通關(guān)藤致U937 細(xì)胞凋亡效應(yīng)與機(jī)制

通關(guān)藤致U937細(xì)胞凋亡效應(yīng)與機(jī)制

摘要：目的：研究通關(guān)藤對U937細(xì)胞凋亡效應(yīng)與調(diào)控及周期改變。方法：應(yīng)用噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測不同濃度通關(guān)藤對U937細(xì)胞的增殖抑制作用，以Annexin-Ⅴ/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡，以RT-PCR法檢測bax、bcl-2、p53的基因表達(dá)水平的改變。結(jié)果：10、20、40、80μL/mL通關(guān)藤對U937細(xì)胞染毒24h后，細(xì)胞相對增殖率為93.33%、86.20%、76.42%、56.75%，10、20、40、80μL/mL通關(guān)藤對U937細(xì)胞染毒24h后的凋亡率為5.67%、7.51%、13.49%、21.61%，10、20、40μL/mL通關(guān)藤對U937細(xì)胞染毒24h后bax/bcl-2的比值為1.35、2.58、4.45，p53的相對表達(dá)水平為1.57、2.36、3.57。結(jié)論：通關(guān)藤能抑制U937細(xì)胞生長，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，且具有劑量反應(yīng)關(guān)系，其凋亡的機(jī)制可能與Bax/Bcl-2的上升，及p53的mRNA表達(dá)的上調(diào)有關(guān)。關(guān)鍵詞：通關(guān)藤；U937細(xì)胞；細(xì)胞毒性；Bax/Bcl-2；P53近年來，傳統(tǒng)中藥通關(guān)藤在實(shí)體瘤的臨床治療中取得了較好的療效[1-3]。但通關(guān)藤注射液在血液腫瘤治療中應(yīng)用較少。有研究表明，低濃度的通關(guān)藤可誘導(dǎo)白血病NB4細(xì)胞分化，高濃度可通過線粒體途徑誘導(dǎo)白血病細(xì)胞U937，HL60凋亡[4-5]。為進(jìn)一步探討通關(guān)藤抗白血病的作用及相關(guān)凋亡的可能機(jī)制，本文用體外對U937細(xì)胞進(jìn)行不同濃度的通關(guān)藤染毒，觀察對U937細(xì)胞的抑制作用，對細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期的影響并檢測相關(guān)基因的表達(dá)。1材料與方法1.1材料1.1.1細(xì)胞株：U937細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。1.1.2主要試劑及儀器：通關(guān)藤注射液(消癌平注射液，20mL/支，批號:20070405111)、凱基活細(xì)胞/凋亡細(xì)胞/壞死細(xì)胞鑒別試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；MithrasLB941多功能酶標(biāo)儀（德國Bertholdtechnologics），PCR儀(Eppendorf-AG)，凝膠成像處理系統(tǒng)(ChemilmagerTM5500Alphainnotech)，ABI7300型熒光定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)中國公司）。1.2方法1.2.1通關(guān)藤對U937細(xì)胞的增值抑制作用以含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基正常培養(yǎng)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)時(shí)取對數(shù)生長期細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24h，用含通關(guān)藤終濃度為，10、20、40、80μL/mL的培養(yǎng)基100μl染毒24h，每個(gè)劑量設(shè)3個(gè)平行。染毒結(jié)束后吸取培養(yǎng)基，加入含10%MTT的無血清培養(yǎng)基100μl作用4h，再吸取培養(yǎng)基，加入150?lDMSO溶解藍(lán)紫色結(jié)晶物，每孔平行吸取三次各150?l到96孔板在酶標(biāo)儀上選擇490nm波長測定各孔吸光度值(A)。按公式計(jì)算各組細(xì)胞相對增值率，細(xì)胞相對增值率(%)=(各染毒組A值-空白組A值)×100%/（陰性對照A值-空白組A值)。1.2.2通關(guān)藤對U937細(xì)胞凋亡作用取對數(shù)生長期細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于六孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24h。劑量效應(yīng)研究：用含通關(guān)終濃度為0、10、20、40、80μl/ml的培養(yǎng)基3ml分別染毒24h；每組設(shè)3個(gè)平行。染毒結(jié)束后，胰酶消化，離心（2000轉(zhuǎn)，5min）收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次（2000轉(zhuǎn)，5min），加入500μL的BindingBuffer懸浮細(xì)胞；加入5μLAnnexinV-FITC混勻后，加入5μLPropidiumIodide，混勻。室溫，避光，反應(yīng)15min。用流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長Ex=488nm；發(fā)射波長Em=530nm。AnnexinV-FITC的綠色熒光通過FITC通道（FL1）檢測；PI紅色熒光通過PI通道（FL2或FL3）檢測。1.2.3通關(guān)藤對U937細(xì)胞Bax、Bcl-2和p53表達(dá)影響同以上染毒方法獲取細(xì)胞，trizol法提取總RNA，用RT-PCR方法檢測腫瘤細(xì)胞Bax、Bcl-2和p53基因表達(dá)。設(shè)計(jì)引物如下：Bax引物：上游：5’-GGTGCCTCAGGATGCG-3’，下游：5’-GGAGTCTGTGTCCACG-3’，擴(kuò)增片段115bp；Bcl-2引物：上游：5-TCGATGTGATGCCTCTGCGAAGAAC-3’，下游：5’-ATTGCACTGCCAAACGGAGCTG-3’，擴(kuò)增片段112bp；以β-actin為參比基因：上游：5’-ATCCGCAAAGACCTGT-3’，下游：5’-GGGTGTAACGCAACTAAG-3’，擴(kuò)增片段293bp。反應(yīng)條件：9