全血膽堿酯酶（CHE）活力測(cè)定

全血膽堿酯酶（CHE）活力測(cè)定中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院824辦公室馮玉超

有機(jī)磷酸酯農(nóng)藥是我國(guó)目前生產(chǎn)和使用最多的一類農(nóng)藥。

對(duì)硫磷、內(nèi)吸磷、馬拉硫磷、樂果、敵百蟲及敵敵畏Q:有機(jī)磷中毒機(jī)制及臨床表現(xiàn)？有機(jī)磷中毒機(jī)制及臨床表現(xiàn)抑制體內(nèi)膽堿酯酶（ChE）活性乙酰膽堿膽堿酯酶有機(jī)磷農(nóng)藥2、煙堿樣癥狀（N受體）1、毒蕈堿樣癥狀（M受體）3、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀頭暈、乏力、意識(shí)障礙腺體分泌亢進(jìn)：多汗、口鼻分泌物增多平滑肌痙攣：呼吸困難、惡心嘔吐、腹瀉瞳孔縮小血壓升高、心動(dòng)過速運(yùn)動(dòng)神經(jīng)興奮：肌肉震顫、痙攣、無力觀察小鼠染毒后10min的表現(xiàn)

乙酰膽堿酯酶，主要分布于神經(jīng)系統(tǒng)及紅細(xì)胞表面，具有水解乙酰膽堿的特殊功能。全血或紅細(xì)胞膽堿酯酶活力測(cè)定是有機(jī)磷農(nóng)藥急性中毒分級(jí)和慢性中毒的診斷指標(biāo)。

全血膽堿酶活性范圍：（GBZ8-2002)接觸反應(yīng)：全血或紅細(xì)胞膽堿酯酶活力<70%,無明顯臨床癥狀；

或全血或紅細(xì)胞膽堿酯酶活力>70%，有輕度毒蕈堿樣

自主神經(jīng)癥狀或中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。有機(jī)磷農(nóng)藥急性中毒的分級(jí)診斷標(biāo)準(zhǔn)急性輕度中毒50%~70%急性中度中毒30%~50%急性重度中毒<30%結(jié)合相應(yīng)臨床癥狀一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、加深對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥中毒機(jī)制的理解。1、掌握全血膽堿酯酶活力的測(cè)定原理及方法。2、了解膽堿酯酶活性測(cè)定在職業(yè)有機(jī)磷中毒診斷中的意義及應(yīng)用。二、實(shí)驗(yàn)原理

乙酰膽堿膽堿酯酶膽堿乙酸堿性羥胺乙酰羥胺羥肟酸鐵（棕紅色絡(luò)合物）FeCl3HCl吸光度值越大，血液中剩余乙酰膽堿的量越多，膽堿酯酶活性越低實(shí)驗(yàn)試劑及器材

試劑：0.5mg/ml敵敵畏溶液、肝素鈉溶液、蒸餾水、

膽堿酯酶活性測(cè)定試劑盒器材：分光光度計(jì)、水浴鍋、離心機(jī)、微量移液器、1ml注射器、剪刀、1.5mlEP管、15毫升離心管

試劑瓶三、實(shí)驗(yàn)步驟和方法

1、染毒及血樣的采集和制備2、實(shí)驗(yàn)試劑的配置3、反應(yīng)體系的配置4、樣品的檢測(cè)5、結(jié)果的分析

1、染毒及血樣的采集和制備實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：小鼠

毒物：敵敵畏染毒劑量：0.1ml/10g

敵敵畏溶液染毒方式：腹腔注射染毒時(shí)間：10分鐘

血樣的采集和制備①尾靜脈采血

輕彈小鼠尾巴，酒精棉球消毒，剪尾0.5cm,向尾末端擠壓。②采血時(shí)間：染毒前后各采血一次，按下述方法制備血樣標(biāo)本（取血---染毒---取血）保證染毒前后采血量一致（4滴），采完止血。③血樣標(biāo)本制備：先用肝素鈉潤(rùn)洗EP管，取25ul的肝素鈉溶液置于1.5mlEP管管口，①獲得的血與肝素鈉溶液混勻，以獲得50ul的血、肝素鈉混勻液；取50ul血、肝素鈉混勻液與200ul的冷卻蒸餾水混勻，室溫靜置15分鐘，待血液澄清透亮，以備用。

2、實(shí)驗(yàn)試劑的配制按照膽堿酯酶活性測(cè)定試劑盒說明配置以下溶液：①8μmol/ml乙酰膽堿應(yīng)用液；乙酰膽堿粉劑（-20℃，離心）加入到試劑二稀釋液，混勻后所得混合液與試劑一按1:9的比例配。（3ml混合液+27ml試劑一）

②堿性羥胺（試劑三應(yīng)用液)；試劑三乙液加入到試劑三甲粉劑，混勻后所得試劑與試劑三丙液按1:1配成。

（10ml甲乙混合液+10ml丙液）③FeCl3

溶液（試劑六）；試劑六溶液直接加入到試劑六粉劑。注：上述應(yīng)用液均需現(xiàn)配現(xiàn)用，試劑一、試劑四、試劑五不用配。

測(cè)定管對(duì)照管空白管待測(cè)樣本（ml)（膽堿酯酶）0.1--蒸餾水（ml）--0.358umol/ml乙酰膽堿應(yīng)用液（ml)0.250.25-試劑一（ml）（磷酸鹽緩沖液）0.50.50.5混勻，37℃水浴20分鐘試劑三應(yīng)用液（ml）（堿性羥胺）1.01.01.0試劑四（ml）0.50.50.5試劑五（ml）（鹽酸）0.250.250.25試劑六（ml）（FeCl3)0.50.50.5待測(cè)樣本（ml）-0.1-準(zhǔn)備5個(gè)15ml離心管染毒前：測(cè)定管、對(duì)照管染毒后：測(cè)定管、對(duì)照管空白管3、反應(yīng)體系的配制膽堿酯酶水解乙酰膽堿剩余乙酰膽堿與羥胺及鐵離子反應(yīng)

4.樣品的檢測(cè)1.將上述反應(yīng)溶液混勻，3000~3500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘；（棕紅色的上清溶液）2.分光光度計(jì)用空白管調(diào)零，取上清，于520nm測(cè)各管吸光度值。

5.結(jié)果的計(jì)算和分析計(jì)算全血膽堿酯酶活力膽堿酯酶活力：每毫升全血在37℃和底物作用20分鐘，

分解1μmol乙酰膽堿為一個(gè)活性單位。計(jì)算CHE活力相對(duì)值d=染毒后CHE活力/染毒前CHE活力根據(jù)膽堿酯酶活力相對(duì)值對(duì)模型中毒情況進(jìn)行評(píng)價(jià)

四、注意事項(xiàng)

正確完成腹腔注射及尾靜脈取血的基本操作，以保證獲得足夠的樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；取出的血滴應(yīng)及時(shí)與肝素鈉溶液混勻，避免血液凝塊的形成；血樣標(biāo)本制備完成后（血液澄清透亮），應(yīng)立即與乙酰膽堿反應(yīng)，防止膽堿酯酶的失活；配制反應(yīng)體系時(shí)注意嚴(yán)格按照順序加入各試劑；正確使用分光光度儀進(jìn)行結(jié)果的檢測(cè)（加三氯化鐵顯色后，在20min內(nèi)比色，調(diào)零、上清、比色皿）；注意實(shí)驗(yàn)室安全，自身物品遠(yuǎn)離實(shí)驗(yàn)臺(tái)，防止敵敵畏的誤食、吸入或污染皮膚；實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康募耙饬x2、實(shí)驗(yàn)方法：簡(jiǎn)單敘述操作步驟3、結(jié)果分析a.計(jì)算染毒前后全血CHE的活力及其比值；b.根據(jù)GBZ8-2002診斷標(biāo)準(zhǔn)，初步診斷該模型有機(jī)磷農(nóng)藥中毒的情況；c.分析影響實(shí)驗(yàn)成敗的因素。實(shí)驗(yàn)流程稱重采血血樣制備配置反應(yīng)體系