《食品微生物檢驗技術(shù)》課件-幾種常用的細(xì)菌染色法

幾種常用的細(xì)菌染色法目錄/Contents1簡單染色法革蘭氏染色法芽孢染色法染色2345莢膜染色法鞭毛染色法01簡單染色法常用堿性染料進(jìn)行簡單染色原理

在中性、堿性或弱堿性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷，而堿性染料在電離時，其分子的染色部分帶正電荷（酸性染料電離時，其分子的染色部分帶正電荷），因此堿性染料的染色部分很容易與細(xì)菌結(jié)合使細(xì)菌著色，經(jīng)染色后的細(xì)菌細(xì)胞與背景形成鮮明的對比，在顯微鏡下易于識別。常用作簡單染色的染料有：美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅等。01簡單染色法1.簡單染色法步驟：

01簡單染色法（1）涂片

取干凈的載玻片一塊，滴一小滴生理鹽水于載玻片中央,嚴(yán)格按無菌操作程序,挑取大腸桿菌或金黃色葡萄球菌于載玻片的水滴中,調(diào)勻并涂成薄膜。01簡單染色法（2）晾干

讓涂片自然晾干或者在酒精燈火焰上方以文火烘干。（3）固定

手執(zhí)玻片一端,讓菌膜朝上,通過火焰2～3次固定（以不燙手為宜）。（4）染色

將固定過的涂片放在擱架上,加復(fù)紅或結(jié)晶紫染色1～2min。（5）水洗

染色時間到后,用自來水沖洗,直至沖下之水無色時為止。注意沖洗水流不宜過急,過大,水由玻片上端流下,避免直接沖在涂片處。（6）干燥

將洗過的涂片放在空氣中晾干或用吸水紙吸干。（7）鏡檢

先低倍鏡觀察,再高倍鏡觀察,并找出適當(dāng)?shù)囊曇昂?將高倍鏡轉(zhuǎn)出,在涂片上加香柏油一滴,將油鏡頭浸入油滴中仔細(xì)調(diào)焦觀察細(xì)菌的形態(tài)。02革蘭氏染色法革蘭氏染色步驟：涂片→干燥→固定→結(jié)晶紫染色→水洗→吸干→95%酒精脫色→水洗→吸干→蕃紅復(fù)染→水洗→干燥→鏡檢。（1）涂片

涂片方法與簡單染色涂片相同。（2）晾干

與簡單染色法相同。（3）固定

與簡單染色法相同（4）結(jié)晶紫染色

將玻片置于玻片擱架上，加適量（以蓋滿細(xì)菌涂面）的結(jié)晶紫染色液染色1min。02革蘭氏染色法（5）水洗傾去染色液,用水小心地沖洗。（6）媒染滴加革蘭氏碘液,媒染1min。（7）水洗用水洗去碘液。（8）脫色將玻片傾斜,連續(xù)滴加95%乙醇脫色20～30s至流出液無色,立即水洗。（9）復(fù)染滴加蕃紅復(fù)染1～2min。02革蘭氏染色法（10）水洗用水洗去涂片上的蕃紅染色液。（11）晾干將染好的涂片放空氣中晾干或用吸水紙吸干。（12）鏡檢鏡檢時先用低倍鏡,再用高倍鏡,最后用油鏡觀察,并判斷菌體的革蘭氏染色反應(yīng)性。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。以分散開的細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)，過于密集的細(xì)菌，常常呈假陽性。03芽胞染色法芽孢染色步驟：涂片→固定→孔雀綠染色→水洗→干燥→觀察。（1）將有芽胞的材料作涂片、干燥、固定。（2）將5％孔雀綠水溶液滴加于固定好的涂片上。用木夾夾住載玻片在酒精燈火焰上加熱，使染料冒蒸汽（但不能煮沸），切勿使染料蒸干，必要時可添加少許染料。加熱時間從冒蒸汽時開始計算約4～5min。03芽胞染色法芽孢染色步驟：涂片→固定→孔雀綠染色→水洗→干燥→觀察。（3）傾去染色液，待玻片冷卻后水洗至孔雀綠不再退色為止。（4）用0.5％沙黃水溶液復(fù)染1min，水洗。（5）干燥或烘干后，置油鏡觀察，芽胞呈綠色，菌體呈紅色。04莢膜染色法莢膜染色液：繪圖墨水，1％甲基紫水溶液，1％結(jié)晶紫水溶液，6％葡萄糖水溶液，20％硫酸銅水溶液，純甲醇等。(1)濕墨水法①制備菌和墨水混合液加一滴水于潔凈的載玻片上，然后挑取少量菌體與其混合均勻。04莢膜染色法莢膜染色液：繪圖墨水，1％甲基紫水溶液，1％結(jié)晶紫水溶液，6％葡萄糖水溶液，20％硫酸銅水溶液，純甲醇等。②加蓋玻片將一潔凈的蓋玻片蓋在混合液上，然后在蓋玻片上放一張濾紙，輕輕按壓以吸去多余的混合液。③鏡檢用低倍鏡和高倍鏡觀察，若用相差顯微鏡觀察，效果更好。背景灰色，菌體較暗，在菌體周圍呈現(xiàn)明亮的透明圈即為莢膜。05鞭毛染色法（1）硝酸銀染色法①菌種的準(zhǔn)備要求用活躍生長期菌種作鞭毛染色。對于冰箱保存的菌種，通常要連續(xù)移種1-2次。良好的培養(yǎng)物，是鞭毛染色成功的基本條件，不宜用已形成芽孢或衰亡期培養(yǎng)物作鞭毛染色的菌種材料，因為老齡細(xì)菌鞭毛容易脫落。②載玻片的準(zhǔn)備將載玻片在含適量洗衣粉的水中煮約20min，取出用清水充分洗凈，瀝干后置95％乙醇中，用時取出在火焰上燒去酒精及可能殘留的油跡。05鞭毛染色法7.鞭毛染色法（1）硝酸銀染色法③菌液的制備取斜面或平板菌種培養(yǎng)物數(shù)環(huán)于盛有1~2mL無菌水的試管中，制成輕度混濁的菌懸液用于制片。也可用培養(yǎng)物直接制片，但效果往往不如先制備菌液。④制片取一滴菌液于載玻片上的一端，然后將玻片傾斜，使菌液緩緩流向另一端，用吸水紙吸去玻片下端多余菌液，室溫（或37℃）自然干燥。05鞭毛染色法7.鞭毛染色法（1）硝酸銀染色法⑤染色涂片干燥后，滴加硝酸銀染色A液覆蓋3～5min，用蒸餾水充分洗去A液。用B液沖去殘水后，再加B液覆蓋涂片染色約數(shù)秒至1min，當(dāng)涂面出現(xiàn)明顯褐色時，立即用蒸餾水沖洗。若加B液后顯色較慢，可用微