可對轉(zhuǎn)基因大豆、玉米及其它轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行定性和定量檢測。第78頁,共104頁，2024年2月25日，星期天PCR檢測的應(yīng)用對熱處理后的熟肉樣品，要檢測出肉制品中肉的組成比較困難，但經(jīng)PCR后檢測，牛肉、豬肉、雞肉和火雞肉的最小檢測量可以達(dá)到1%～2%，而且肉制品中的抗壞血酸添加劑不影響檢測結(jié)果。目前，PCR是區(qū)分雞肉和火雞肉的唯一方法。PCR也用于食品中腐敗菌、病原菌如腸道出血性大腸桿菌、沙門氏菌、弧菌、金黃色葡萄球菌等的檢測。第79頁,共104頁，2024年2月25日，星期天4酶生物傳感器酶傳感器主要利用酶對生物體的催化特性，且對特定底物有反應(yīng)的特異性，把這種特異性與電化學(xué)分析的迅速性和簡便性結(jié)合起來，從含有多種多樣有機物的生物試樣中，有選擇地把特定物質(zhì)迅速測定出來。第80頁,共104頁，2024年2月25日，星期天酶生物傳感器的簡圖第81頁,共104頁，2024年2月25日，星期天酶傳感器能反復(fù)進(jìn)行檢測，不需要通常進(jìn)行酶分析時需要的酶和顯示劑，實現(xiàn)無試劑分析，因此，發(fā)展較快，現(xiàn)已有多酶傳感器，可用在生產(chǎn)線上監(jiān)控食品加工流程、發(fā)酵工藝過程及微生物濃度的控制，又可在包裝材料上測知食品是否經(jīng)過不當(dāng)溫度的貯存，冷凍時微生物含量及貯存壽命的預(yù)警。第82頁,共104頁，2024年2月25日，星期天生物傳感器實例國內(nèi)外得到應(yīng)用的生物傳感器主要包括：1測定水質(zhì)的BOD分析儀、在市場上有以日本和德國為代表產(chǎn)品供應(yīng)。2采用絲網(wǎng)印刷和微電子技術(shù)的手掌型血糖分析器，已形成規(guī)模化生產(chǎn)，年銷售量約為十億美元；3固定化酶傳感分析儀：國外以美國的YSI公司和德國BST公司為代表，都有系列分析儀產(chǎn)品，它們主要用于環(huán)境監(jiān)測和食品分析，國內(nèi)到目前為止只有山東省科學(xué)院生物研究所的系列化產(chǎn)品在市場得到應(yīng)用。4SPR生物傳感器，在日、美、德、瑞典等國得到了開發(fā)和初步應(yīng)用。第83頁,共104頁，2024年2月25日，星期天德國研發(fā)的環(huán)境廢水BOD分析儀第84頁,共104頁，2024年2月25日，星期天手掌型葡萄糖(glucose)分析儀第85頁,共104頁，2024年2月25日，星期天SBA-50型單電極生物傳感分析儀，是SBA-30型乳酸分析儀的更新?lián)Q代產(chǎn)品第86頁,共104頁，2024年2月25日，星期天SBA-40C生物傳感分析儀第87頁,共104頁，2024年2月25日，星期天SBA-70型血糖乳酸自動分析儀第88頁,共104頁，2024年2月25日，星期天生物傳感器在食品工業(yè)中的應(yīng)用（一）、檢測食品鮮度1.魚鮮度傳感器

魚、貝類水產(chǎn)品的鮮度是評價其質(zhì)量的重要指標(biāo)。魚死后體內(nèi)ATP經(jīng)酶解依次形成ADP、AMP、IMP、肌苷、次黃嘌呤和尿酸。因此有人提出用K值表示鮮度：肌苷+次黃嘌呤K(%)=ATP+ADP+AMP+IMP+肌苷+次黃嘌呤+尿酸第89頁,共104頁，2024年2月25日，星期天由于大多數(shù)魚死后5-20小時，ATP、ADP和AMP已分解殆盡，所以魚的鮮度主要取決于以下三個步驟：即IMP肌苷次黃嘌呤尿酸因此K值可簡化為Ki：肌苷+次黃嘌呤Ki=

×100%

IMP+肌苷+次黃嘌呤第90頁,共104頁，2024年2月25日，星期天Ki值越小，魚越新鮮。采用催化上述三步驟的三種酶即5′-核苷酸酶、核苷磷酸化酶、黃嘌呤氧化酶固定化后制成酶膜與氧電極構(gòu)成了測定魚肉的鮮度計。電極工作原理是以次黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶反應(yīng)所消耗的氧量所對應(yīng)的氧電極的電流改變值為基礎(chǔ)。第91頁,共104頁，2024年2月25日，星期天2.肉鮮度傳感器肉類在腐敗過程中會產(chǎn)生各種胺類，故測定胺類也能反應(yīng)肉類的新鮮程度。用腐胺氧化酶與過氧化氫電極構(gòu)成多胺生物傳感器，測定魚肉在貯藏過程中的鮮度，響應(yīng)時間40s，測定腐胺線性范圍為0.03×10-6-3×10-6mol/L。第92頁,共104頁，2024年2月25日，星期天Kress等人開發(fā)了一種快速測定肉類鮮度的匕首型生物傳感器，其探頭可現(xiàn)場刺入食品表面2-4mm深處，通過測定葡萄糖濃度評價肉類食品的新鮮度。3.牛乳鮮度傳感器牛乳鮮度可以通過乳中的菌數(shù)或乳酸含量來判斷，牛乳鮮度傳感器實際上就是一個菌數(shù)測定儀或乳酸測定儀。另外也可通過測定短鏈脂肪酸含量判斷乳及乳制品的鮮度。第93頁,共104頁，2024年2月25日，星期天（二）發(fā)酵中的應(yīng)用1、發(fā)酵中葡萄糖測定過去用操作繁瑣時間長的還原糖測定方法只能近似地估計葡萄糖的變化。酶傳感器提供了快速而準(zhǔn)確的固定化酶的測定方法，發(fā)酵過程中可根據(jù)糖消耗確定微生物的生長速率，觀察是否染菌，隨時與產(chǎn)物的產(chǎn)生一起估算轉(zhuǎn)化率，確定補料效果和及時判斷發(fā)酵結(jié)束的時間。發(fā)酵過程或設(shè)備異?，F(xiàn)象通過葡萄糖分析得到及時預(yù)報。第94頁