注射用雙黃連對細菌生物膜影響分析

注射用雙黃連對細菌生物膜影響分析

【摘要】目的：建立大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細菌生物膜（BBF）的模型，考察注射用雙黃連對BBF形成的影響及抑制作用。方法：在特定的條件、方法下分別對細菌單獨培養(yǎng)和細菌與提取物共同培養(yǎng)，通過酶標儀測量其OD值來考察BBF的生長能力。結(jié)果：注射用雙黃連對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌BDF的形成均有抑制作用?！娟P鍵詞】雙黃連；細菌生物膜；影響建立大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細菌生物膜（BBF）的模型，考察注射用雙黃連對BBF形成的影響及抑制作用。1BBF模型的建立1.1大腸桿菌BBF模型的建立1.1.1菌種的復活將大腸桿菌凍干粉加入0.4mlNB培養(yǎng)基溶解后，放入37℃恒溫振蕩器（230～240轉(zhuǎn)/分鐘）中培養(yǎng)8小時，分裝在離心管中，加入0.5ml的50%甘油，置于液氮中，于-80℃冰箱中冷藏保存。1.1.2大腸桿菌BBF模型建立的方法將置于-80℃冰箱中的大腸桿菌劃線于NB培養(yǎng)基的平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱中，于36℃培養(yǎng)24小時。挑取平板上的單一菌落溶于5mlNB液體培養(yǎng)基中，于36℃恒溫振蕩器中振蕩8小時，得到單克隆細菌增殖培養(yǎng)的菌液，備用。將菌液稀釋100倍置于96孔板中，四周為NB培養(yǎng)基作為空白。置于恒溫培養(yǎng)箱中，于36℃培養(yǎng)24小時，取出。將菌液傾出，用蒸餾水反復清洗后，加入0.1%結(jié)晶紫染色30分鐘后，將結(jié)晶紫傾出，洗凈，加入1%脫氧膽酸鈉溶液，30分鐘后，測其600nm處的OD值。以菌液濃度為橫坐標，以OD值為縱坐標，考察BBF生長情況。1.2影響大腸桿菌BBF生長的因素通過實驗的反復摸索，我們發(fā)現(xiàn)影響大腸桿菌BBF生長的因素主要有以下幾種：①菌種：不同的大腸桿菌菌株對BBF的影響很大，直接影響到BBF的生長與否和BBF形成的好壞。且大腸桿菌傳代越多，BBF的生長情況越不好，故我們每次實驗均采用大腸桿菌的第二代菌株。②96孔板的材質(zhì)：不同的細菌在不同材質(zhì)的96孔板上的生長情況是不同的。我們選用了市場上常見的三種96孔板分別是進口聚氯乙烯（PVC）板，國產(chǎn)聚苯乙烯（PS）板，進口聚苯乙烯板，大腸桿菌分別在不同材質(zhì)的96孔板上培養(yǎng)。結(jié)果，大腸桿菌在國產(chǎn)PS板上的生長情況是最好的。③培養(yǎng)時間：考慮到實驗操作時間的可行性，我們選定將大腸桿菌分別培養(yǎng)18小時、24小時、36小時，考察BBF的生長情況。結(jié)果，大腸桿菌在培養(yǎng)24小時后，BBF的生長情況最好。1.3金黃色葡萄球菌BBF的建立及影響因素金黃色葡萄球菌的BBF模型的建立方法基本上與大腸桿菌的相同。在這里就不做詳細的介紹。我們?nèi)耘f分別考察了96孔板的材質(zhì)、培養(yǎng)時間及菌液濃度等因素，最終確定金黃色葡萄球菌菌液稀釋100倍、于國產(chǎn)PS板上培養(yǎng)24小時，BBF的生長的最好且穩(wěn)定。2.1培養(yǎng)方法的建立我們建立兩種方法分別考察藥物對BBF形成的影響及對BBF的抑制作用。96孔板的點樣方法1：四周為菌液（NB培養(yǎng)基）。B行加入180μl菌液（NB培養(yǎng)基），C～G行每孔各加入100μl菌液（NB培養(yǎng)基），B行每孔用移液槍加入20μl藥液，混勻，用多通道移液槍從B行吸出100μl移入C行，混勻，再從C行吸出100μl移入D行，依此類推至H行，吸出100μl后，棄去。即從B～H行藥液濃度以2倍遞減。96孔板的點樣方法2：四周為菌液。B～G行加入100μlNB培養(yǎng)基，B行每孔用移液槍加入100μl藥液，混勻，用多通道移液槍從B行吸出100μl移入C行，混勻，再從C行吸出100μl移入D行，依此類推至H行，吸出100μl后，棄去。即從B～H行藥液濃度以2倍遞減。培養(yǎng)方法一：考察對BBF形成的影響。按“96孔板點樣方法1”完成后，依照“大腸桿菌BBF模型建立的方法”中置于恒溫培養(yǎng)箱中，于36℃培養(yǎng)24小時，以藥液濃度為橫座標，以平均OD值為縱坐標，作圖，考察對BBF形成的影響。培養(yǎng)方法二：考察對BBF的抑制作用我們先將96孔板全部點菌液，依照“大腸桿菌BBF模型建立的方法”置于恒溫培養(yǎng)箱中，于36℃培養(yǎng)24小時，取出，此時BBF已經(jīng)形成，將菌液傾出，按“96孔板點樣方法”，將培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時，以藥液濃度為橫座標，以平均OD值為縱坐標，考察對BBF的抑制作用。2.2考察對BBF形成的影響圖1注射用雙黃連對大腸桿菌BBF形成的影響將注射用雙黃連加水溶解，配制成5mg/ml的藥液，分別進行對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)的操作。注射用雙黃連對大腸桿菌BBF形成的影響結(jié)果見圖1所示。3討論1）通過實驗摸索，建立了可靠而穩(wěn)定的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細菌生物膜（BBF）的模型，確定了影響因素。2）96孔板清洗方法的摸索：96孔板的材質(zhì)是BBF模型能夠成功建立的重要因素，確定96孔板的清洗方法：先在96孔板內(nèi)加注洗液，浸泡3～5分鐘后，用手握持96孔板，甩干孔內(nèi)液體；再用乙醇浸泡24小時后超聲20分鐘，自然晾干，即可。3）考察了注射用雙黃連對BBF形成的影響。得出注射用雙黃連對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌BBF的形成均有明顯的抑制作用。4結(jié)語本實驗建立了可靠而穩(wěn)定的BBF模型，并通過此模型考察了中藥注射用雙黃連對BBF形成的影響，篩選出能夠抑制或破壞BBF形成的活性成分，為從中藥中開發(fā)治療慢性感染性疾病的新藥提供新的篩選模型，為科學、客觀評價中醫(yī)藥在治療慢性感染方面的作用提供了新的方法。[1]BaverT，etal.Biofilmformationinendotrachealtubes：As-sociationbetweenpneumoniaandthepersistenceofpathogents.MonaldiArchChestDis，2002，（57）：84.[2]Dagupta