基于PCR方法的HPV檢測(cè)方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢(shì)

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基于PCR方法的HPV檢測(cè)方法介紹及其劣勢(shì)

July2011

Shanghai,China1基于PCR方法的HPV檢測(cè)方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢(shì)5/8/2024主要內(nèi)容HPV檢測(cè)面臨的挑戰(zhàn)以及為何選擇HC2用于子宮頸癌篩查基于PCR的HPV檢測(cè)方法介紹及其用于子宮頸癌篩查中的局限性（對(duì)比HC2）2基于PCR方法的HPV檢測(cè)方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢(shì)5/8/2024HPV檢測(cè)面臨的挑戰(zhàn)有超過(guò)150種的HPV型別有些型別引起癌癥13+高危型致癌HPV，單一感染或多重感染有些引起輕度病變，如疣HPV感染引起的疾病因年齡和地域不同多重感染較為普遍RT-PCR研究發(fā)現(xiàn)，在107例液基細(xì)胞學(xué)結(jié)果為各種子宮頸上皮內(nèi)瘤病變的樣本中，有52％存在多重感染(Lindhetal.,JClinVirol.40(4):321-4.(2007)

子宮頸癌癌癥發(fā)生的部位可能會(huì)比較隱匿難以發(fā)現(xiàn)、在子宮頸內(nèi)口（轉(zhuǎn)化區(qū)）由于遠(yuǎn)離子宮頸外口，因此采樣時(shí)可能很難被采到采樣部位非常重要眾多的其它微生物（交叉反應(yīng)）個(gè)人衛(wèi)生、生理周期可能會(huì)對(duì)檢測(cè)有抑制3基于PCR方法的HPV檢測(cè)方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢(shì)5/8/2024HPV檢測(cè)方法用于子宮頸癌篩查特點(diǎn)HPV檢測(cè)用于臨床子宮頸癌篩查，目的不是簡(jiǎn)單地檢測(cè)有無(wú)HPV感染的問(wèn)題，而是發(fā)現(xiàn)那些有HPV感染并且存在發(fā)展成癌前病變或癌的高風(fēng)險(xiǎn)婦女。子宮頸癌篩查強(qiáng)調(diào)的是臨床敏感度而不是分析敏感度PCR是一種很好的方法，用于分子病毒檢測(cè)，分析靈敏度很高，10個(gè)拷貝數(shù)量級(jí)的水平都能把病毒檢測(cè)出來(lái)用于子宮頸癌篩查中的HPV檢測(cè)方法要求：該檢測(cè)方法要有很好的臨床敏感度，即癌前病變或癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而不是分析敏感度4基于PCR方法的HPV檢測(cè)方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢(shì)5/8/2024為何選擇HC2技術(shù)用于子宮頸癌的篩查HC2是最佳的HPV篩查工具

檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、可靠不易被污染物所抑制不需要前期的DNA提取過(guò)程縮減勞動(dòng)成本和試驗(yàn)時(shí)間在同一反應(yīng)中檢測(cè)多種型別病毒反應(yīng)簡(jiǎn)單、易于操作與PCR不同的是，不需要專業(yè)高清潔實(shí)驗(yàn)室以避免交叉污染不會(huì)因目標(biāo)DNA的數(shù)量而對(duì)結(jié)果有影響測(cè)出5000個(gè)病毒拷貝可批量、全自動(dòng)處理(RCSplatform;NextGen)5基于PCR方法的HPV檢測(cè)方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢(shì)5/8/2024主要內(nèi)容HPV檢測(cè)面臨的挑戰(zhàn)以及為何選擇HC2用于子宮頸癌篩查基于PCR的HPV檢測(cè)方法介紹及其用于子宮頸癌篩查中的局限性（對(duì)比HC2）6基于PCR方法的HPV檢測(cè)方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢(shì)5/8/2024What’sTheBestAnalyticalSensitivityCutoff

ForClinicallyUsefulHPVDNATesting

HPV病毒含量與臨床病變的關(guān)系7基于PCR方法的HPV檢測(cè)方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢(shì)5/8/2024AdaptedfromSnijdersetal.JournalofPathology2003;201:1-6由此可見：HC2的分析閾值及判斷標(biāo)準(zhǔn)是經(jīng)過(guò)臨床驗(yàn)證的由此可見：基于PCR的HPV檢測(cè)方法檢測(cè)到許多與臨床無(wú)關(guān)的HPV感染8基于PCR方法的HPV檢測(cè)方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢(shì)5/8/2024Snijdersetal.JournalofPathology2003;201:1-6高度分析敏感度檢測(cè)出無(wú)臨床相關(guān)性的病毒水平一過(guò)性感染恢復(fù)階段：免疫反應(yīng)早期感染、可自體清除“…使用分析敏感度過(guò)高的檢測(cè)方法會(huì)降低臨床特異性”PCR關(guān)注的是分析敏感度，但真正重要的是臨床敏感度9基于PCR方法的HPV檢測(cè)方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢(shì)5/8/2024PCR分析敏感度為<10copiesHPVDNAHC2臨床敏感度是5,000copiesHPVDNAAdaptedfromSnijdersetal.JournalofPathology2003;201:1-6分析敏感度與臨床敏感度——臨床相關(guān)性10基于PCR方法的HPV檢測(cè)方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢(shì)5/8/2024基于PCR的分析檢測(cè)在宮頸癌篩查應(yīng)用的局限１分析敏感度很高－發(fā)現(xiàn)過(guò)多無(wú)臨床意義或無(wú)風(fēng)險(xiǎn)的HPV陽(yáng)性婦女對(duì)婦女造成不必要的心理負(fù)擔(dān)和壓力很多病例是一過(guò)性感染，隨后的時(shí)間通過(guò)機(jī)體免疫系統(tǒng)清除造成過(guò)度診斷和治療造成假陽(yáng)性，誤診原因檢出低病毒含量的HPV感染者擴(kuò)增了沒(méi)有致病性的基因片斷標(biāo)本間的交叉污染11基于PCR方法的HPV檢測(cè)方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢(shì)5/8/2024區(qū)別：基于PCR的分析檢測(cè)與HC2臨床檢測(cè)分析敏感度臨床敏感度樣本中能檢測(cè)出的病毒最低水平也被稱作檢測(cè)極限(LOD)

統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：檢測(cè)結(jié)果與零的區(qū)分以臨床病變?yōu)榻K點(diǎn)指征，檢測(cè)出高度病變的敏感度(CIN3+/SCC)

初篩時(shí)，能夠檢測(cè)出CIN2＋或?qū)m頸癌的比例分析閾值必須得到嚴(yán)格的驗(yàn)證12基于PCR方法的HPV檢測(cè)方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢(shì)5/8/2024區(qū)別2分析敏感度PCR方法的分析敏感度達(dá)到10個(gè)拷貝/ml臨床敏感度HC2的分析閾值經(jīng)臨床驗(yàn)證為5,000個(gè)拷貝/ml樣本中能檢測(cè)出的病毒最低水平也被稱作檢測(cè)極限(LOD)

統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：檢測(cè)結(jié)果與零的區(qū)分以臨床病變?yōu)榻K點(diǎn)指征，檢測(cè)出高度病變的敏感度(CIN3+/SCC)

初篩時(shí)，能夠檢測(cè)出CIN2＋或?qū)m頸癌的比例分析閾值必須得到嚴(yán)格的驗(yàn)證13基于PCR方法的HPV檢測(cè)方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢(shì)5/8/2024區(qū)別3分析敏感度PCR方法的分析敏感度達(dá)到10個(gè)拷貝/ml陽(yáng)性結(jié)果：可能沒(méi)有臨床相關(guān)性臨床敏感度HC2的分析閾值經(jīng)臨床驗(yàn)證為5,000個(gè)拷貝/ml經(jīng)臨床證實(shí)：高度的陰性預(yù)測(cè)值樣本中能檢測(cè)出的病毒最低水平也被稱作檢測(cè)極限(LOD)

統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：檢測(cè)結(jié)果與零的區(qū)分以臨床病變?yōu)榻K點(diǎn)指征，檢測(cè)出高度病變的敏感度(CIN3+/SCC)

初篩時(shí)，能夠檢測(cè)出CIN2＋或?qū)m頸癌的比例分析閾值必須得到嚴(yán)格的驗(yàn)證14基于PCR方法的HPV檢測(cè)方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢(shì)5/8/2024基于PCR的分析檢測(cè)在宮頸癌篩查應(yīng)用的局限２臨床靈敏度較低（比HC2)基于PCR方法的國(guó)外研究報(bào)道臨床靈敏度平均在82%（來(lái)自國(guó)外數(shù)據(jù)）所有國(guó)產(chǎn)的HPV檢測(cè)無(wú)論哪種方法均沒(méi)有公開的大規(guī)?；诤Y查人群的臨床靈敏度的數(shù)據(jù)報(bào)道，各家都是在跟HC2做符合率的對(duì)比至少漏診12%很多真正有風(fēng)險(xiǎn)的病人造成假陰性，漏診原因不同的HPV亞型擴(kuò)增效率不同L1基因段缺失低危型HPV的競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)質(zhì)控β球蛋白的競(jìng)爭(zhēng)樣品抑制（有5％的樣品因出現(xiàn)抑制而無(wú)法擴(kuò)増）15基于PCR方法的HPV檢測(cè)方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢(shì)5/8/2024“在檢測(cè)2年內(nèi)CIN3和癌癥的累積發(fā)病方面，HC2比PCR更加敏感”**Schiffmanetal,AmJClinPath2005;124:722-732Lorincz,HPVTestingbyHybridCapture.MonsonegoJ(ed):EmergingIssuesofHPVInfections:FromSciencetoPractice.Basel,Karger,2006:54-6216項(xiàng)已發(fā)表的研究數(shù)據(jù)表明，PCR的平均臨床敏感度為82%分析敏感度與臨床敏感度——–平均敏感度16基于PCR方法的HPV檢測(cè)方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢(shì)5/8/2024子宮頸癌篩查不容漏診大多數(shù)PCR檢測(cè)會(huì)因?yàn)槟繕?biāo)片段的缺失而受到影響晚期癌癥階段L1缺失

競(jìng)爭(zhēng)抑制低危型HPV的競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)質(zhì)控β球蛋白的競(jìng)爭(zhēng)樣品抑制（有5％的樣品因出現(xiàn)抑制而無(wú)法擴(kuò)増）17基于PCR方法的HPV檢測(cè)方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢(shì)5/8/2024HPV病毒基因L1片段缺失惡性進(jìn)展和與宿主細(xì)胞DNA整合時(shí)，可以造成病毒基因片段的大量缺失，在癌癥中經(jīng)常只能檢測(cè)出E6、E7P片段18基于PCR方法的HPV檢測(cè)方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢(shì)5/8/2024“由于L1開放編碼框架在整合過(guò)程中發(fā)生缺失，使用L1引物會(huì)導(dǎo)致2–3%的假陰性結(jié)果”Caponeetal,ClinCancerResearch2000,6:4171-4175“使用共同的L1引物，擴(kuò)增后結(jié)果顯示，在56份樣本中有23例的L1片段缺失”

Karlsenetal,JCM1996,34(9):2095-2100(Invasivecervicalcarcinomapopulation)“在PCR檢測(cè)系統(tǒng)中，應(yīng)該使用多種共同引物和型別特異性引物”Karlsenetal,JCM1996,34(9):2095-2100(Invasivecervicalcarcinomapopulation)子宮頸癌篩查不容漏診19基于PCR方法的HPV檢測(cè)方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢(shì)5/8/2024L1基因段缺失的影響“我們使用2種引物對(duì)10個(gè)病人進(jìn)行檢測(cè)，其中8人HPV檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在鱗狀上皮細(xì)胞癌中HPV的陽(yáng)性有差異，以L1段為引物的結(jié)果為陰性，而以特異性E6為引物的結(jié)果為陽(yáng)性。Monk等人已經(jīng)描述了這同一發(fā)現(xiàn)。我們認(rèn)為在HPVDNA整合的過(guò)程，L1基因段可能已經(jīng)缺失了?！盨aoPauloMedJ/RevPaulMed2002;120(1):20-2非典型性鱗狀上皮細(xì)胞濕疣鱗狀上皮浸潤(rùn)癌HPV18HPV18無(wú)癥狀的CIN3無(wú)癥狀的CIN3HPV16HPV16HPV16HPV18L1PCR+L1PCR+L1PCR+L1PCR-L1PCR缺失浸潤(rùn)癌20基于PCR方法的HPV檢測(cè)方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢(shì)5/8/2024子宮頸癌篩查不容漏診“L1片段的缺失并不普遍，但是任何變異或缺失都會(huì)造成PCR的檢測(cè)結(jié)果為陰性…”UngeretalJHC1998,46(4):535-540“L1片段是病毒衣殼蛋白，在HPV病毒引發(fā)的腫瘤進(jìn)展過(guò)程中是不必要的，因此很可能在HPV整合過(guò)程會(huì)導(dǎo)致L1片段的缺失”

Caponeetal,ClinCancerResearch2000,6:4171-4175“~5%的癌癥和CIN3會(huì)因?yàn)镠PVL1片段的缺失而無(wú)法被檢測(cè)出來(lái)”

Lorincz(MethodsforHPVDetection);EmergingIssuesonHPVInfections:FromSciencetoPractice,Monsonego200621基于PCR方法的HPV檢測(cè)方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢(shì)5/8/2024競(jìng)爭(zhēng)性抑制是分子診斷中的一個(gè)重要問(wèn)題“內(nèi)對(duì)照檢測(cè)結(jié)果為陰性，其病毒拷貝數(shù)較高時(shí)，提示高拷貝的病毒在擴(kuò)增時(shí)與內(nèi)對(duì)照發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制” Monitoringofinhibitorsofenzymaticamplificationinpolymerasechainreactionand evaluationofefficacyofRNAextractionforthedetectionofhepatitisCvirususing theinternalcontrol.MiyachiH,etal.ClinChemLabMed.36(8):571-5(1998)“…我們確實(shí)存在較高的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，且無(wú)法通過(guò)重復(fù)試驗(yàn)而得以糾正。實(shí)驗(yàn)樣本稀釋也會(huì)引起內(nèi)對(duì)照的擴(kuò)增，而且，一個(gè)原本衣原體陽(yáng)性的病例轉(zhuǎn)變?yōu)殛幮越Y(jié)果” HighfrequencyofcompetitiveinhibitionintheRocheCobasAMPLICORmultiplex PCRforChlamydiatrachomatisandNeisseriagonorrhoeae,.

HamiltonMS,etal.J ClinMicrobiol.40(11):4393(2002)

“靶序列的多變性和多重感染時(shí)使用共同引物檢測(cè)引起的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，會(huì)降低檢測(cè)方法的敏感性” Impactofcompetitiveinhibitionandsequencevariationuponthesensitivityof malariaPCR,BialasiewiczS,etal.JClinMicrobiol.45(5):1621-3(2007)

22基于PCR方法的HPV檢測(cè)方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢(shì)5/8/2024競(jìng)爭(zhēng)性抑制在每個(gè)反應(yīng)中，兩種型別為了有限的擴(kuò)增引物等發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)

1xType16DNA100XType11DNA即使16型HPVDNA存在，也無(wú)法被檢測(cè)出來(lái)+100xType11Type1623基于PCR方法的HPV檢測(cè)方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢(shì)5/8/2024HC2技術(shù)不存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制被檢測(cè)的病毒與充足的RNA探針雜交雜交體被足量的抗體捕獲和檢測(cè)DNARNAType11Type1624基于PCR方法的HPV檢測(cè)方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢(shì)5/8/2024β-globinβ-globinβ-globinβ-globinβ-globinβ-globinβ-globinHPVHPVHPVHPVHPVHPVHPVβ-globinHPVHPVβ-globin競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)的結(jié)局是造成假陰性結(jié)果““β-蛋白和HPV都是通過(guò)L1共同引物進(jìn)行聯(lián)合擴(kuò)增，這會(huì)降低HPV檢測(cè)的敏感性”Coutleeetal.JCM2002;40(3):902-907“在17例樣本中有15例，在進(jìn)行聯(lián)合擴(kuò)增時(shí)至少有1種HPV型別無(wú)法檢測(cè)到…因此應(yīng)該在PCR的檢測(cè)中避免HPV和β-蛋白發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制”Coutleeetal.JCM2002;40(3):902-907PCR反應(yīng)體系中的β-蛋白競(jìng)爭(zhēng)25基于PCR方法的HPV檢測(cè)方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢(shì)5/8/2024基于PCR的分析檢測(cè)在宮頸癌篩查應(yīng)用的局限３很難標(biāo)準(zhǔn)化和統(tǒng)一化，不同的方法結(jié)果不同，結(jié)果很難進(jìn)行比較由于引物、反應(yīng)體系很難等條件很難統(tǒng)一，結(jié)果重復(fù)性差，結(jié)果很難向病人解釋需要標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)室，和專業(yè)的技術(shù)人員，不易于普及26基于PCR方法的HPV檢測(cè)方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢(shì)5/8/2024實(shí)驗(yàn)室內(nèi)/間的可重復(fù)性缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)PCR引物的選擇聚合酶樣本純化擴(kuò)增反應(yīng)周期底物實(shí)驗(yàn)室操作人員27基于PCR方法的HPV檢測(cè)方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢(shì)5/8/2024“…7個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室使用HC2檢測(cè)試劑…數(shù)據(jù)顯示了高度的可重復(fù)性.”

Carozzietal,AmJClinPathol2005;124(5):716-721“HC2

HPVDNA檢測(cè)沒(méi)有出現(xiàn)因污染而造成的假陽(yáng)性結(jié)果，并且多個(gè)實(shí)驗(yàn)室之間的可重復(fù)性高達(dá)98%.”

Bozzettietal,AnnEpid2000;10(7):466“重要的是注意到HC2顯示出實(shí)驗(yàn)室之間高度的一致性...”

Castleetal,AmJClinPath2004;122:238-245“PCR的可重復(fù)性：重復(fù)分析達(dá)到96%的一致性，分析同一天配對(duì)樣本（89%的一致性），實(shí)驗(yàn)室之間的一致性88%.”Kuypersetal,JCM1993;31(4):1003-1006HC2PCR“用于HPVDNA檢測(cè)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的重復(fù)性為86%到98%。排除HPV檢測(cè)的陰性結(jié)果，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的一致性從78%到96%”Kornegayetal,JCM2003;41(3):1080-1086

“…診斷的重復(fù)性…總體為90.7%（任何HPV型別），特異性型別的HPV診斷重復(fù)性為76.9%.”Danieletal,JCV2000;19:187-193

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)、實(shí)驗(yàn)室間的可重復(fù)性28基于PCR方法的HPV檢測(cè)方法和在宮頸癌應(yīng)用