電化學(xué)發(fā)光免疫分析法

電化學(xué)發(fā)光免疫分析法Electro-ChemiluminescenceImmunoassay(ECLI)主講人崔天根

電化學(xué)發(fā)光免疫分析法

Electro-ChemiluminescenceImmunoassay(ECLI)免疫分析法發(fā)光和化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光免疫分析法電化學(xué)發(fā)光電化學(xué)發(fā)光免疫分析法免疫分析法它是基于抗原和抗體的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的一種技術(shù)手段?？乖贵w反應(yīng)是指抗原與相應(yīng)的抗體之間發(fā)生的特異性反應(yīng)，它既可以發(fā)生在體內(nèi)，也可以發(fā)生在體外。免疫標(biāo)記技術(shù)是將一些既容易測(cè)定又具有高度敏感性的物質(zhì)標(biāo)記到特異性抗原或抗體分子上，通過這些標(biāo)記物的增強(qiáng)放大效應(yīng)來顯示反應(yīng)系統(tǒng)中抗原或抗體的性質(zhì)或含量。免疫學(xué)檢測(cè)的發(fā)展階段免疫學(xué)檢測(cè)主要是利用抗原和抗體的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的一種手段，由于其可以利用同位素、酶、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等對(duì)檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行放大和顯示，因此常被用于檢測(cè)蛋白質(zhì)、激素等微量物質(zhì)。我國(guó)免疫學(xué)的檢測(cè)基本歷經(jīng)了以下幾個(gè)過程:中國(guó)免疫學(xué)檢測(cè)的歷史演進(jìn)放射免疫檢測(cè)：興于20世紀(jì)70年代，現(xiàn)在已經(jīng)基本淘汰，可能有些小醫(yī)院還在使用。酶聯(lián)免疫檢測(cè)：興于20世紀(jì)80年代，現(xiàn)普遍使用于各級(jí)臨床機(jī)構(gòu)，為我國(guó)臨床免疫診斷的基本方法。以化學(xué)發(fā)光為代表的光生物學(xué)標(biāo)記及免疫檢測(cè)技術(shù)，始于20世紀(jì)90年代，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于縣級(jí)以上各醫(yī)療機(jī)構(gòu)，產(chǎn)品已經(jīng)步入成熟期。按示蹤物及標(biāo)記種類分放射免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)金免疫技術(shù)勻相免疫測(cè)定非勻相免疫測(cè)定按示蹤物及標(biāo)記種類分按測(cè)定物反應(yīng)體系的物理狀態(tài)分免疫分析檢測(cè)的技術(shù)分類發(fā)光的分類光照發(fā)光：發(fā)光劑經(jīng)短波長(zhǎng)入射光照射后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)回復(fù)至基態(tài)時(shí)發(fā)出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的可見光。生物發(fā)光：反應(yīng)底物在熒光素酶的催化下利用ATP產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)的氧化熒光素，后者在回復(fù)到基態(tài)時(shí)多余的能量以光子的形式放出?；瘜W(xué)發(fā)光：在常溫下由化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的光的發(fā)射，化學(xué)發(fā)光是一個(gè)多步驟的過程。在自然界有各種各樣的發(fā)光現(xiàn)象發(fā)光螢火蟲螢火蟲發(fā)光深海魚發(fā)光化學(xué)發(fā)光

Chemiluminescence

（CL）化學(xué)發(fā)光是指在某些特殊的化學(xué)反應(yīng)中，反應(yīng)的中間體或產(chǎn)物由于吸收了反應(yīng)釋放的化學(xué)能而處于電子激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回到基態(tài)時(shí)伴隨產(chǎn)生的光輻射現(xiàn)象?；瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)包括兩個(gè)關(guān)鍵的步驟：化學(xué)激發(fā)和發(fā)光化學(xué)發(fā)光分析----根據(jù)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在某一時(shí)刻的發(fā)光強(qiáng)度或反應(yīng)的發(fā)光總量來確定反應(yīng)中相應(yīng)組分含量的分析方法，成為化學(xué)發(fā)光分析?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析----是集靈敏的化學(xué)發(fā)光技術(shù)和特異的抗原抗體免疫測(cè)定于一體的檢測(cè)技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析的特點(diǎn)：靈敏度高、特異性高、分離簡(jiǎn)便、快速、試劑無(wú)毒、安全穩(wěn)定、可自動(dòng)化。

化學(xué)發(fā)光免疫分析Chemiluminescenceimmunoassay(CLIA)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的類型

按發(fā)光劑不同分為發(fā)光酶免疫測(cè)定（Chemiluminescenceenzymeimmunpassay

CLEIA）化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)（ChemiluminescenceimmunoassayCLIA）電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)（ElectrocheminluminescenceimmunoassayECLI）按分離方法不同分微離子化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定磁顆?；瘜W(xué)發(fā)光免疫測(cè)定

化學(xué)發(fā)光劑機(jī)制

某些化合物可以利用化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生能量使其產(chǎn)物分子或反應(yīng)中間態(tài)分子上升至電子激發(fā)態(tài)，當(dāng)此產(chǎn)物分子或中間態(tài)分子衰退至基態(tài)時(shí)，以發(fā)射光子的形式釋放能量（即發(fā)光）?；瘜W(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物

在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物。發(fā)光劑分為熒光素、生物發(fā)光劑和化學(xué)發(fā)光劑?；瘜W(xué)發(fā)光劑應(yīng)符合以下幾個(gè)條件能參與化學(xué)反應(yīng)；與抗原或抗體偶聯(lián)后成穩(wěn)定的結(jié)合物試劑；偶聯(lián)后仍保留高的量子效應(yīng)和反應(yīng)動(dòng)力；應(yīng)不改變或極少改變被標(biāo)記物的理化特性，特別是免疫活性。魯米諾1,酶促反應(yīng)的發(fā)光底物是指經(jīng)酶的降解作用而發(fā)出光的一類發(fā)光底物CLEIA中常用的酶有HRP和APHRP的發(fā)光底物有魯米諾、對(duì)一羥基苯乙酸AP的發(fā)光底物有AMPPD、4—MUP（熒光底物）特點(diǎn)：可做標(biāo)記物，也可以做過氧化物酶的底物酶促反應(yīng)的發(fā)光底物1.魯米諾HPA在H2O2存在下被ＨPR氧化成氧化二聚體（熒光物質(zhì)），在350nm激發(fā)光作用下，發(fā)出450nm波長(zhǎng)的熒光，可用熒光光度計(jì)計(jì)量。對(duì)一羥基苯乙酸（HPA）原理屬于酶免疫測(cè)定的一種，只是最后一步酶反應(yīng)所用底物為發(fā)光劑，通過發(fā)光反應(yīng)發(fā)出的光在特定的儀器上進(jìn)行測(cè)定。技術(shù)類型根據(jù)酶促反應(yīng)所用底物不同可分為：

1熒光酶免疫測(cè)定技術(shù)

2化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定技術(shù)根據(jù)免疫學(xué)反應(yīng)模式分

1雙抗體夾心法和雙抗原夾心法

2固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法一，發(fā)光酶免疫測(cè)定（CLEIA）化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定技術(shù)反應(yīng)原理圖抗原抗體結(jié)合反應(yīng)將已包被了抗體的乳膠顆粒和待測(cè)標(biāo)本加入反應(yīng)杯中，經(jīng)溫育一定時(shí)間后，再加入AP標(biāo)記抗體，溫育，形成固相包被抗原—抗體—酶標(biāo)記復(fù)合物。分離技術(shù)將復(fù)合物轉(zhuǎn)移到玻璃纖維上，用緩沖液洗滌，沒結(jié)合的抗原被洗脫，酶標(biāo)抗體-抗原-膠乳微?？贵w復(fù)合物被保留在纖維膜上。酶促發(fā)光反應(yīng)加入4-MUP，酶標(biāo)抗體上的AP將4-MUP分解，形成4-MU，它在360nm激發(fā)光照射下發(fā)出448nm的熒光，經(jīng)光記錄儀放大處理計(jì)算出待測(cè)物質(zhì)的含量。發(fā)光酶免疫測(cè)定技術(shù)的技術(shù)要點(diǎn)分離技術(shù)磁顆粒分離法

原理為血清樣品與標(biāo)準(zhǔn)品中的抗原或抗體與磁顆粒上的一定量的抗體或抗原反應(yīng)，產(chǎn)生的抗原抗體磁性顆粒復(fù)合物，在磁場(chǎng)作用下沉降，使結(jié)合部分與游離部分分離。

微粒子捕獲法

采用無(wú)磁性的微粒子作為抗原抗體的包被載體，然后用纖維膜柱子進(jìn)行酶標(biāo)記物的結(jié)合和游離狀態(tài)的分離。包被珠分離法

用聚苯乙烯等材料制成用作包被抗原抗體的小珠，經(jīng)抗原抗體反應(yīng)后，將結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的酶標(biāo)記物分離。二.化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)(ELIA)原理用發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體，與待測(cè)樣本中相應(yīng)的抗體或抗原、磁性顆粒上的抗原或抗體反應(yīng)，通過磁場(chǎng)把結(jié)合狀態(tài)（沉淀部分）和游離狀態(tài)的化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)記物分離開來，然后加入發(fā)光促進(jìn)劑進(jìn)行發(fā)光發(fā)應(yīng)。技術(shù)類型

1分離方法常用磁顆粒分離技術(shù)

2免疫學(xué)反應(yīng)模式同酶發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)，不同的只是相應(yīng)的標(biāo)記物是吖啶脂而不是酶。直徑2.8微米磁性微粒子固相親和素—生物素親和素—生物素三,電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)(CLIA)電化學(xué)發(fā)光(ECL)

原理是指在電極上施加一定波形的電壓或電流信號(hào),進(jìn)行電解反應(yīng)的產(chǎn)物之間或與體系中共存組分反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的現(xiàn)象.它包含了電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過程.

ECL和CL的區(qū)別在于:ECL是電啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng),而CL是通過化合物混合啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng),因此ECL反應(yīng)便于精確控制,具有靈活性.電化學(xué)發(fā)光劑ECL分析中采用三聯(lián)吡啶釕作為標(biāo)記物，其活化衍生物是三聯(lián)吡啶釕+N羥基琥珀酸胺脂（NHS），該衍生物具有水溶性，且高度穩(wěn)定，保證電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的高效和穩(wěn)定，而且避免了本底噪聲的干擾。三聯(lián)吡啶釕衍生物與免疫球蛋白結(jié)合的分子比超過20仍不會(huì)影響抗體的可溶性和免疫活性。三聯(lián)吡啶釕衍生物分子量小，空間位阻小，即便是小分子的核酸也能標(biāo)記，使檢測(cè)的菜單大大豐富，有更為廣闊的開發(fā)前景。三聯(lián)吡啶釕的特點(diǎn)電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物---

三聯(lián)吡啶釕

N羥基琥珀酰胺(NHS)酯光子620nm電化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測(cè)的技術(shù)原理二價(jià)的三聯(lián)吡啶釕在電場(chǎng)的作用下，失去一個(gè)電子氧化成三價(jià)的三聯(lián)吡啶釕同時(shí)，在電場(chǎng)的作用下，三丙胺也失去一個(gè)電子被氧化,然后脫氫成三丙胺自由基三丙胺自由基傳遞一個(gè)電子給三價(jià)的三聯(lián)吡啶釕使之進(jìn)入激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)的三聯(lián)吡啶釕不穩(wěn)定,以發(fā)射一個(gè)波長(zhǎng)為620nm的光子的形式釋放能量而回到基態(tài)三聯(lián)吡啶釕不被消耗,即發(fā)光標(biāo)記物可循環(huán)發(fā)光CH3CH2CH2-N-CH2CH2CH3CH2CH2CH3CH3CH2CH2-N-CH2CH2CH3+e-CH2CH2CH3CH3CH2CH2-N-C-CH2CH3CH2CH2CH3+H+CH3CH2CH2-N-HCH2CH2CH3+CH3CH2CHO氧化電極.

+.

.H氧化Ru(bpy)33+Ru(bpy)32++Ru(bpy)32+還原三丙胺(tripropylamine,TPA)ECL的測(cè)定模式ECL的優(yōu)勢(shì)注:試劑表現(xiàn)不僅僅表現(xiàn)在靈敏度和寬線性,還有特異性,重現(xiàn)性,線性回歸,攜帶率,準(zhǔn)確性和臨床符合性等多種表現(xiàn)靈敏度高(10-12~10-18)，可達(dá)Pg/ml或Pmol水平重復(fù)性好

CV＜5.0%檢測(cè)線性寬(7個(gè)數(shù)量級(jí))試劑穩(wěn)定，無(wú)污染，有效期長(zhǎng)操作簡(jiǎn)單，易于自動(dòng)化ECL的臨床應(yīng)用肝炎乙肝表面抗原乙肝表面抗體乙肝核心抗體乙肝核心抗體M乙肝e抗原乙肝e抗體甲狀腺功能三碘甲狀腺原氨酸甲狀腺素游離三碘甲狀腺原氨酸游離甲狀腺素超敏促甲狀腺素甲狀腺攝取甲狀腺球蛋白抗-TPO抗-Tg腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白