動(dòng)物細(xì)菌分離培養(yǎng)（動(dòng)物微生物課件）

掌握細(xì)菌常用標(biāo)本片的制作及染色方法；認(rèn)識(shí)革蘭氏染色的反應(yīng)特性；一、實(shí)訓(xùn)目的二、實(shí)訓(xùn)器材病料、細(xì)菌培養(yǎng)物、接種環(huán)、玻片、酒精燈、染色缸、染色架、染色液等。三、實(shí)訓(xùn)內(nèi)容（一）細(xì)菌標(biāo)本片的制作（二）血液推片的制作（三）常用的細(xì)菌染色方法（四）常用染色液的配制（五）注意事項(xiàng)（一）細(xì)菌標(biāo)本片的制作1.涂片2.干燥3.固定固體培養(yǎng)物：取清潔載玻片一塊，用吸管吸取生理鹽水1滴置于玻片中央，再將接種環(huán)在火焰上滅菌，待冷后從固體培養(yǎng)基上挑取少許菌落，置于玻片上的生理鹽水中混均勻，并在玻片上涂成直徑約為1cm的涂面，要求薄而均勻。（一）細(xì)菌標(biāo)本片的制作1.涂片液體培養(yǎng)物：取清潔載玻片一塊，將接種環(huán)在火焰上滅菌，待冷后取一滴培養(yǎng)液或液體，置于玻片中央，混均勻，涂成直徑約為1cm的涂面。病變組織抹片：做無(wú)菌切開(kāi)，用切面在玻片中央觸一下或壓印成一薄層即可。（一）細(xì)菌標(biāo)本片的制作1.涂片在室溫下自然干燥，必要時(shí)將涂面向上，置火焰上方30～40cm來(lái)回微烤使其干燥。2.干燥火焰固定：將干燥后的玻片涂面向上，在火焰上快速來(lái)回通過(guò)2～3次，其溫度以手背接觸玻片底面感覺(jué)微燙手為宜。化學(xué)固定：將干燥后的玻片浸入甲醇（乙醇、丙酮）中，或在玻片上滴數(shù)滴甲醇，2～3分鐘后自然揮發(fā)干燥。3.固定（二）血液推片的制作取一張邊緣整齊的載玻片，用其一端蘸取一滴血液，在另一張干凈無(wú)油脂的載玻片上，以45°角度均勻地推成一薄血涂片，以紅細(xì)胞不重疊為宜。1.取血：將血液滴在載玻片上。2.推片：以左手拿該片，用另一個(gè)載玻片作推片，在左手載玻片上由前向后接觸血滴，使兩載玻片約成45°角，輕輕移動(dòng)，使血滴成一直線，然后由前向后推為一均勻的薄片。5/11/202413讓血液粘附在推片上推出均勻的血膜5/11/202415竅門(mén)：將載玻片的一端墊起，有助于推出均勻血膜。5/11/202416做細(xì)菌涂片時(shí)，不宜涂得過(guò)厚，以免影響制片效果。固定必須確實(shí)，火焰固定時(shí)不宜溫度過(guò)高，以免破壞菌體結(jié)構(gòu)。每種染液染色的過(guò)程中應(yīng)保持染色液不干，尤其加熱染色的染液，在染色過(guò)程中應(yīng)隨時(shí)添加，以免蒸發(fā)干，影響染色效果。每種染液染色后，應(yīng)用水將染液一起沖掉，不可先將染液傾去后再用水沖洗。注意事項(xiàng)：細(xì)菌標(biāo)本片制備及染色方法

掌握細(xì)菌常用標(biāo)本片的制作及染色方法；認(rèn)識(shí)革蘭氏染色的反應(yīng)特性；一、實(shí)訓(xùn)目的二、實(shí)訓(xùn)器材病料、細(xì)菌培養(yǎng)物、接種環(huán)、玻片、酒精燈、染色缸、染色架、染色液等。三、實(shí)訓(xùn)內(nèi)容（一）細(xì)菌標(biāo)本片的制作（二）血液推片的制作（三）常用的細(xì)菌染色方法（四）常用染色液的配制（五）注意事項(xiàng)（一）細(xì)菌標(biāo)本片的制作1.涂片2.干燥3.固定固體培養(yǎng)物：取清潔載玻片一塊，用吸管吸取生理鹽水1滴置于玻片中央，再將接種環(huán)在火焰上滅菌，待冷后從固體培養(yǎng)基上挑取少許菌落，置于玻片上的生理鹽水中混均勻，并在玻片上涂成直徑約為1cm的涂面，要求薄而均勻。（一）細(xì)菌標(biāo)本片的制作1.涂片液體培養(yǎng)物：取清潔載玻片一塊，將接種環(huán)在火焰上滅菌，待冷后取一滴培養(yǎng)液或液體，置于玻片中央，混均勻，涂成直徑約為1cm的涂面。病變組織抹片：做無(wú)菌切開(kāi)，用切面在玻片中央觸一下或壓印成一薄層即可。（一）細(xì)菌標(biāo)本片的制作1.涂片在室溫下自然干燥，必要時(shí)將涂面向上，置火焰上方30～40cm來(lái)回微烤使其干燥。2.干燥火焰固定：將干燥后的玻片涂面向上，在火焰上快速來(lái)回通過(guò)2～3次，其溫度以手背接觸玻片底面感覺(jué)微燙手為宜?；瘜W(xué)固定：將干燥后的玻片浸入甲醇（乙醇、丙酮）中，或在玻片上滴數(shù)滴甲醇，2～3分鐘后自然揮發(fā)干燥。3.固定（二）血液推片的制作取一張邊緣整齊的載玻片，用其一端蘸取一滴血液，在另一張干凈無(wú)油脂的載玻片上，以45°角度均勻地推成一薄血涂片，以紅細(xì)胞不重疊為宜。1.取血：將血液滴在載玻片上。2.推片：以左手拿該片，用另一個(gè)載玻片作推片，在左手載玻片上由前向后接觸血滴，使兩載玻片約成45°角，輕輕移動(dòng)，使血滴成一直線，然后由前向后推為一均勻的薄片。5/11/202431讓血液粘附在推片上推出均勻的血膜5/11/202433竅門(mén)：將載玻片的一端墊起，有助于推出均勻血膜。5/11/202434（三）常用的細(xì)菌染色方法（三）常用的細(xì)菌染色方法1.單染法：又叫簡(jiǎn)單染色法，即只用一種染料進(jìn)行染色。（1）美藍(lán)染色法染色液配制：甲液：美藍(lán)0.3g、95%酒精30mL；乙液：0.01%苛性鉀溶液100mL。先配甲液，將美藍(lán)放入研缽中，徐徐加入酒精研磨均勻后，把甲、乙兩液混合，過(guò)夜后用濾紙過(guò)濾即成。新鮮配制的美藍(lán)液染色不好，陳舊的染色好。（三）常用的細(xì)菌染色方法1.單染法：又叫簡(jiǎn)單染色法，即只用一種染料進(jìn)行染色。染色方法：在已固定好的抹片上，滴加適量美藍(lán)染色液覆蓋涂面，染色2～3min，水洗，吸水紙輕壓吸干或晾干和鏡檢，結(jié)果菌體呈藍(lán)色。（1）美藍(lán)染色法（2）瑞氏染色法：染色液的配制：取瑞氏染料0.1g，純中性甘油1ml，在研缽中混合研磨，再加入甲醇60ml，使其溶解，裝入中性瓶中過(guò)夜，次日過(guò)濾，盛入棕色瓶中，暗處保存。保存越久，染色越好。染色方法：細(xì)菌抹片自然干燥后，滴加瑞氏染色液于涂片上以固定標(biāo)本，1～3min后，再滴加與染色液等量的磷酸緩沖液或中性蒸餾水于玻片上，輕輕搖晃使與染色液混和均勻，5min左右水洗，干后鏡檢，結(jié)果菌體呈藍(lán)色，組織細(xì)胞等物呈其他顏色。（2）瑞氏染色法：2.復(fù)染（三）常用的細(xì)菌染色方法革蘭氏染色原理革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家C.Gram所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽(yáng)性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-

）兩大類，是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別染色法（KOH溶解試驗(yàn)和氨基肽酶試驗(yàn)可用作輔助試驗(yàn)）。該染色法所以能將細(xì)菌分為G+菌和G-菌，是由這兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。2.復(fù)染（三）常用的細(xì)菌染色方法革蘭氏染色原理G-的細(xì)胞壁中脂類較多，肽聚糖少,用灑精脫脂時(shí)，脂類易除去使得細(xì)胞壁的孔隙變大，從而使結(jié)晶紫染料從細(xì)胞壁中洗脫出來(lái)，最后用紅色的染料復(fù)染時(shí)而顯紅色；G+的細(xì)胞壁含脂類較少，肽聚糖多且交聯(lián)緊密，酒精作用后肽聚糖收宿，細(xì)胞壁的孔隙變小使得結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物不能脫出，經(jīng)紅色染料復(fù)染后仍為紫色。

革蘭氏染色染色：初染（結(jié)晶紫）媒染（碘液）脫色（酒精）復(fù)染（復(fù)紅）濾紙吸干油鏡鏡檢safraninCrystalviolet5/11/202442涂片

→

干燥

→

固定

→

草酸銨結(jié)晶紫染色1min

→

水洗干燥

→

碘液媒1min

→

水洗干燥

→

95%乙醇脫脂15~20s

→

水洗干燥→

番紅復(fù)染1min

→

水洗干燥→鏡檢。革蘭式染色流程路線：5/11/202443實(shí)訓(xùn)三：細(xì)菌標(biāo)本片制備及染色方法染色步驟5/11/2024（２）（３）（１）（４）１分鐘水洗１分鐘水洗15-３０秒水洗３０-60秒水洗吸干復(fù)紅復(fù)染95％乙醇脫色結(jié)晶紫初染盧戈碘液媒染（1）涂片→干燥→固定215/11/202445固定的目的和方法使細(xì)菌的細(xì)胞凝固，使菌體與玻片粘得更牢固可改變菌體對(duì)染料的通透性加熱固定可殺死細(xì)菌，比較安全固定的方法將制成的標(biāo)本勻速通過(guò)火焰三次5/11/202446（2）草酸銨結(jié)晶紫染色1min→

水洗干燥5/11/202447結(jié)晶紫初染１分鐘水洗

5/11/202448

（3）碘液媒染1min水洗→干燥5/11/202449碘液媒染１分鐘

水洗

（3）碘液媒染1min水洗→干燥5/11/202450

（4）95%乙醇脫色15～30秒→水洗干燥5/11/202451酒精脫色３０秒水洗5/11/202452

（4）95%乙醇脫色15～30秒→水洗干燥（5）番紅復(fù)染30S～1min→水洗干燥→鏡檢5/11/202453番紅復(fù)染３０秒水洗5/11/202454（5）番紅復(fù)染30S～1min→水洗干燥→鏡檢做細(xì)菌涂片時(shí)，不宜涂得過(guò)厚，以免影響制片效果。固定必須確實(shí)，火焰固定時(shí)不宜溫度過(guò)高，以免破壞菌體結(jié)構(gòu)。每種染液染色的過(guò)程中應(yīng)保持染色液不干，尤其加熱染色的染液，在染色過(guò)程中應(yīng)隨時(shí)添加，以免蒸發(fā)干，影響染色效果。每種染液染色后，應(yīng)用水將染液一起沖掉，不可先將染液傾去后再用水沖洗。注意事項(xiàng)：普通瓊脂培養(yǎng)基的配制57掌握普通瓊脂培養(yǎng)基的配制；一、實(shí)訓(xùn)目的二、實(shí)訓(xùn)器材滅菌鍋、培養(yǎng)皿、三角燒瓶、電熱鍋、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、蒸餾水、PH試紙。材料：牛肉膏3g,蛋白胨10g，氯化鈉5g,瓊脂20g。制備：將上述材料裝入1000mL燒杯中，煮沸，使瓊脂充分溶化，趁熱用2-4層紗布過(guò)濾，補(bǔ)充蒸餾水至1000mL，測(cè)定PH7.4-7.6。高壓滅菌（121℃，,30min）后，于無(wú)菌室或超凈臺(tái)內(nèi)分裝（試管每管約1/3高，傾斜冷卻；平皿厚度2-3mm，水平靜置冷卻）。樣品的稱量：天平的正確使用；稱取蛋白胨應(yīng)迅速。定容方法的準(zhǔn)確。注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)操作：每小組稱取3.3g營(yíng)養(yǎng)瓊脂裝入100mL燒杯中，煮沸，使瓊脂充分溶化，趁熱用2-4層紗布過(guò)濾，補(bǔ)充蒸餾水至100mL。高壓滅菌（121℃，,20min）后，于無(wú)菌室或超凈臺(tái)內(nèi)趁熱分裝（平皿厚度2-3mm，水平靜置冷卻）。細(xì)菌的分離培養(yǎng)-平板劃線法63掌握細(xì)菌的平板劃線分離培養(yǎng)法；一、實(shí)訓(xùn)目的二、實(shí)訓(xùn)器材無(wú)菌操作臺(tái)、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)基、菌種、接種環(huán)、酒精燈、酒精、棉球。接種針和接種環(huán)：由三部分組組成，即環(huán)（針）、金屬柄和絕緣柄。接種前后都要過(guò)火滅菌。接種針用于穿刺接種細(xì)菌，接種環(huán)用于固體、液體培養(yǎng)基的細(xì)菌接種。接種工具VS-1300-U型潔凈工作臺(tái)接種環(huán)境滅菌接種環(huán)沾取標(biāo)本接種滅菌接種環(huán)殺滅接種環(huán)沾染的細(xì)菌，以免污染標(biāo)本殺滅接種環(huán)沾染的細(xì)菌，以免污染環(huán)境接種的基本程序方法：細(xì)菌分離培養(yǎng)一般采取“劃線法”，主要有分區(qū)劃線、十字交叉劃線等方法，具體方法可按照個(gè)人習(xí)慣選擇應(yīng)用，目的是達(dá)到使被檢材料適當(dāng)?shù)南♂?，以達(dá)到獲得獨(dú)立單在的菌落，防止形成菌苔，以致不宜鑒別其菌落性狀。分區(qū)劃線法第一區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第二區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第三區(qū)劃線滅菌接種環(huán)點(diǎn)燃酒精燈。左手持平皿，上蓋下底，用左手的拇指、食指和中指將平皿蓋揭開(kāi)呈20°左右的角度（角度不能過(guò)大，以防空氣污染）。操作：右手持接種環(huán)，從混合培養(yǎng)物中沾取少許混合物涂布在培養(yǎng)基邊緣，然后將接種環(huán)多余的混合物在火焰中燒灼，待冷卻后，再與所涂混合物的地方輕觸，在空白區(qū)做“Z”形劃線，后再燒灼，冷卻后再在空白區(qū)劃線，反復(fù)操作，直至混合物稀釋到足夠形成單菌落。蓋好平皿，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h。操作：細(xì)菌培養(yǎng)性狀的觀察細(xì)菌群體形態(tài)－菌落菌落又稱克?。褐竼蝹€(gè)細(xì)菌在適合生長(zhǎng)的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部，在適宜的條件下經(jīng)培養(yǎng)后，生長(zhǎng)繁殖出巨大數(shù)量的菌體，形成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的有一定形態(tài)的獨(dú)立的群。菌苔：若長(zhǎng)出的菌落聯(lián)成一片則形成菌苔。因此在細(xì)菌培養(yǎng)中常將細(xì)菌在培養(yǎng)基表面劃線接種以獲得單個(gè)菌落。大小、顏色、透明度、邊緣整齊、光滑、粗糙、濕潤(rùn)、干燥、凸起、扁平、針尖狀、露珠狀等等。細(xì)菌群體形態(tài)－菌落菌落描述大小：不同細(xì)菌，其菌落大小變化很大。常用其直徑來(lái)表示，單位是mm或μm。細(xì)菌群體形態(tài)－菌落形狀：主要有圓形、露滴狀、乳頭狀或油煎蛋狀、云霧狀、放射狀或蛛網(wǎng)狀、同心圓狀、扁平和針尖狀等。細(xì)菌群體形態(tài)－菌落邊緣特征：有整齊、波浪狀、鋸齒狀、卷發(fā)狀等。性狀：有光滑、粗糙、皺褶、顆粒同狀、心圓狀、放射狀等。濕潤(rùn)度：有干燥和濕潤(rùn)兩種。細(xì)菌群體形態(tài)－菌落隆起度：有隆起、輕度隆起、中央隆起和云霧狀等。色澤和透明度：色澤有白、乳白、黃、橙、紅及無(wú)色等；透明度有透明、半透明、不透明等。細(xì)菌群體形態(tài)－菌落質(zhì)地：有堅(jiān)硬、柔軟和粘稠等。溶血性：分為α－溶血、β－溶血和γ－溶血三種。細(xì)菌群體形態(tài)－菌落菌落形態(tài)炭疽菌落炭疽菌落土霉菌菌落葡萄球菌菌落大腸桿菌菌落大腸桿菌菌落分離培養(yǎng)：將標(biāo)本或培養(yǎng)物劃線接種在固體培養(yǎng)基的表面，因劃線的分散作用，使許多原混雜的細(xì)菌在固體培養(yǎng)基表面上散開(kāi)。菌落：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)菌分裂繁殖成一堆肉眼可見(jiàn)的細(xì)菌群落。菌苔：多個(gè)菌落連成一片。固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特性觀察大?。翰煌?xì)菌，其菌落大小變化很大。常用其直徑來(lái)表示，單位是mm或μm。形狀：主要有圓形、露滴狀、乳頭狀或油煎蛋狀、云霧狀、放射狀或蛛網(wǎng)狀、同心圓狀、扁平和針尖狀等。邊緣特征：有整齊、波浪狀、鋸齒狀、卷發(fā)狀等。表面性狀：有光滑、粗糙、皺褶、顆粒狀、同心圓狀、放射狀等。濕潤(rùn)度：有干燥和濕潤(rùn)兩種。隆起度：有隆起、輕度隆起、中央隆起和云霧狀等。色澤和透明度：色澤有白、乳白、黃、橙、紅及無(wú)色等；透明度有透明、半透明、不透明等。質(zhì)地：有堅(jiān)硬、柔軟和粘稠等。細(xì)菌的人工培養(yǎng)人工培養(yǎng)的基本條件：培養(yǎng)基：人工配制的滿足細(xì)菌及其他微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和pH環(huán)境等；氣體環(huán)境：如O2等；溫度：通常35-37℃；時(shí)間：通常18-24h。按主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的來(lái)源：天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基按物理狀態(tài)：固體、液體、半固體培養(yǎng)基按用途：基礎(chǔ)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)基培養(yǎng)基的類型：液體培養(yǎng)基：含有各種營(yíng)養(yǎng)成分的水溶液。如肉湯培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑（如1.5%-2%瓊脂）。如瓊脂斜面培養(yǎng)基、瓊脂平板培養(yǎng)基。半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入0.5%的瓊脂制成。按物理狀態(tài)分類培養(yǎng)基的類型：基礎(chǔ)培養(yǎng)基：滿足一般微生物生長(zhǎng)繁殖所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。如肉湯培養(yǎng)基。營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基：只適合某種微生物生長(zhǎng)而不適合其他微生物生長(zhǎng)配制的培養(yǎng)基，這種方法達(dá)到分離這種微生物的目的。如血液瓊脂平板就是在瓊脂平板中加入血液、血清或動(dòng)植物提取液，鏈球菌、肺炎球菌在其上生長(zhǎng)良好。按用途分類培養(yǎng)基的類型：增菌培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基或營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中加入某種細(xì)菌生長(zhǎng)所需的特殊營(yíng)養(yǎng)成分，只適合這種微生物生長(zhǎng)而不適合其他微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。如亞硝酸鹽增菌培養(yǎng)基適合沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)。按用途分類培養(yǎng)基的類型：鑒別培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某種細(xì)菌生長(zhǎng)所需特殊化學(xué)物質(zhì)，某種微生物在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)后能產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，而這種代謝產(chǎn)物可以與培養(yǎng)基中的化學(xué)物質(zhì)發(fā)生特定的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的特征性變化，可將該微生物與其他微生物加以區(qū)別開(kāi)來(lái)。如糖發(fā)酵管、硫化氫培養(yǎng)基等。按用途分類培養(yǎng)基的類型：選擇培養(yǎng)基：根據(jù)不同微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的特殊要求，或?qū)ξ锢砘瘜W(xué)條件的抗性而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，利用這一類培養(yǎng)基可以把需要的微生物從混雜的微生物中分離出來(lái)。如SS瓊脂，分離腸道菌等。按用途分類培養(yǎng)基的類型：厭氧培養(yǎng)基：在無(wú)氧環(huán)境下生長(zhǎng)繁殖。如在肝片肉湯培養(yǎng)基上覆蓋液狀石蠟等。按用途分類培養(yǎng)基的類型：二、細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象混濁：大多數(shù)細(xì)菌沉淀：鏈狀生長(zhǎng)的細(xì)菌菌膜：專性需氧菌，如結(jié)核桿菌、枯草桿菌1.液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況

多數(shù)呈均勻混濁狀態(tài)少數(shù)鏈狀菌呈沉淀生長(zhǎng)專性需氧菌則在表面生長(zhǎng)，常形成菌膜菌膜二、細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象液體培養(yǎng)基中沉淀生長(zhǎng)混濁生長(zhǎng)表面生長(zhǎng)二、細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象分離培養(yǎng)：將標(biāo)本或培養(yǎng)物劃線接種在固體培養(yǎng)基的表面，因劃線的分散作用，使許多原混雜的細(xì)菌在固體培養(yǎng)基表面上散開(kāi)。菌落：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)菌分裂繁殖成一堆肉眼可見(jiàn)的細(xì)菌群落。菌苔：多個(gè)菌落連成一片。2.固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)二、細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象細(xì)菌在固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況光滑型菌落粗糙型菌落粘液型菌落二、細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象有鞭毛細(xì)菌：擴(kuò)散生長(zhǎng)，周圍渾濁無(wú)鞭毛細(xì)菌：沿穿刺線生長(zhǎng)，周圍透明3.半固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)二、細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象在半固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況：常用于觀察細(xì)菌動(dòng)力

有鞭毛的細(xì)菌可沿穿刺線呈羽毛狀或云霧狀混濁生長(zhǎng)無(wú)鞭毛細(xì)菌則只能沿穿刺線呈明顯的線狀生長(zhǎng)二、細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象混濁生長(zhǎng)沿穿刺線生長(zhǎng)無(wú)鞭毛細(xì)菌半固體培養(yǎng)基中有鞭毛細(xì)菌二、細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象三、人工培養(yǎng)細(xì)菌的意義1.細(xì)菌的鑒別與研究2.細(xì)菌性疾病的診斷和治療3.生物制品的制備4.其他方面——基因工程細(xì)菌的新陳代謝生物催化劑——酶根據(jù)酶所催化的反應(yīng)類型：氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶、合成酶；根據(jù)酶作用的部位：胞內(nèi)酶，胞外酶；根據(jù)酶的產(chǎn)生方式：固有酶，誘導(dǎo)酶；細(xì)菌的新陳代謝細(xì)菌新陳代謝包括：分解代謝與合成代謝營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解和轉(zhuǎn)化為能量的過(guò)程：分解代謝所產(chǎn)生的能量用于細(xì)胞組分的合成：合成代謝一、分解代謝產(chǎn)物由于細(xì)菌各自的酶系統(tǒng)不同，對(duì)糖、蛋白質(zhì)的分解能力的不同，因而代謝產(chǎn)物各異；據(jù)此利用生物化學(xué)方法鑒別不同細(xì)菌稱為細(xì)菌的生化反應(yīng)。細(xì)菌的新陳代謝（1）糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗(yàn)原理：細(xì)菌對(duì)各種糖的分解能力及代謝產(chǎn)物不同，可借以鑒別細(xì)菌。應(yīng)用：大腸桿菌能分解葡萄糖和乳糖，產(chǎn)生甲酸，甲酸解氫酶可將其分解為CO2和H2，所以生化反應(yīng)結(jié)果為產(chǎn)氣產(chǎn)酸。——糖代謝測(cè)定細(xì)菌的新陳代謝（1）糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗(yàn)——糖代謝測(cè)定細(xì)菌的新陳代謝傷寒沙門(mén)氏菌葡萄糖甲酸（缺乏甲酸脫氫酶，故只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣）（2）V-P試驗(yàn)大腸桿菌與產(chǎn)氣桿菌均分解葡糖糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。原理：葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇

二乙酰

紅色化合物（+）細(xì)菌OH-O胍基——糖代謝測(cè)定細(xì)菌的新陳代謝陽(yáng)性紅色產(chǎn)氣桿菌陰性對(duì)照大腸桿菌——糖代謝測(cè)定細(xì)菌的新陳代謝（2）V-P試驗(yàn)（3）甲基紅試驗(yàn)原理：葡萄糖丙酮酸混合酸（pH>5.4)

中性（pH<5.4)紅色反應(yīng)（+）大腸桿菌

橘黃色（-），產(chǎn)氣桿菌細(xì)菌甲基紅指示劑甲基紅指示劑——糖代謝測(cè)定細(xì)菌的新陳代謝（4）枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)溴麝香草酚藍(lán)枸櫞酸鹽碳酸鹽培養(yǎng)基中氨鹽細(xì)菌細(xì)菌氨（PH↑）淡綠轉(zhuǎn)深藍(lán)原理：應(yīng)用：產(chǎn)氣桿菌的鑒定。——糖代謝測(cè)定細(xì)菌的新陳代謝分解分解（1）吲哚試驗(yàn)原理

色氨酸吲哚玫瑰吲哚（紅色）應(yīng)用腸道桿菌的鑒定大腸埃希菌（+）沙門(mén)菌屬（-）二甲基氨基苯甲醛——蛋白質(zhì)代謝測(cè)定細(xì)菌的新陳代謝含有色氨酸酶的細(xì)菌分解（2）硫化氫試驗(yàn)原理

含硫氨基酸硫化氫硫化鉛/硫化亞鐵

應(yīng)用腸桿菌科，變形桿菌的鑒定。細(xì)菌醋酸鉛/硫酸亞鐵細(xì)菌的新陳代謝黑色（胱氨酸、甲硫氨酸）——蛋白質(zhì)代謝測(cè)定（3）尿素（脲）酶試驗(yàn)原理：

尿素氨培養(yǎng)基呈堿性紅色

應(yīng)用：腸桿菌科中變形桿菌屬的鑒定。細(xì)菌細(xì)菌的新陳代謝——蛋白質(zhì)代謝測(cè)定尿素酶酚紅指示劑（二）合成代謝產(chǎn)物1.與致病性有關(guān)的代謝產(chǎn)物（1）熱原質(zhì)（2）毒素（3）侵襲性酶2.與治療有關(guān)的代謝產(chǎn)物（1）抗生素（2）維生素細(xì)菌的新陳代謝3.與鑒別細(xì)菌有關(guān)的代謝產(chǎn)物（1）色素（2）細(xì)菌素（二）合成代謝產(chǎn)物細(xì)菌的新陳代謝（1）熱原質(zhì)（致熱原）細(xì)菌合成的一種極微量注入人或動(dòng)物體內(nèi)即能引起發(fā)熱反應(yīng)的物質(zhì)。大多數(shù)是G-菌的脂多糖。耐高溫，高壓蒸汽滅菌（121.3℃，20min）不能破壞，180℃4h或250℃45min或650℃1min才能被破壞。（二）合成代謝產(chǎn)物－與致病性有關(guān)的代謝產(chǎn)物細(xì)菌的新陳代謝（2）毒素內(nèi)毒素：G－菌崩解死亡后釋放出來(lái)的脂多糖。無(wú)特異性、毒性弱、抗原性弱。甲醛處理后不能使其完全脫毒，因此不能制成類毒素。（二）合成代謝產(chǎn)物－與致病性有關(guān)的代謝產(chǎn)物細(xì)菌的新陳代謝（2）毒素外毒素：具有抗原性強(qiáng)、毒性強(qiáng)、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。類毒素：外毒素經(jīng)0.3%-0.5%甲醛37℃處理后，其毒性完全喪失，但仍保留良好的抗原特性，是預(yù)防傳染病的一類重要的生物制品?？苟舅兀和舛舅乜纱碳C(jī)體產(chǎn)生特異性免疫抗體，這種抗體稱為抗毒素。（二）合成代謝產(chǎn)物－與致病性有關(guān)的代謝產(chǎn)物（3）侵襲性酶具有侵襲性的胞外酶，能損傷機(jī)體組織、促進(jìn)細(xì)菌的侵襲、擴(kuò)散，是細(xì)菌的重要致病物質(zhì)。如鏈球菌的透明質(zhì)酸酶。（二）合成代謝產(chǎn)物－與致病性有關(guān)的代謝產(chǎn)物細(xì)菌的新陳代謝（1）抗生素：多粘菌素、桿菌肽。（2）維生素：某些腸道菌合成，如B族維生素、VK。（二）合成代謝產(chǎn)物－與治療有關(guān)的代謝產(chǎn)物細(xì)菌的新陳代謝（1）色素：金黃色葡萄球菌——金黃色色素（脂溶性）、銅綠假單胞菌——-綠色色素（水溶性），可用于細(xì)菌鑒別。（2）細(xì)菌素：只能殺傷有親緣關(guān)系的細(xì)菌，如大腸菌素。無(wú)治療意義，有助于細(xì)菌分型。（二）合成代謝產(chǎn)物－與致鑒別細(xì)菌有關(guān)的代謝產(chǎn)物細(xì)菌的新陳代謝（1）應(yīng)用：疫苗效價(jià)檢查、血清效價(jià)測(cè)定、藥物治療效果檢測(cè)。（2）方法：用遞減劑量的病原菌感染易感動(dòng)物。（3）表示方法：最小致死量（MLD）：半數(shù)致死量（LD50）：最小感染量（MID）：半數(shù)感染量（ID50）：細(xì)菌毒力的大小可以隨自然和人工條件的改變而變化。掌握病原菌的毒力具有重要的臨床意義。細(xì)菌毒力測(cè)定知識(shí)要點(diǎn)：細(xì)菌細(xì)胞的化學(xué)組成細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)需要一、細(xì)菌細(xì)胞的化學(xué)組成微生物細(xì)胞水：80%-90%干物質(zhì)有機(jī)物：蛋白質(zhì)、糖、脂質(zhì)、核酸、維生素等及其降解產(chǎn)物

無(wú)機(jī)物：各種鹽類5/11/2024127菌體的重要成分（80-90%）。細(xì)胞組分、溶劑、參與代謝、適宜反應(yīng)溫度的保障（緩沖）、維持大分子構(gòu)象穩(wěn)定

1.水份二.細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)需要5/11/2024128根據(jù)需要的量可分為：常量元素：磷、硫、鉀、鈣、鎂、納、鐵等；微量元素：銅(Cu）、鋅（Zn）、鉬（Mo)、鈷（Co）、鎢（W）、鎳（Ni）等。5/11/20241292.無(wú)機(jī)鹽類二.細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)需要細(xì)胞生長(zhǎng)必需的各種金屬元素及微量元素構(gòu)成菌體成分；調(diào)節(jié)胞內(nèi)菌體內(nèi)外滲透壓；促進(jìn)酶的活性或作為某些輔酶組份；某些元素與細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖及致病作用密切相關(guān)；Fe——白喉?xiàng)U菌產(chǎn)毒菌

2.無(wú)機(jī)鹽類5/11/2024130二.細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)需要合成菌體的必需原料，獲取能量的來(lái)源無(wú)機(jī)碳源和有機(jī)碳源。各種有機(jī)碳源中，容易被細(xì)菌吸收的是糖類物質(zhì)，如：葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、甘露醇等。3.碳源5/11/2024131二.細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)需要從分子態(tài)氮到復(fù)雜的含氮化合物都可被不同的細(xì)菌利用；多數(shù)病原菌利用有機(jī)氮化合物，如氨基酸、蛋白胨；固氮菌有固氮作用，可以借助特殊的酶將無(wú)機(jī)氮如硝酸鹽等為氮源，主要用于合成菌體細(xì)胞質(zhì)及其他結(jié)構(gòu)成分。4.氮源5/11/2024132二.細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)需要5.生長(zhǎng)因子菌體自身不能合成或合成量不足,需要外源加入的、微量即可的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。如：維生素、氨基酸等。如營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)菌流感嗜血桿菌需X因子(高鐵血紅素)；V因子（輔酶Ⅰ或Ⅱ）可產(chǎn)生金黃色葡萄球菌。5/11/2024133二.細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)需要細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)類型腐生菌—利用無(wú)生命的有機(jī)化合物(如動(dòng)植物尸體和殘?bào)w)為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。寄生菌—從生活的寄主體內(nèi)吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

5/11/2024134自養(yǎng)菌異養(yǎng)菌

三、吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的方式

借助細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能完成。促進(jìn)擴(kuò)散被動(dòng)擴(kuò)散基團(tuán)移位主動(dòng)運(yùn)轉(zhuǎn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸方式5/11/20241351.被動(dòng)擴(kuò)散例如：H2O，O2，CO2，甘油，乙醇，脂肪酸等。(分子量小，脂溶性，極性小)5/11/2024136

三、吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的方式借助濃度差，單純靠物理方式擴(kuò)散；高濃度——低濃度；2.促進(jìn)擴(kuò)散5/11/2024137三、吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的方式高濃度到低濃度；借助載體蛋白；不消耗能量3.主動(dòng)運(yùn)轉(zhuǎn)特點(diǎn)：被運(yùn)送的物質(zhì)可逆濃度梯度低-高進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),要消耗能量，必需有能量參加。有膜載體參加，膜載體發(fā)生構(gòu)型變化,被運(yùn)送物質(zhì)不發(fā)生任何變化。通過(guò)這種方式運(yùn)輸方式吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有糖類（乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等）、氨基酸、核苷、鉀離子等。5/11/2024138三、吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的方式4.基團(tuán)移位基團(tuán)轉(zhuǎn)位主要存在于厭氧型和兼性厭氧型細(xì)菌中，主要用于糖的運(yùn)輸。脂肪酸、核苷、堿基等也可通過(guò)這種方式運(yùn)輸。有一個(gè)復(fù)雜的運(yùn)輸系統(tǒng)來(lái)完成物質(zhì)的運(yùn)輸；需要載體，又要耗能；物質(zhì)在運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)生化學(xué)結(jié)構(gòu)變化；5/11/2024139三、吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的方式

運(yùn)輸方式濃度方向載體蛋白動(dòng)力運(yùn)送分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被動(dòng)擴(kuò)散高→低無(wú)無(wú)不變水、脂肪酸促進(jìn)擴(kuò)散高→低載體無(wú)不變氨基酸、單糖主動(dòng)運(yùn)轉(zhuǎn)低→高載體

能量不變離子、糖類、氨基酸基團(tuán)移位低→高載體能量改變糖類、脂肪酸、核苷營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸方式比較5/11/20241405/11/2024142細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖多數(shù)細(xì)菌：pH7.2-7.6。偏酸性菌：pH6.0-6.8。如結(jié)核桿菌PH為6.5-6.8；偏堿性菌：pH8-11。如霍亂弧菌PH值為8.5-9.2。一、細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖的條件1.營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)2.酸堿度5/11/2024143溫度對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)速度影響最大，致病菌一般37℃，過(guò)高殺菌，過(guò)低抑菌。嗜冷菌：－5℃-30℃，海洋細(xì)菌、鼠疫桿菌（30℃）；嗜溫菌：10℃-50℃，最適30℃-37℃；嗜熱菌：25℃-80℃極端嗜熱菌。

3.溫度5/11/2024144一、細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖的條件4.氣體

CO2:少數(shù)細(xì)菌初次分離培養(yǎng)需5-10%CO2。O2:代謝時(shí)對(duì)氧分子的需求程度不同分為：需氧菌：僅在有氧時(shí)生長(zhǎng)，如結(jié)核桿菌。微需氧菌：低氧分壓時(shí)長(zhǎng)勢(shì)良好，如:幽門(mén)螺旋桿菌。厭氧菌：一般不需要O2，O2存在也影響不大，如：乳酸菌。兼性厭氧菌：兼有需氧呼吸和無(wú)氧發(fā)酵兩種功能，大多數(shù)病原菌都屬此類。專性厭氧菌：O2對(duì)其生長(zhǎng)有毒害作用，如：破傷風(fēng)梭菌。5/11/2024145一、細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖的條件二、細(xì)菌的繁殖方式多數(shù)細(xì)菌以簡(jiǎn)單的二分裂方式進(jìn)行無(wú)性繁殖。繁殖一代所需時(shí)間約20~30min；但少數(shù)細(xì)菌代時(shí)較長(zhǎng)，如:結(jié)核分枝桿菌代時(shí)為18h~24h。

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