第九章金免疫技術(shù)

1第九章

金免疫技術(shù)

2免疫技術(shù)試劑標(biāo)本AgAbAbAg3標(biāo)記免疫技術(shù)試劑標(biāo)本Ag*AbAb*Ag放射性核素?zé)晒馑孛富瘜W(xué)發(fā)光劑膠體金標(biāo)記物技術(shù)放射性核素放射免疫技術(shù)熒光素?zé)晒饷庖呒夹g(shù)酶酶免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光劑化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)膠體金金免疫技術(shù)4金免疫測定技術(shù)

金免疫組織化學(xué)染色技術(shù)

金免疫技術(shù)斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)金免疫光鏡染色技術(shù)金免疫電鏡染色技術(shù)5

金溶膠標(biāo)記蛋白質(zhì)，膠體金顆粒具有高電子密度的特性，故在金標(biāo)蛋白的抗原抗體結(jié)合處，顯微鏡下可見黑褐色顆粒；當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的標(biāo)記處大量聚集時(shí)，可在載體膜上呈現(xiàn)肉眼可見紅色或粉紅色斑點(diǎn)(線)，從而用于抗原或抗體物質(zhì)的定位或定性。67制備膠體金制備免疫金建立金免疫測定技術(shù)8

膠體金的特性膠體金（金溶膠）：是由金鹽被還原成原子金后形成的金顆粒懸液。膠體金的特性膠體性質(zhì)：穩(wěn)定性、對電解質(zhì)的敏感性光吸收性：膠體金的光吸收峰波長隨顆粒的大小而變化。呈色性：不同大小的膠體金呈現(xiàn)不同的顏色小顆粒--橙黃色中等顆粒—酒紅色較大顆?！罴t色大顆粒—紫色9膠體性質(zhì)穩(wěn)定性：穩(wěn)定地、均勻地、呈單一分散狀態(tài)懸浮于液體中10膠體金的制備化學(xué)還原法:向一定濃度的金溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子變成金原子,形成金顆粒懸液。還原材料：氯金酸（HAuCl4)還原劑：檸檬酸鹽、白磷、過氧化氫、抗壞血酸。。。。最常用的制備方法：檸檬酸鹽還原法通過改變檸檬酸鈉的用量可制得不同大小的膠體金顆粒

111％檸檬酸三鈉加入量（ml）*膠體金特性λmax

呈色

162.00

橙色518nm24.51.50

橙紅522nm411.00

紅色525nm71.50.70

紫色535nm膠體金粒徑（nm）12制備膠體金的注意事項(xiàng)（1）玻璃容器必須是最好是經(jīng)硅化處理的。（2）氯金酸對金屬有強(qiáng)烈的腐蝕性（3）氯金酸易潮解（4）制備膠體金應(yīng)用或者是高質(zhì)量的去離子水。，不應(yīng)使用金屬藥匙稱量氯金酸。雙蒸/三蒸餾水，絕對清潔的，，應(yīng)干燥、避光保存。13膠體金的鑒定和保存鑒定

1、清亮透明

2、金顆粒的大小通過觀察膠體金的顏色，粗略估計(jì)金顆粒的大?。环止夤舛扔?jì)掃描λmax來估計(jì)金顆粒的粒徑電鏡觀察保存保存于潔凈的玻璃器皿中，室溫或4°C，加入少許防腐劑（如0.02％NaN3）可有利于保存。14免疫金的特性

膠體金可以和蛋白質(zhì)等各種大分子物質(zhì)結(jié)合，在免疫組織化學(xué)技術(shù)中，習(xí)慣上將膠體金結(jié)合蛋白質(zhì)的復(fù)合物稱為金探針。用于免疫測定時(shí)膠體金多與免疫活性物質(zhì)（抗原或抗體）結(jié)合，這類膠體金結(jié)合物常稱為免疫金復(fù)合物，或簡稱免疫金（immunogold）。物理吸附性：

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++++膠體金蛋白質(zhì)15免疫金的制備制備要點(diǎn)PH值的調(diào)整：原則上可選擇待標(biāo)記蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，也可略為偏堿蛋白質(zhì)最適標(biāo)記量的確定標(biāo)記過程離心純化：超速離心法免疫金最終用稀釋液配成工作濃度保存：穩(wěn)定劑-PEG，BSA16待標(biāo)記蛋白作系列稀釋+定量膠體金+Nacl最適標(biāo)記量：能保持紅色不變而蛋白含量最低的一管蛋白量逐漸減低對照管17金免疫測定技術(shù)固相載體：硝酸纖維素膜結(jié)合物：免疫金斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)（dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA），又稱為滴金免疫測定法斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)

（dotimmunogoldchromatographicassay,DICA）

18斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)

（dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA)

操作示意圖裝置分解圖蓋微孔膜吸水墊料底加標(biāo)本免疫金洗滌液19技術(shù)類型：夾心法、間接法

雙抗體夾心法20

間接法

21滴金法的質(zhì)控雙抗體夾心法：相應(yīng)抗原間接法：反應(yīng)斑點(diǎn)質(zhì)控點(diǎn)人IgG22反應(yīng)線質(zhì)控線陽性陰性23斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)（dotimmunogoldchromatographicassay,DICA)GTC24

夾心法

競爭法

間接法（了解）斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)（dotimmunogoldchromatographicassay,DICA)雙抗原夾心法雙抗體夾心法25雙抗體夾心法G區(qū)：金標(biāo)特異性抗體(兔型)C區(qū)：羊抗兔IgT區(qū)：特異性抗體

吸水紙標(biāo)本26競爭法標(biāo)本G區(qū)：金標(biāo)特異性抗體(兔型)C區(qū)：羊抗兔IgT區(qū)：標(biāo)準(zhǔn)抗原

吸水紙陽性結(jié)果27標(biāo)本G區(qū)：金標(biāo)特異性抗體(兔型)C區(qū)：羊抗兔IgT區(qū)：標(biāo)準(zhǔn)抗原

吸水紙陰性結(jié)果2829DIGFA與DICA的比較DIGFA（穿透濾過型）DICA（橫向流動型）硝酸纖維素膜的種類圓片膜窄長型膜試劑形式滲濾裝置及2瓶液體試劑（液相形式）單一試劑條(板)（固相形式）試劑保存4-8℃6個(gè)月室溫1年操作步驟3-51觀察時(shí)間操作結(jié)束(約3min)即刻觀察操作結(jié)束后等待3-20min陽性反應(yīng)顏色操作結(jié)束后顏色不變顏色逐漸加深30金標(biāo)法的優(yōu)勢

示蹤劑：以膠體金為指示劑，本身形成免疫分析過程后的顏色標(biāo)記符號顯示結(jié)果自帶質(zhì)控對照快速：全部檢測過程僅需3-20分鐘。簡便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用可單份檢測穩(wěn)定性好31

金標(biāo)法的劣勢靈敏度不如酶標(biāo)技術(shù)一般作為定性，不易定量。金標(biāo)法在臨床中的應(yīng)用實(shí)例1：HBsAb的檢測實(shí)例2：HCG的檢測32金免疫組織化學(xué)技術(shù)一、免疫金（銀）光鏡染色技術(shù)二、免疫金電鏡染色技術(shù)三、評價(jià)與應(yīng)用：在電鏡水平的應(yīng)用：樣本用量少、檢測速度快、操作簡單、敏感性特異性高在光鏡水平的應(yīng)用：敏感性提高，可以替代熒光免疫技術(shù)；33

免疫金銀染色原理示意圖

3435HBsAb診斷試劑試劑盒參考圖示36操作步驟1：洗凈雙手

步驟2：用采血針采指尖血

步驟3：將1滴指尖血滴入加樣孔，或者用吸管將1滴指尖血滴入加樣孔37