芽孢桿菌分離篩選與培養(yǎng)

1芽孢桿菌分離篩選與培養(yǎng)枯草芽飽桿菌是芽飽桿菌屬的模式種，很少成鏈，通常為0.7~0.8μm×2.0~3.0μm,營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞桿狀，桿端鈍圓，單生或成短鏈，能運(yùn)動(dòng)，革蘭氏染色一致呈陽(yáng)性,芽孢中生或偏生，芽孢呈橢圓或長(zhǎng)簡(jiǎn)形。無(wú)莢膜，周生或側(cè)生鞭毛，游離孢子表面著色弱，菌落形態(tài)變化較大，粗糙，表面干燥不透明，灰白色或微帶黃色，擴(kuò)散(蔓延)生長(zhǎng)。斜面豐厚粗糙，不透明，蠟質(zhì)蔓延，奶油色至微褐色。在液體培養(yǎng)基表面形成銀白色較厚的具皺紋的菌膜?？衫玫鞍踪|(zhì)、多種糖及淀粉，廣泛分布在土壤、水體及腐敗的有機(jī)物中,易在枯草浸汁中繁殖。瓊脂培養(yǎng)基上的菌落圓或不規(guī)則形，表面色暗，變厚和不透明，可起皺，可呈奶油色或褐色,菌落的形狀隨培養(yǎng)基成分不同而有很大變化。當(dāng)瓊脂培養(yǎng)基表面潮濕時(shí)，菌落易于擴(kuò)散。在瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌苔在液體中不易擴(kuò)散。在培養(yǎng)液中生成色暗、皺褶、完整的膜，培養(yǎng)液輕度混濁或不混濁。有氧時(shí)生長(zhǎng)旺盛，在含有葡萄糖的復(fù)雜培養(yǎng)基中可進(jìn)行厭氧代謝，但其生長(zhǎng)和發(fā)育都較弱,生長(zhǎng)溫度最高為45~55℃,最適為37℃?？莶菅挎邨U菌生理生化特性：液化明膠凍化牛乳還原硝酸鹽不產(chǎn)生吲化氫V-P反應(yīng)陽(yáng)性，水解淀粉。葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，需氧。地衣芽孢桿菌孢囊不膨大，無(wú)伴孢晶體，中生卵圓型芽孢，周?chē)廾?，無(wú)莢膜。革蘭氏液染色呈紫色陽(yáng)性菌。細(xì)胞大小一般在0.9~1.2×2.2~3.8微米。菌落呈灰白色、邊緣不整齊的扁平菌落。1.樣品：外購(gòu)菌種商品微生物制劑(固體或液體)土壤水體或枯枝爛葉，腐爛稻草(記錄取樣位置PH植被情況等)。2.菌種分離與純化2.1.培養(yǎng)基2.1.1可溶性淀粉3g/L蛋白胨10g/L酵母膏3g/LKH2PO41.5g/L2MgSO40.1g/LPH7.4—7.6(富集用)2.1.2肉湯(NA)培養(yǎng)基(營(yíng)養(yǎng)瓊脂):蛋白胨10g/L牛肉膏3-5g/LNaC15g/LPH7.2—7.4(保存計(jì)數(shù)或分離純化用)營(yíng)養(yǎng)瓊脂：麥芽汁培養(yǎng)基=1:1混合使用,菌落不易擴(kuò)散，形態(tài)特征典型2.1.3蛋白胨10g/L酵母膏5g/L葡萄糖3.5g/LNaC15g/LK2HPO40.5g/LMgS043g/LMnS0425mg/LPH7.2—7.4(分離純化2.1.4產(chǎn)淀粉酶菌株篩選培養(yǎng)基：可溶性淀粉3-5g/L蛋白胨10g/L牛肉膏3-5g/LNaCl5g/LPH7.2—7.4(用于淀粉酶產(chǎn)生菌分離篩選)2.1.5產(chǎn)蛋白酶菌株篩選培養(yǎng)基2.1.5.1酪素培養(yǎng)基：★★2.1.5.1.1葡萄糖1g/L,酵母膏1g/L,酪素4-5g/L,K2HPO41g/L,KH2PO40.5g/L,MgSO40.1g/L蒸餾水1000ml,pH7.0-7.2。另：葡萄糖0.5g/L,酪素10g/L,NaC15g/LK2HPO40.5g/L,KH2PO40.5g/L,瓊脂20g/LpH7.2-7.42.1.5.1.2牛肉膏3g/L或酵母浸粉5g/L酪素10g/LNaCl4-5g/LPH7.2—7.4先將酪素用少量2%氫氧化鈉潤(rùn)濕，玻棒攪動(dòng)，再加適量的蒸餾水，在沸水浴中加熱攪拌至完全溶解(10-15min),補(bǔ)足1000mL蒸餾水，加入其他成分，調(diào)PH分裝滅菌。2.1.5.1.3酵母膏0.05g/L酪素4g/LKH2PO40.36g/LNa2HPO?1.1g/LMgSO40.5g/LNaC10.16g/LFeS040.002g/LCaC120.002g/LZnC120.014g/LpH6.5-7.04%酪素母液制備：4g酪素溶解于0.1N的30-35mL的氫氧化鈉溶液中，水浴溶解20min,溶解完畢后加入60-70℃熱水定溶到100mL.200mL培養(yǎng)基加20mL,★★2.1.5.2脫脂奶培養(yǎng)基：牛肉膏3g/L(酵母浸粉5g/L)蛋白胨10g/LNaC15g/L脫脂奶粉10-12g/L,PH7.2(用于蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選)將脫脂奶(粉)加水溶解制成10%溶液，于115℃加熱滅菌20-30min,與牛膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1:9混合均勻倒平板。2.1.6纖維素產(chǎn)生菌培養(yǎng)基:CMC-Na2g/L蛋白胨10g/L酵母膏5g/LNaC15g/LPH7.2-7.4(用于纖維素產(chǎn)生菌的篩2.1.7促芽胞形成培養(yǎng)基：土壤浸出液1000mL蛋白胨5g/L牛肉膏6g/LPH7.2—7.4蛋白胨1g/L酵母膏0.7g/L葡萄糖1g/L(NH)?soo.2g/LMgSO40.2g/L3,產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L產(chǎn)芽孢培養(yǎng)酵母膏0.1g/L2.1.8產(chǎn)蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉30g/L豆餅粉20g/L鉀0.3g/LPH7.2—7.4(分離純化用)牛肉膏3-5g/LNaC15g/L.玉米粉0.5g/L麩皮10g/L磷酸二氫鈉4g磷酸二氫碳酸鈉1.0g/LPH7.4—7.6八層紗布塞，牛皮紙?jiān)谩?.1.9產(chǎn)淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉40g/L豆餅粉20g/L蛋白胨5g/L硫酸銨4g/L磷酸二氫鈉酸二氫鉀3g/LPH7.4—7.6八層紗布塞，牛皮紙?jiān)谩．a(chǎn)酶培養(yǎng)基(蛋白淀粉酶):蛋白胨10g/L酵母膏5g/L葡萄糖1g/L可溶性淀粉5g/L磷酸二氫鉀2g/LMgS040.5g/LCaC120.2g/LPH7.0-7.42.2分離純化(或復(fù)壯)2.2.1凍干管的活化及菌種復(fù)壯:活化：用無(wú)菌吸管吸取0.5mL無(wú)菌水滴入安管中，輕蕩使干菌體溶解成菌懸液，做梯度稀釋后取0.1-0.2mL涂布或直接劃線(xiàn)于肉湯(麥芽汁)培養(yǎng)基平皿，或轉(zhuǎn)接于斜面(活化)37℃24-36h。復(fù)壯：挑取選擇生長(zhǎng)快，菌落大的菌落于4.5mL無(wú)菌水試管中，振蕩搖勻后置于80℃水浴加熱15-20min,梯度稀釋后涂布于促芽胞形成培養(yǎng)基平皿或蘸取菌懸液直接劃線(xiàn)，37℃24h。反復(fù)二至三次，選取平皿上菌落大而且生長(zhǎng)快的菌落轉(zhuǎn)接于斜面37℃18-20h,4℃冰箱保存。2.2.2商品微生物制劑中菌種選育1g(1mL)商品制劑加入99mL無(wú)菌(生理鹽)水/250mL三角瓶(帶玻璃珠),置于搖床振蕩20-30min,80-85℃水浴加熱15-20min,進(jìn)行梯度稀釋成10?、10?、10?,根據(jù)活菌含量選取兩至三個(gè)梯度進(jìn)行混菌或涂布35℃-37℃24h,挑取一環(huán)生長(zhǎng)快，菌落大的不同典型菌落分別轉(zhuǎn)接5mL無(wú)菌水試管中，混合器混合5-10min,做成菌懸液菌懸液直接劃線(xiàn)，37℃18-20h。結(jié)合鏡檢直梯度稀釋后混菌或涂布,或直接蘸取到菌落大小基本一致，轉(zhuǎn)接于斜面37℃于4℃冰箱保存?；?qū)⑻荻染嘏囵B(yǎng)基液1mL加入平板，然后分別注入淀粉和酪4中，30-37℃24-48h,挑取D/d大的(淀粉培養(yǎng)基加碘液，觀察透明圈)轉(zhuǎn)斜面?zhèn)溆没蛴脛澗€(xiàn)法進(jìn)行純化。并通過(guò)染色鏡檢觀察，從菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)進(jìn)2.2.3自然篩選2.2.3.1富集培養(yǎng)取5g底泥或腸道內(nèi)溶物0.5g,加入45(50)mL無(wú)菌水/250mL三角瓶(帶玻珠)中，振蕩15-20min,取5mL菌懸液或5mL水樣加入45mL促芽培養(yǎng)基/250mL三角瓶中，75℃-80℃水浴15-20min,降至35℃-37℃150-200r/min振蕩24h,染色鏡檢，連續(xù)兩至三次培養(yǎng)備用?；蛉?g底泥(土)置于20mL肉湯培養(yǎng)基/250mL三角瓶，八層紗布封口，75℃-80℃水浴處理15-20min,然后150-200r/min振蕩24h。鏡檢形成芽孢情況，挑取具有芽孢的菌落進(jìn)行劃線(xiàn)純化培養(yǎng)，獲得單菌落。2.2.3.2分離純化取富集菌液置于75℃-80℃水浴15-20min,梯度稀釋103、10?、10?、10?、107,選擇三個(gè)合適的梯度混菌或涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂麥芽汁培養(yǎng)基或直接涂布于酪素培養(yǎng)基上初篩，也可劃線(xiàn)分離(劃線(xiàn)法先將平板置于30℃(24-48h)或37℃(18-24h),無(wú)菌檢查，表面冷凝水干燥)。每個(gè)梯度二個(gè)平皿，將平板倒置，于35℃-37℃24-48h。對(duì)長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行編號(hào)，選擇生長(zhǎng)快、菌落大，表面干燥，粗糙，不透明的菌落轉(zhuǎn)接于斜面?zhèn)?。挑取少許菌苔涂片，做芽胞染色判斷是否為芽孢桿菌。2.2.3.3菌種篩選蛋白酶產(chǎn)生菌株篩選：操作程序：樣品溶解稀釋—熱處理(75-80℃)--梯度稀釋—平板涂布培養(yǎng)一單菌落編號(hào)(轉(zhuǎn)接斜面)--鏡檢(涂片芽孢染色)--初篩(點(diǎn)接酪素平板)—復(fù)篩(接產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)，離心取清液蛋白酶活力測(cè)定)--轉(zhuǎn)接斜面保藏。一般選擇菌株表面干燥粗糙不透明，作為目標(biāo)菌。以判定為芽胞桿菌的菌落處，分別挑取少許菌苔做成菌懸液，劃線(xiàn)于或適當(dāng)稀釋涂布于酪素平板，35℃-37℃24-48h,菌落周?chē)霈F(xiàn)透明圈，挑取C/H大菌，轉(zhuǎn)接于斜面或進(jìn)行復(fù)篩。產(chǎn)蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基35℃-37℃振蕩培養(yǎng)24-48h,發(fā)酵過(guò)濾或離心，取清液檢測(cè)蛋白酶活力進(jìn)自然界中分離的微生物各菌株間產(chǎn)蛋白酶的活力有很大差異，有的活力大于4000U/ml。C/H大菌落，其蛋白酶不一定大，因此，對(duì)初篩C/H大菌落進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，取發(fā)酵液進(jìn)行酶活測(cè)定進(jìn)行復(fù)篩。淀粉酶產(chǎn)生菌株篩選：樣品溶解稀釋—熱處理(75-80℃)--梯度稀釋—平板涂布培養(yǎng)一單菌落編號(hào)(轉(zhuǎn)接斜面)--鏡檢(涂片芽孢染色)--初篩(點(diǎn)接淀粉平板-滴加碘液)—復(fù)篩(接產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)，離心取清液淀粉酶活力測(cè)定)--轉(zhuǎn)接斜面保藏。一般選擇菌株表面干燥粗糙不透明，作為目標(biāo)菌。以判定為芽胞桿菌的菌落處，分別挑取少許菌苔做成菌懸液，劃線(xiàn)于或適當(dāng)稀釋涂布于淀粉平板，35℃-37℃24-48h,取0.02mol/1碘液或盧戈氏碘液滴加在淀粉平板中菌落周?chē)?，觀察形成透明圈的結(jié)果，5挑取C/H大菌，轉(zhuǎn)接于斜面或進(jìn)行復(fù)篩。接入產(chǎn)淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基35℃-37℃振蕩培養(yǎng)48h,發(fā)酵過(guò)濾或離心，取清液檢測(cè)淀粉酶和糖化酶活力進(jìn)行復(fù)篩。菌種鑒定：染色顯微鏡觀察，從細(xì)胞形態(tài)及菌落特征進(jìn)行鑒別。菌落扁平，圓形或近圓形，表面粗糙，乳白色。鏡檢菌體桿狀，單個(gè)或鏈狀,革蘭氏染色陽(yáng)性，芽孢圓形或柱型，中生或近中生。菌株的糖醇利用，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，生長(zhǎng)溫度，酸堿度PH,耐鹽試驗(yàn)(7%),溶菌酶抗性，V-P試驗(yàn)，M-R試驗(yàn)，接觸酶反應(yīng)，吲哚反應(yīng)，明膠液化，淀粉水解，硝酸鹽還原，對(duì)氧需求(厭氧生長(zhǎng)),檸檬酸鹽利用，酪素水解，尿素利用等。常見(jiàn)的稀釋方法：培養(yǎng)皿稀釋法：5-6個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿，分別滴一滴無(wú)菌水或生理鹽水，接種環(huán)蘸取菌懸液與第一培養(yǎng)皿無(wú)菌水混合，在與第二培養(yǎng)皿無(wú)菌水混合，依次第三四五六，在各培養(yǎng)皿注入45-50℃培養(yǎng)基12-15mL混勻，倒置培養(yǎng)，在四五六得到單菌落。平板稀釋法：取平板4-5個(gè)(干燥無(wú)冷凝水),在第一平板滴一小滴稀釋菌懸液，無(wú)菌涂棒涂布，然后用此涂棒在另一平倒置培養(yǎng)，在四五六得到單菌落。試管稀釋法(常用法)早芽孢桿菌一般生理生化試驗(yàn)項(xiàng)目：試驗(yàn)項(xiàng)目12標(biāo)準(zhǔn)菌(枯草芽孢桿菌)革蘭氏染色十十糖發(fā)酵試驗(yàn)氧需求(厭氧生長(zhǎng))++十葡萄糖十)果糖十十+酪蛋白水解果糖十十+淀粉水解十十十蔗糖+板涂布至4-5。++(產(chǎn)酸不產(chǎn)氣十+(產(chǎn)酸不產(chǎn)氣)明膠水解硝酸鹽還原檸檬酸鹽或動(dòng)力試驗(yàn)石蕊牛奶還V-P試驗(yàn)M-R試驗(yàn)PH5.7接觸酶尿素利用3.種子培養(yǎng)3.1.培養(yǎng)基十十十麥芽糖十十十丙酸鹽試驗(yàn)十十+木糖十十十十十十甘露醇或山梨醇+十十ITR十十滲透壓試驗(yàn)7%氯化鈉+十十十十十10%氯化鈉+十十3.1.1蛋白胨10g/L酵母膏5g/LNaCl0.5g/L葡萄糖2g/LK2HPO43.1.2蛋白胨10g/L酵母膏5g/L葡萄糖30g/LK2HPO44.5g/L(NH)?SO?2.5g/LCaCO32g/LPH7.07.23.1.3蛋白胨5g/L酵母膏1g/L牛肉膏3g/L葡萄糖5g/LMgSO460.5g/L3.1.4淀粉10-30g/L酵母膏5-10g/L蛋白胨10g/L牛肉膏5g/L3.2.種子培養(yǎng)3.2.1液體培養(yǎng)3×50mL/250mL三角瓶35℃-37℃18-20h芽孢率90%以上7×350mL/1000mL三角瓶接種量5%(火焰下接入) 接種量5%200r/min種子罐0.6T/T 1-2h靜止培養(yǎng)3h后連續(xù)攪拌至終止3.2.2固體培養(yǎng)①培養(yǎng)基a.麩皮75%花生麩15%玉米粉5%豆粕5%b.麩皮80%稻殼10%玉米粉5%豆粕5%MgS040.05%MnS040.01%c.麩皮80-90%細(xì)糠5-15%葡萄糖2-5%②固體培養(yǎng)膨潤(rùn)土1-5%K2HPO41-3%d生物PH7.0-7.2(專(zhuān)利)30g/500mL三角瓶37℃(30℃)斜面活化30-50mL/500mL三角瓶1-2環(huán)菌苔或菌懸液料水比1:1.2-1.3接種量2%-3%(V/M)M為水料和,靜止培養(yǎng)。拍打三次發(fā)酵周期40-48h →簾子曲堆積1-2h上簾重視劃簾料層厚度2-3cm接種量0.3-0.5%控制品溫37℃(30℃)38-40h4.發(fā)酵床(罐)培養(yǎng)4.1.1固體培養(yǎng)基(同種子)4.1.2液體發(fā)酵培養(yǎng)基A.玉米淀粉3g/L豆餅粉6g/L蛋白胨3.5g/L尿素3g/L葡萄糖5g/LB.玉米淀粉8g/L豆餅粉25g/L葡萄糖10g/LMgSO45g/LMnSO4NaH2P0?0.5g/LNa2HP0?2.3g/LPH7.2-7.4C.玉米粉10g/L玉米漿1.5g/L豆餅粉20g/L尿素1g/LK2HPO43g/LKH2PO41.5g/LMgSO41g/LMnS040.2g/LPH7.2-7.4消泡劑(植7物油)D.糖蜜20%味精廢液2-3%玉米漿1.0%KH2PO42g/LPH7.2-7.44.2.固體發(fā)酵床培養(yǎng)4.2.1發(fā)酵床結(jié)構(gòu)：長(zhǎng)度：5.5-8.0m寬度：1.5-2.5m高度：0.5-0.6m4.2.2生產(chǎn)操作10生產(chǎn)條件：料水比：1:1.2-1.3PH7.O-7.2接種量：簾子曲0.3-0.5%液體種子3-5%(V/M)發(fā)酵溫度：35℃±1℃(不超過(guò)37℃)a.料菌均勻后堆積1-2h上床攤平，厚度30-35cmb.溫度控制：6-8h間斷通風(fēng)控制品溫37℃以下10-12h以后連續(xù)通風(fēng)20h左右第一次翻曲，溫度37℃以下28h視品溫.結(jié)塊情況二次翻曲，溫度保持在35℃-37℃c.定時(shí)鏡檢：芽孢達(dá)到80%以上停止發(fā)酵革蘭染色顯微鏡觀察。山東寶來(lái)利來(lái)：當(dāng)料溫降至40-50℃接種，接種量10%(液體),均勻后進(jìn)行發(fā)酵，整個(gè)發(fā)酵分二個(gè)階段：第一階段(1-22h):1-10h靜止期，10h后間斷通風(fēng)控制溫度在37℃,20h左右第一次翻曲。第二階段(23-40h):28-30h第二次翻曲，控制溫度在37℃,直至發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵期間定時(shí)鏡檢，當(dāng)芽孢率達(dá)到80%以上停止發(fā)酵，60℃低溫烘干。4.3.發(fā)酵罐培養(yǎng)4.3.1發(fā)酵條件:接種量：5-10%PH:7.0-7.2裝料量：60-70%溫度：30℃-35℃種齡：18-20h(發(fā)酵周期22-24h)定時(shí)攪拌：1-8h間隔2h攪拌一次每次10-15min9-16h連續(xù)攪拌(通無(wú)菌空氣)17-22h間隔2h攪拌一次每次10min4.3.2發(fā)酵過(guò)程檢測(cè)：達(dá)到如下指標(biāo)放罐：芽孢含量：≥70%雜菌污染：≤3%含菌量：>30億cfu/mL4.3.3發(fā)酵菌液處理：a.菌液分離：離心、噴射、板框過(guò)濾，以離心分離為好。植物性：麩皮、淀粉、黃粉。礦物性：沸石粉、麥飯石、草炭、輕質(zhì)碳酸鈣。光合細(xì)菌：載體=1:4,酵母菌：載體=1:3-4,芽孢桿菌：載體=1:5-6.85.芽孢桿菌保存：枯草芽孢桿菌地衣芽孢桿菌納豆芽孢桿菌芽孢桿菌等。培養(yǎng)基：肉膏蛋白胨(保存培養(yǎng)基短小芽孢桿菌短短要求有機(jī)氮多，稍含或不含糖)短期保存：5.1.斜面保存法：枯草桿菌斜面透明粘稠,似流體。地衣芽孢斜面結(jié)合較緊密，不易挑起。4-6℃3-6月轉(zhuǎn)接一次。液體石蠟保存法：斜面和高層半固體柱4-6℃1-2年轉(zhuǎn)接一次。不適合腸細(xì)菌屬葡萄球菌乳桿菌屬。適合實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存。5.2.甘油保存法：-20℃或-70℃冰箱保存，2-3年轉(zhuǎn)接一次。5.3.凍干保存法：4-6℃保存10-15年。5.4.沙土管保存法：4-6℃保存10-15年?！铩?.吸附劑對(duì)微生物生存活性影響1.1載體：草炭有機(jī)質(zhì)含量49%,PH:6.5顆粒60目麩皮小麥麩皮，顆粒60目.輕質(zhì)碳酸鈣水分6%顆粒100目沸石粉含有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)水分10%顆粒80目1.2菌種：蠟祥芽孢桿菌酵母菌各1500mL培養(yǎng)24h,菌數(shù)10億1.3試驗(yàn)結(jié)果a.吸附劑對(duì)蠟祥芽孢桿菌的影響吸附存放7天和15天時(shí)，各處理間有效菌數(shù)變化不明顯，30天草炭和輕質(zhì)碳酸鈣相差1億。90天草炭、麩皮、輕質(zhì)碳酸鈣和沸石粉存活率76%67%44%57%,說(shuō)明草炭對(duì)蠟祥芽孢桿菌的影響較小，輕質(zhì)碳酸鈣90天就有50%微生物死亡。b.吸附劑對(duì)酵母菌的影響吸附存放7天輕質(zhì)碳酸鈣菌數(shù)死亡率66%,30天草炭、麩皮、輕質(zhì)碳酸鈣和沸石粉存活率20%62%5%29%說(shuō)明麩皮對(duì)酵母菌的影響較小。c.不同固液比對(duì)蠟祥芽孢1:2菌數(shù)上升,30天降到桿菌酵母菌有效活菌數(shù)的影響蠟祥芽孢桿菌處理七天，出現(xiàn)不同的菌數(shù)初始基礎(chǔ)菌以下，60天存活率46%.1:41:天存活率68%66%65%。酵母菌處理七天1:2菌數(shù)上升，60天降到初始基礎(chǔ)菌以下，1:41:61:860天存活率62%67%58%,從水分角度考慮固液比應(yīng)控制在1:4以上。9★★2.包包曲中五株枯草芽孢桿菌的分離與初步鑒定營(yíng)養(yǎng)瓊脂：蛋白胨10g/L牛肉膏3g/L氯化鈉5g/LPH7.0-7.2產(chǎn)蛋白酶篩選培養(yǎng)基：脫脂奶粉12g/L營(yíng)養(yǎng)瓊脂20g/LPH7.2產(chǎn)淀粉酶篩選培養(yǎng)基：可溶性淀粉5g/L氯化鈉5g/LPH7.2產(chǎn)纖維素酶篩選培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉2g/L蛋白胨10g/L酵母膏5g/L氯化鈉10g/L,PH7.2無(wú)菌條件下,取包包曲1.0g加入盛有99ml無(wú)菌水三角瓶中，先靜置10-15min,然后置搖床振蕩20-30min,取10ml菌懸液于無(wú)菌試管中，80℃保持15-20min,殺死非芽孢菌體，取1.0ml處理液梯度稀釋至10-6,涂布或混菌,37℃培養(yǎng)24h,挑單菌落革蘭氏染色，芽孢染色，鏡檢觀察。選取有芽孢的陽(yáng)性菌，傳代2-3次達(dá)到穩(wěn)定，轉(zhuǎn)接于斜面保存。菌株分離純菌株12345化結(jié)果：菌落形態(tài)乳白，邊緣不規(guī)則表面粗糙，無(wú)隆起其他同上隆起亮紅色其他同1淺褐色，邊緣整齊表面光滑淺褐色，邊緣不規(guī)則表面光滑較干燥，仍粘壁革蘭氏染色十十十十十芽孢情況近中生中生中生端生近中生3.菌種的篩選:3.1菌株產(chǎn)蛋白酶活力比較和篩選：挑選單菌落點(diǎn)接于牛奶或酪素培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)2-3d,用產(chǎn)生透明圈表示酶活力。透明圈大小(mm):15.210.59.814.213.5透明圈大小排序：145233.2菌株產(chǎn)淀粉酶活力比較和篩選點(diǎn)種37℃培養(yǎng)2-3d,滴加碘液顯透明圈大小排序：123453.3菌株產(chǎn)纖維素酶活力比較和篩選點(diǎn)種37℃培養(yǎng)2-5d,滴加剛果紅顯色，再用1mol/1氫氧化鈉脫色。透明圈大小1(mm):7.9透明圈大小排序：51243由上所知：145三株具有分解酪素淀粉纖維素能力，3只能分解酪素和淀粉,部分菌株具有較高單一消化酶活力。4目標(biāo)菌株的鑒定：4.1形態(tài)鑒定：將菌株1接種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)24h觀察。菌落形態(tài)：菌落近似圓形，表面光滑，不干燥，粘壁，菌落中間顏色較邊緣深,邊緣不規(guī)則,乳白色表面色暗，不透明。菌體形態(tài)：革蘭氏陽(yáng)性,短桿狀，以成對(duì)或鏈狀排列，運(yùn)動(dòng)，芽孢近中生,接近枯草芽孢桿菌。4.2生理生化特征：目的菌株與枯草芽孢桿菌生理生化比較：枯草芽孢桿菌十2枯草芽孢桿菌十2微生長(zhǎng)- 十++厭氧生長(zhǎng)： 十++5.9-8.06.5-8.03.8-7.35.0-7.55.0-8.05.9-8.06.5-8.03.8-7.35.0-7.55.0-8.0:+:+b十十 十十十十b十b最高生長(zhǎng)溫度：最低生長(zhǎng)溫度：PH5.7營(yíng)養(yǎng)肉湯PH6.8營(yíng)養(yǎng)肉湯10%葡萄糖：十十十十十十十十十十十十十十十十十十十十十十+阿拉伯糖木糖+十+十十+十+十十十十十+十十十淀粉明膠酪素酪氨酸還原硝酸鹽利用檸檬酸形成吲哚利用丙酸鹽十十十十十十十十十十十十從生理生化性能與枯草芽孢桿菌相似，初步判定五株菌株都為枯草芽孢桿菌?！铩?.商品納豆產(chǎn)品中高產(chǎn)蛋白酶納豆芽孢桿菌的分離篩1.材料與方法:1.1分離材料：超市購(gòu)買(mǎi)的北京大連日本三產(chǎn)地的納豆產(chǎn)品。1.2模式菌株：N1型納豆芽孢桿菌，中國(guó)農(nóng)科院提供。1.3培養(yǎng)基；營(yíng)養(yǎng)瓊脂：酵母粉5g/L大豆蛋白胨10g/LNaCl5g/LPH7.0-7.2.酪素蛋白平板：酵母粉5g/L酪蛋白10g/LNaCl5g/LPH7.0-7.2.種子培養(yǎng)基：蔗糖10g/L大豆蛋白胨10g/L氯化鈉5g/LPH:7.0-7.2發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10g/L蔗糖10g/L大豆蛋白胨20g/LK2HPO44.0g/LKH2PO42g/LMnS040.5g/LCaC120.2g/LPH7.0-7.2.1.4樣品液的制備：無(wú)菌條件下，分別稱(chēng)取三種產(chǎn)品各1.0g加入99mL/150m三角瓶無(wú)菌水中，置于搖床振蕩20-30min,吸取上清菌液4℃保存使用。1.5菌株分離和初篩：三種樣品液在80℃水浴15-20min以殺滅營(yíng)養(yǎng)菌體和雜菌，待溫度降至40℃以下進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)∵m當(dāng)?shù)南♂尪?10?、10?、10-°·)0.1mL涂布于酪素蛋白平板上，37℃倒置培養(yǎng)24h,計(jì)數(shù)(用營(yíng)養(yǎng)瓊脂)或各選擇10株透明圈直徑和菌落直徑菌落大小排列，從中各選取三株，按照進(jìn)行連續(xù)劃線(xiàn)培養(yǎng)至純(結(jié)合鏡檢)。將純化菌株轉(zhuǎn)接于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面保存?zhèn)溆谩＝Y(jié)果：芽孢桿菌計(jì)數(shù)分別北京10?大連109日本1081.6菌株鑒定:1.6.1菌落形態(tài)鑒定：營(yíng)養(yǎng)瓊脂培(粘性)顏色(白色)邊緣(不整齊)N1型納豆芽孢桿菌比較。養(yǎng)24h菌落形態(tài)(圓形)大小干濕表面(干燥起皺)(不)透明，初篩的9株燥邊緣不整齊中間顏色深菌落形態(tài)相同，與N1型納豆芽孢桿菌成裂葉狀表面皺褶不透明有粘性白色于邊緣部分，斜面菌落呈樹(shù)狀。一致，均為圓形干或灰白色菌落，1.6.2菌體形態(tài)鑒定：培養(yǎng)16h菌體進(jìn)行染色，革蘭染色情況形態(tài)大小排列方式與N1型納豆芽孢桿菌比較。菌體形態(tài)與N1型相似，染色為蘭紫色，短桿狀，兩端鈍圓，大小2.0-4.5微米。芽孢橢圓形,中生或次中生。歸屬于芽孢桿菌屬。由于培養(yǎng)16h時(shí)菌體處于穩(wěn)定生長(zhǎng)期鏡檢部分菌體呈鏈狀排列。1.6.3生理生化特征：需氧性V-P試驗(yàn)過(guò)氧化氫酶反應(yīng)淀粉水解反應(yīng)明膠水解反應(yīng)酪素水解反應(yīng)糖發(fā)酵試驗(yàn)和耐鹽性試豆芽孢桿菌比較。九株芽孢菌生理生化與N1型比較十十十十十十十十(產(chǎn)酸不產(chǎn)氣)甘露糖甘露糖7%氯化鈉：十十十7%氯化鈉：10%氯化鈉：9十+十十十十硝酸鹽還原十十十十十十十十十1.7菌株復(fù)篩:1.7.1粗酶液制備：初篩菌株接種于種子培養(yǎng)基，37℃180r/min16h,得種子懸液,以2%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)24h將菌液10000r.min離心10min除去菌體，收集上清液-80℃保存?zhèn)溆谩?.7.2蛋白酶活力的測(cè)定：按國(guó)標(biāo)執(zhí)行1.7.3傳代穩(wěn)定性測(cè)定：將復(fù)篩的納豆芽孢桿菌接種到斜面,24h傳一代，連傳十代，測(cè)定不同代數(shù)菌株48小時(shí)發(fā)酵液中蛋白酶的活4.芽孢桿菌屬菌株篩選及相關(guān)研究(南海所)4.1培養(yǎng)基：對(duì)蝦飼料2g/L(研成末)4.2實(shí)驗(yàn)菌株：養(yǎng)殖池塘中分離150株菌株，淡水魚(yú)塘分離到50株4.3菌株篩選4.3.1初篩：斜面使用前活化，分別劃線(xiàn)于平板，28-30℃培養(yǎng)48h,大部分菌株不長(zhǎng)或生長(zhǎng)緩慢，其中56株生長(zhǎng)旺盛，作為二篩菌株。4.3.2二篩：接種于液體培養(yǎng)基上，28-30℃培養(yǎng)48h,80℃水浴5min,檢測(cè)觀察大部分菌株死亡，有10株存活。4.3.3三篩：將10株存活菌劃線(xiàn)于平板，觀察8株生長(zhǎng)旺盛，挑取進(jìn)行芽孢染色，發(fā)現(xiàn)均為芽孢桿菌菌株。將8株進(jìn)行保存，進(jìn)行酶活降解有機(jī)物能力致病性測(cè)定。4.3.48株芽孢菌淀粉酶蛋白酶活力測(cè)定(平板透明圈大小):淀粉酶活力：觀察淀粉培養(yǎng)基(肉湯蛋白胨加0.2%可溶性淀粉)上菌落透明圈大小排列。一般1.0-4.0厘米。蛋白酶活力：觀察在酪素培養(yǎng)基上菌落透明圈大小排列。一般通過(guò)對(duì)兩種平板透明圈的比較，其中四株具有較高淀粉酶和蛋白酶活力，作為進(jìn)一步研究的菌株。還有一株淀粉酶活力較弱，蛋白酶活力較強(qiáng)?？膳c其他菌株搭配使用，故對(duì)5株菌株進(jìn)行研究，作為降解★★5.產(chǎn)蛋白酶枯草芽孢的復(fù)壯及初步研究5.1培養(yǎng)基：篩選培養(yǎng)基：牛肉膏3g/L酪素10g/LNaCl5g/LPH7.2-7.4.種子培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L牛肉膏5g/LNaCl5g/LPH7.2-7.4.發(fā)酵培養(yǎng)基：豆餅粉3%玉米粉3%麩皮2.5%K2HPO40.5g/LNa2HP5.2菌株篩選：初篩：依據(jù)水解圈的大小，選擇平板D/d較大的菌株，該菌株具有較強(qiáng)繁殖能力和分解酪素能力。復(fù)篩：挑取菌株劃線(xiàn)分離至純培養(yǎng)，然后搖瓶復(fù)篩。斜面30℃培養(yǎng)48h后，接種于100mL/500mL三角瓶中，30℃180r/min18h,在按2%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基上，30℃180r/min24h.取發(fā)酵液4000r/min離心得菌株粗酶液，測(cè)酶活力，由1392u/ml提高到1756u/ml。復(fù)壯后菌株生長(zhǎng)速度、繁殖能力和代謝能力均有不同提高。液體搖瓶培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線(xiàn)：液體菌種按2%接種于牛蛋液體培養(yǎng)基中(100mL/500mL)30℃180r/min培養(yǎng),定時(shí)取樣測(cè)定OD600值，該菌株6h達(dá)到對(duì)數(shù)期，18h達(dá)到穩(wěn)定期，24h達(dá)到衰退期。發(fā)酵罐培養(yǎng):50L發(fā)酵罐培養(yǎng)，2%接種量30℃18h前通風(fēng)量24018-24h通風(fēng)量改為300Lmin.m3有利于產(chǎn)酶進(jìn)行，粗酶液酶活力9411u/ml.6.產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌高產(chǎn)菌株的篩選6.1選育菌株：枯草6株地衣1株蠟樣2株凝結(jié)1株6.2培養(yǎng)基：淀粉培養(yǎng)基:可溶性淀粉10g/L蛋白胨10g/L牛肉膏5g/LNaCl種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉5g/L蛋白胨10g/L牛肉膏5g/LNaCl發(fā)酵培養(yǎng)基：豆餅粉1.5%玉米粉2%NaCl2.5g/LK2HPO42g/LNa2HP042g/LMgS040.2g/L檸檬酸鈉2.0g/L硫酸銨0.75g/L氯化鈣6.3菌株篩選：初篩：菌種活化：接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃12h,菌液點(diǎn)接于淀粉培養(yǎng)基培養(yǎng)2-3天，革氏碘液染色，菌落周?chē)该魅?。用游?biāo)卡尺測(cè)量圈的直徑菌落直徑，決定酶活力的高低。復(fù)篩：制備粗酶液：活化菌株接種于種子培養(yǎng)基中，37℃12h,然后以5%接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃160r/min48h,發(fā)酵24h后補(bǔ)加0.02%碳酸鈣，4000r/min離心20min得上清液為菌株粗酶液，測(cè)酶活力。注：雖透明圈大小反映酶濃度的高低，但不完全代表菌株產(chǎn)酶能力。原因多樣固體液體培養(yǎng)條件不同，菌苔大小及在平板上堆積情況的差異，不同菌株具有不同生長(zhǎng)和產(chǎn)酶速度及淀粉酶酶系等。故液體復(fù)篩必不可少。7.高產(chǎn)淀粉酶蛋白酶枯草芽孢桿菌篩選及鑒定7.1菌株來(lái)源：科研部門(mén)提供和從水體中分離純化篩選幾株菌株。7.2培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L酵母膏5g/L葡萄糖1.0g/LK2HPO43g/L產(chǎn)酶培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L酵母膏5g/L葡萄糖1.0g/L可溶性淀粉6.3粗酶液制備：各菌種接種于60mL/250mL種子培養(yǎng)基活化后，接種于產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基，30℃120r/min20h,4000r/min離心15-20min,取上清液于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.土壤中淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選及其發(fā)酵條件研究8.1培養(yǎng)基和試劑8.1.1淀粉培養(yǎng)基：分離篩選用8.1.2檢測(cè)試劑(路戈氏碘液)碘片1g,碘化鉀2g,蒸餾水300mL。配制方法：先用少量(3-5mL)蒸餾水溶解碘化鉀，再加入碘片，待碘片完全溶解后，加水稀釋至300mL,于棕色瓶?jī)?nèi)備用。8.2菌株分離與篩選初篩實(shí)驗(yàn)中，以菌落周?chē)纬伤馊χ睆降拇笮∽鳛榈矸勖富盍Φ某醪脚卸ǖ囊罁?jù)，水解圈大的，淀粉酶的活力就大。菌種分離：初篩：用梯度稀釋法來(lái)分離淀粉酶產(chǎn)生菌。取10-6、10-7、10-8三個(gè)稀釋度的試管中吸取0.1mL懸液，均勻涂布于淀粉培養(yǎng)基平板上，于30-37℃培養(yǎng)36-48h,根據(jù)菌落不同挑取菌落進(jìn)行保存并編號(hào)。同時(shí)，將檢測(cè)試劑(路戈氏碘液)加入到平板中，涂布均勻，菌落周?chē)纬伤馊Φ木昙词钱a(chǎn)淀粉酶的菌株，記住其編號(hào),以便進(jìn)行復(fù)篩。共得到52株淀粉酶生產(chǎn)菌，其水解圈直徑從0.5mm到27mm,其中活性較強(qiáng)的細(xì)菌有6株。將這6株菌進(jìn)行復(fù)篩，用分離培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)2d離心后，用檢測(cè)培養(yǎng)基打孔檢測(cè)其上清液，8h后測(cè)得水解圈直mm的菌株為NMXY-3,因此選取NMXY-3號(hào)菌株作為目的菌株目的菌株在分離平板上形成水解圈復(fù)篩：在初篩中分離到的產(chǎn)淀粉酶的菌株活化后接入裝有分離培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30-37℃搖床發(fā)酵培養(yǎng)48h,發(fā)酵液4000rpm離心10min,取上清液。在檢測(cè)培養(yǎng)基上打孔后,將上清液加入到孔中后放入恒溫箱中靜置8h后取出，用路戈氏碘液加入到平板中，涂布均勻，水解圈大的其發(fā)酵液上清中的淀粉酶的活性就高，取活性最高的菌株作為目的菌株，對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵條件實(shí)驗(yàn)。(在測(cè)定發(fā)酵液中淀粉酶的活性時(shí)，采用檢測(cè)檢測(cè)培養(yǎng)基打孔法進(jìn)行測(cè)定，其實(shí)質(zhì)是檢測(cè)的單位體積發(fā)酵液上清液的淀粉酶的活性。將發(fā)酵液4000rpm離心10min,取上清液。在檢測(cè)培養(yǎng)基上面打孔后，將上清液加入到孔中后放入恒溫箱中靜置8h后取出，把路戈氏碘液加入到平板中，涂布均勻，量取水解圈的直徑并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。此方法的注意以下操作：在倒平板時(shí),應(yīng)使同一平板和不同平板培養(yǎng)基的厚度一致，培養(yǎng)基的表面要平。加入的上清液的量要一致。否則就會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其原理是根據(jù)淀粉酶的活性與其形成的水解圈的直徑之間雖然不完全成正比，但成正相關(guān),水解圈的直徑越大，其活性就越高)8.3發(fā)酵條件的優(yōu)化取淀粉酶活性最強(qiáng)的菌株作為研究對(duì)象，對(duì)其最佳的發(fā)酵條件進(jìn)行在發(fā)酵條件中，選取了培養(yǎng)基的初始pH值、培養(yǎng)溫度梯度、碳源、氮源、金屬離子等指標(biāo)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。7種培養(yǎng)基的初始pH值、5種碳源、3種氮源、5種金屬離子等用相應(yīng)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度梯度實(shí)驗(yàn)用分離培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基在不同的溫度4種溫度下培養(yǎng)。每個(gè)指標(biāo)做3個(gè)重復(fù)，取平均值。培養(yǎng)2d后，取發(fā)酵液，8000rpm離心5min,取上清液。在檢測(cè)培養(yǎng)基上面打孔后，將上清液加入到孔中后放入恒溫箱中靜置8h后取出，把路戈氏碘液加入到平板中，涂布均勻，量取水解圈的直徑并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。8.4NMXY-3號(hào)菌株的初步鑒定對(duì)此菌株于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)18h后，挑取少量菌體作涂片后用結(jié)晶紫染色后，用光學(xué)顯微鏡油鏡觀察,其菌體呈球狀，及其生理特征初步判定其為一種雙球菌，NMXY-3。圖2目的菌株在油鏡下的形態(tài)(1000倍)在產(chǎn)生淀粉酶的細(xì)菌中，研究較多的有枯草桿菌、地衣芽孢桿菌等桿菌類(lèi)，而該淀粉酶產(chǎn)生菌為雙球菌。9.枯草芽孢桿菌的分離與鑒定微生態(tài)制劑(芽孢桿菌、乳酸桿菌、酵母菌和光和菌等的混合或單一制劑)廣泛應(yīng)用于飼料工業(yè)添加劑的開(kāi)發(fā)、水產(chǎn)養(yǎng)殖、水質(zhì)凈化和病蟲(chóng)害的防治，這類(lèi)產(chǎn)品的應(yīng)用極大地改善了畜牧業(yè)及漁業(yè)的產(chǎn)品品質(zhì)，減少或避免了使用一些副作用較大的農(nóng)藥。隨著生態(tài)環(huán)境日益惡化，養(yǎng)殖生產(chǎn)中用藥量不斷參加，其后果影響了水產(chǎn)品安全和產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。很多發(fā)達(dá)國(guó)家已制定嚴(yán)格的農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)口檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，大幅降低農(nóng)藥和抗生素的殘留量，用微生物制劑改善養(yǎng)殖水體微生態(tài)環(huán)境也受到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注改善。養(yǎng)殖水體微生態(tài)環(huán)境的改善是多種微生物共同作用的結(jié)果,能更有利于吸收、分解S02、惡臭味的有害氣體。同時(shí)，這些微生物又可以產(chǎn)生無(wú)機(jī)生活的酸性環(huán)境，并從根本上降解分解時(shí)產(chǎn)生惡臭氣體的物質(zhì)。若能將來(lái)源豐富、污染環(huán)境的水產(chǎn)廢棄物,經(jīng)過(guò)無(wú)公害化處理轉(zhuǎn)化為種植業(yè)所急需的有機(jī)肥，則既可以增加經(jīng)濟(jì)效益,,又能改變糞便堆積、臭氣揮發(fā)的狀態(tài)。水產(chǎn)腐生質(zhì)中存在著多種微生物，其中枯草芽孢桿菌具有凈化水質(zhì)的水產(chǎn)腐生質(zhì)中分離出枯草芽孢桿菌,為研究改善菌群打下基礎(chǔ)，同時(shí)為枯草芽孢桿菌在養(yǎng)殖水質(zhì)的供參考。作用。本實(shí)驗(yàn)擬在水體問(wèn)題的混合生態(tài)調(diào)控應(yīng)用提枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是芽孢桿菌屬的一種。單個(gè)細(xì)胞0.7-0.8×2-3微米，著色均勻。無(wú)莢膜，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。革蘭氏陽(yáng)性菌，芽孢0.6-0.9×1.0-1.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí),常形成皺酸。需氧菌?？衫玫鞍踪|(zhì)、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。有的菌株是α淀粉酶和中性蛋白酶的重要生產(chǎn)菌；有的菌株具有強(qiáng)烈降解核苷酸的酶系，故常作選育核苷生產(chǎn)菌的親株或制取5’-核苷酸酶的菌種。廣泛分布在土壤、水體及腐敗的有機(jī)物中,易在枯草浸汁中繁殖，故名。9.2.研究?jī)?nèi)容及方法：9.2.1菌種分離材料：水產(chǎn)腐生質(zhì)(由多種未知菌群組成)9.2.2實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基：酵母膏5g胰蛋白胨10g氯化鈉10g水1000ml瓊脂粉2%PH7.6TSA培養(yǎng)基：葡萄糖2.5g磷酸二氫鉀2.5g氯化鈉5g大豆蛋白胨3g蛋白胨17g水1000ml瓊脂粉2%PH7.6吲哚試驗(yàn)培養(yǎng)基：蛋白胨10g氯化鈉1g蒸餾水1000mlPH7.6Ehrlich氏試劑：對(duì)位二氨基苯甲醛1g,無(wú)水乙醇95ml,濃鹽酸20ml,先用乙醇溶解試劑后加鹽酸，避光保存.微量生化反應(yīng)管：葡萄糖產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)枸櫞酸鹽試驗(yàn)產(chǎn)H2S實(shí)驗(yàn)產(chǎn)氨實(shí)驗(yàn)等9.2.3實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備菌種分離材料--實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基--微量生化反應(yīng)管--實(shí)驗(yàn)器材9.2.4細(xì)菌的初步分離及純化取少量水產(chǎn)腐生質(zhì)溶解于50ml蒸餾水中，可調(diào)移液槍吸取200μl上層清液平鋪于培養(yǎng)基，并用經(jīng)酒精燈火焰消毒的鉑爾絲將液體均勻涂布于培養(yǎng)基上，入恒溫箱培養(yǎng)24h后觀察平板上的菌落，挑取疑似枯草芽孢桿菌菌落并制作菌落涂片。取一滴蒸餾水置于載玻片上，用接種針挑取菌落在蒸餾水中涂布。制作的涂片自然干燥并經(jīng)火焰固定，固定的溫度不宜過(guò)高，以玻片背面接觸手背不燙為準(zhǔn)，否則可能使細(xì)菌形態(tài)改變。將固定后的涂片進(jìn)行革蘭氏染色，于100倍油鏡下觀察并記錄菌株的個(gè)體特征。保留革蘭氏陽(yáng)性菌，不斷挑取單個(gè)菌落進(jìn)行劃線(xiàn)及保存,直到得到純凈的單一菌落。9.2.5細(xì)菌的生化鑒定9.2.5.1氧化型與發(fā)酵型·用滅菌牙簽取單菌落接種到明膠微量生化反應(yīng)管，37℃培養(yǎng)24h,觀察結(jié)果并記錄。在有氧條件下稱(chēng)為氧化,無(wú)氧條件下稱(chēng)為發(fā)酵。這對(duì)區(qū)別微球菌與葡萄糖菌、腸桿菌科成員中尤其9.2.5.2糖類(lèi)分解實(shí)驗(yàn)·取某一細(xì)菌的24h純培養(yǎng)物分別接種到葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖微量生化反應(yīng)管內(nèi),37C培養(yǎng)24h,觀察結(jié)果并記錄。若細(xì)菌分解糖則產(chǎn)酸或產(chǎn)酸或產(chǎn)氣,使培養(yǎng)基顏色改變，從而判斷細(xì)菌是否分解某種糖或其他碳水化合物。9.2.5.3硫化氫試驗(yàn)·取一種細(xì)菌純培養(yǎng)物，接種于H2S微量發(fā)酵管中，置于37C培養(yǎng)24h后，觀察結(jié)果。培養(yǎng)液呈黑色者為陽(yáng)性,以“+”表示，無(wú)色者為陰性，以“-”表示。9.2.5.4枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)·取純培養(yǎng)細(xì)菌接種于西蒙氏枸櫞微量生化反應(yīng)管內(nèi)，置于37C培養(yǎng)48-72h,培養(yǎng)基由草綠色變?yōu)樯钏{(lán)色為陽(yáng)性，否則為陰性。腸桿菌、酸桿菌和一些沙門(mén)氏菌種產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)，可見(jiàn)菌體生長(zhǎng)良好或培養(yǎng)基顯為深藍(lán)色。9.2.5.5吲哚(靛基質(zhì))試驗(yàn)將一小指大的脫脂棉，滴上兩滴Ehrlich氏試劑，再在同一處加滴兩滴高硫酸鉀(K2S208)飽和水溶液,置于含培養(yǎng)液的被檢試管中，離液面約1.5cm,將被檢試管放入燒杯或搪瓷缸