第三章 提取和分離

第三章DNA的提取與純化基因工程需要三種不同的DNA:

總DNA

質(zhì)粒DNA

噬菌體DNA學(xué)習(xí)內(nèi)容：制備細(xì)胞總DNA培養(yǎng)、搜集細(xì)菌細(xì)胞制備細(xì)胞提取物DNA純化、濃縮從其他生物中提取總DNA質(zhì)粒DNA提取根據(jù)分子大小分離根據(jù)結(jié)構(gòu)分離質(zhì)粒擴(kuò)增提取噬菌體DNA噬菌體的培養(yǎng)制備非溶源性噬菌體收集噬菌體從λ噬菌體中純化DNA純化M13DNAFigure3.1

ThebasicstepsinpreparationoftotalcellDNAfromacultureofbacteriaBasicSteps1.制備總DNA

基本步驟：1)收集細(xì)菌細(xì)胞2)打碎細(xì)胞，釋放內(nèi)容物3)去掉DNA以外的成分4)DNA溶液的濃縮1.1培養(yǎng)、搜集細(xì)菌細(xì)胞

兩種類型的細(xì)菌培養(yǎng)基的成分：M9培養(yǎng)基：

Na2HPO4(6.0)KH2PO4(3.0)NaCl(0.5)NH4Cl(1.0)MgSO4(0.5)Glucose(2.0)CaCl2(0.015)LB培養(yǎng)基：Yeastextract(5)NaCl(10)1.1培養(yǎng)、收集細(xì)菌細(xì)胞37°C，150-250rpm達(dá)到最大濃度2-3×109cell/ml,600nm下的OD值，1OD相當(dāng)于0.8×109cell/mlFigure3.2EstimationofbacterialcellnumberbymeasurementofopticaldensityFigure3.3

Harvestingbacteriabycentrifugation1.2制備細(xì)胞提取物

利用溶菌酶、EDTA或兩者結(jié)合。溶菌酶是存在于蛋清或眼淚、唾液等分泌物中，消化多聚物。EDTA絡(luò)合保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整的鎂離子，也可以抑制細(xì)胞中降解DNA酶的活性。一般溶菌酶或EDTA足以破壞細(xì)菌細(xì)胞，在提取液中同時(shí)還加入SDS。

Figure3.4

Preparationofacellextract.PreparationofacellextractFigure3.5Removalofproteincontaminantsbyphenolextraction.◆

PurificationofDNAfromacellextract1.制備細(xì)胞總DNA1.4DNA的濃縮與濃度測(cè)定最常用的方法是乙醇沉淀（同時(shí)含有Na離子）。DNA沉淀可用玻璃棒挑出，或者離心沉淀。260nm下測(cè)定吸光度，1OD相當(dāng)于50μg雙鏈DNA/ml。A260/A280=1.8，<1.8表示含有酚或蛋白質(zhì),>2說明有RNAFigure3.6CollectingDNAbyethanolprecipitation.◆ConcentrationofDNAsamplesFigure3.7TheCTABmethodforpurificationofplantDNA◆

PlantDNA(CTAB法)十六烷基三甲基溴化銨Figure3.8

Theuseofananion-exchangechromatographyresininDNApurification.陰離子交換層析法2質(zhì)粒DNA提取質(zhì)粒DNA的大小（8%）。DNA的構(gòu)造

Alkalinedenaturation

Ethidium

bromide（溴化二氨乙苯啡啶）-caesium

chloride（氯化銫）densitygradientcentrifugation2質(zhì)粒DNA提取2.1根據(jù)分子大小提取質(zhì)粒DNAsphaeroplasts裂解細(xì)胞可以破壞部分細(xì)胞壁，而保持細(xì)胞膜的完整。問題：裂解液中不可避免的包含一些染色體DNA質(zhì)粒分子非常大時(shí)，將與染色體DNA共沉淀Figure3.9Preparationofaclearedlysate.Sphaeroplast殘壁細(xì)胞2質(zhì)粒DNA提取2.2根據(jù)分子構(gòu)造提取堿裂解法基本原理：在非常窄的pH范圍內(nèi)，非螺旋化的DNA會(huì)變性，而螺旋化的質(zhì)粒不變性。在裂解液中加入氫氧化鈉，調(diào)pH值至12.0~12.5,破壞氫鍵，使DNA變性。加入酸，變性的細(xì)菌DNA進(jìn)一步聚集形成沉淀，通過離心的方法去除。另外一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，利用SDS（十二烷基磺酸鈉）（Sodiumdodecylsulfate，SDS），裂解，KAc中和可以去掉大部分的蛋白質(zhì)和RNA。Figure3.10Twoconformationofcirculardouble-strandedDNA.Twoconformationofcirculardouble-strandedDNAFigure3.11Plasmidpurificationbythealkalinedenaturationmethod.Alkalinedenaturation2質(zhì)粒DNA提取2.2EB—CsCl密度梯度離心法在大離心力條件下，形成梯度，生物大分子形成條帶。條帶的位置取決于其浮力密度。最上部是蛋白質(zhì)，中間是DNA，下部是RNA。Figure3.12

CsCldensitygradientcentrifugation.CsCldensitygradientcentrifugation2.2EB—CsCl密度梯度離心法EB插入相鄰的堿基之間，降低了DNA的浮力密度，但超螺旋的DNA結(jié)合EB浮力密度降低較小，僅有0.085g/cm3。CsCl可以用丁醇抽提，透析除去。純度可達(dá)100%。Figure3.13PartialunwindingoftheDNAdoublehelixbyEtBrintercalationbetweenadjacentbaseparirs.EBEB如何與DNA結(jié)合?Figure3.14PurificationofplasmiodDNAbyEtBr-CsCldensitygradientcentrifugation如何分離質(zhì)粒DNA？2質(zhì)粒DNA提取2.3質(zhì)粒擴(kuò)增 一些多拷貝質(zhì)粒具有在無蛋白合成條件下復(fù)制的能力。當(dāng)細(xì)胞增加到足夠數(shù)目時(shí)，加入蛋白合成抑制劑如氯霉素，繼續(xù)培養(yǎng)。在這個(gè)過程中，質(zhì)粒分子繼續(xù)復(fù)制，但染色體的復(fù)制和細(xì)胞分裂已經(jīng)停止，可以獲得上千個(gè)拷貝。Figure3.15Plasmidamplification●

PlasmidamplificationInhibitorofproteinsynthesis:Chloramphenical,12h,3噬菌體DNA的制備

當(dāng)培養(yǎng)物離心時(shí)，細(xì)菌沉淀到底部，噬菌體留在懸浮液中，去蛋白就可以獲得噬菌體DNA。

然而獲得大量的噬菌體DNA是一個(gè)障礙。每ml菌液可以獲得1010λ噬菌體，但只能產(chǎn)生500ngDNA。3噬菌體DNA的制備3.1噬菌體的培養(yǎng)

自然培養(yǎng)的噬菌體是溶源性的。要獲得大量的細(xì)胞外λ噬菌體，必須經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)使所有的λ噬菌體都進(jìn)入裂解周期，使細(xì)胞死亡釋放λ噬菌體。

3.1噬菌體的培養(yǎng)大部分實(shí)驗(yàn)室都使用cI突變的溫度敏感突變體。cI基因可以使噬菌體保持整合狀態(tài)，突變后轉(zhuǎn)變成溶菌性的。在cIts突變體中，cI基因在30°C條件下正常表達(dá)，在42°C時(shí)，不能正常表達(dá)，產(chǎn)生溶菌性。Figure3.17

Inductionofaλclts

lysogen（溶原菌）bytransferringfrom30℃to42℃LysogenicλphageAt30℃,cltsgeneproteinworks,Keeplysogeny（溶原性）:At42℃,cltsgeneproteindoesnotwork,produceextracellular

phage（細(xì)胞外抗菌素）.Figure3.18Achievingtherightbalancebetweencultureageandinoculumsizewhenpreparingasampleofanon-lysogenicphageNon-lysogenic

λphage（Lytic)由于缺失修飾，大多數(shù)基因工程載體屬于此類型。3噬菌體DNA的制備3.3收集噬菌體

噬菌體顆粒非常小，所以只有高速離心才能沉淀。通常利用PEG沉淀病毒顆粒，形成多聚體。離心可以收集λ噬菌體，重新溶解在少量的溶液中。3噬菌體DNA的制備3.4從λ噬菌體中純化DNA

PEG沉淀物中可能含有少量的細(xì)菌裂解物，也可能含有細(xì)菌DNA。這些組成部分可以通過梯度離心去掉。除去CsCl后可以獲得純凈的λ噬菌體。然后通過酚抽提或者蛋白酶處理蛋白質(zhì)外殼。Figure3.19Collectionofphageparticlesbypolyethylene（聚乙烯）glycol（乙二醇）(PEG)precipitation

CollectionofphageparticlesPurificationofλphageFigure3.20PurificationofλphageparticlesbyCsCldensitygradientcentrifugation.3.5純化M13DNA

每ml菌液可以獲得1012的噬菌體。這意味著少量的培養(yǎng)物可以獲得大量的噬菌體，如5ml或更少。由于細(xì)菌細(xì)胞不裂解，沒有細(xì)胞裂解物的問題，也不需要CsCl梯度離心。Fi