植物生理學實驗

試驗一：植物組織滲透勢的測定（質(zhì)壁分別法）

試驗?zāi)康?/p>

觀看植物組織在不同濃度溶液中細胞質(zhì)壁分別的產(chǎn)生過程，了解其用于測定

植物組織滲透勢的原理與方法。

試驗基本原理

當植物組織細胞內(nèi)的汁液與其四周的某種溶液處于滲透平衡狀態(tài)，植物細胞

內(nèi)的壓力勢為零時，細胞汁液的滲透勢就等于該溶液的滲透勢。這種滲透勢相等

的溶液稱為等滲溶液。該溶液的濃度稱為等滲濃度。

當用一系列梯度濃度溶液觀看細胞質(zhì)壁分別現(xiàn)象時，細胞的等滲濃度將介于

剛剛引起初始質(zhì)壁分別的最低濃度和尚不能引起質(zhì)壁分別的最高濃度之間的溶

液濃度。代入公式即可計算出其滲透勢。

試驗用品

1.材料：洋蔥鱗莖

2.器材和儀器：顯微鏡、載玻片及蓋玻片、鏡子、刀片

3.試劑：100mL濃度lmol/L蔗糖溶液

用蒸儲水配置0.10,0.15,0.20,0.25,0.30,0.35,0.40,0.45,0.50mol/L蔗糖梯度

溶液各5-10mL

方法步驟

1、取帶洋蔥鱗莖下表皮（用單面刀片劃約5mm*5mm方塊用鏡子將其取下），

快速分別投入各種濃度的蔗糖溶液中使其完全浸入，約10mine

2、從0.50mol/L蔗糖溶液開頭依次取出表皮薄片放在滴有同樣溶液的載玻片上,

蓋上蓋玻片，于10倍顯微鏡下觀看，假如全部細胞都產(chǎn)生質(zhì)壁分別的現(xiàn)象，

則取低濃度溶液中的制片做同樣觀看，并紀錄質(zhì)壁分別的相對程度。

3、確定引起半數(shù)以上細胞原生質(zhì)剛剛從細胞壁的角隅上分別的濃度，和不引起

質(zhì)壁分別的最高濃度。

4、在找到上述濃度極限時，用新的溶液和新奇的葉片重復進行幾次，直至把握

精確為止。在此條件下，細胞的滲透勢與兩個極限溶液濃度之平

均值的滲透勢相等。

5、將結(jié)果紀錄到下表1-1中。

?測出引起質(zhì)壁分別剛開頭的蔗糖溶液最低濃度和不引起質(zhì)壁分別的最高

濃度平均值之后，代入下列公式，-巾s=H77CV計算在常壓下該組織細胞

質(zhì)液的滲透勢。

,其中：-6s為細胞滲透勢；

?A為氣體常數(shù)=0.083*105L-Pa/mol-K；

?T為熱力學溫度，單位K；即273+t,t為試驗溫度，單位是C；

?i為解離系數(shù)，蔗糖為1;

?C/為等滲溶液的質(zhì)量摩爾濃度，單位是mol/kg

?貝U-6s=0.083*105*（273+/）*1*或

?由于試驗用的蔗糖溶液濃度單位為mol/L,要經(jīng)過下式進行換算

?質(zhì)量摩爾濃度=------

?其中：C2為溶質(zhì)分子的物質(zhì)的量濃度（mol/L）,即等滲的蔗糖濃度;

?O為蔗糖溶液的密度，單位是g/ml；

?MB為蔗糖的摩爾質(zhì)量，即342.3g/mol。

留意事項

?1、撕下的表皮組織必需完全浸沒在溶液里

思索題

如何提高質(zhì)壁分別法測定植物組織滲透勢試驗的精確性

試驗二葉綠體色素的提取、分別及理化性質(zhì)的鑒定

目的要求

?初步把握提取葉綠體色素的正確方法，理解分別葉綠體色素的原理。

?了解葉綠體色素的光學特性在光合作用中的意義。

試驗基本原理

?植物所呈現(xiàn)的顏色主要是由脂溶性的葉綠體色素和水溶性的細胞液色素

（主要是花青素）所致。花青素普遍存在于花卉中，其色澤隨細胞液中酸

堿度不同而轉(zhuǎn)變，植物色素在植物中分布廣泛。葉綠體色素是植物汲取太

陽光能進行光合作用的重要物質(zhì)，主要由葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素

和葉黃素組成，它們與類囊體膜蛋白結(jié)合成色素蛋白復合體而存在。

?依據(jù)它們在有機溶劑中的溶解特性，可用丙酮、乙醇等有機溶劑將它們從

葉片中提取出來。由于它們在不同有機溶劑中的溶解度不同以及在吸附劑

上的吸附力量不同，當用適當?shù)娜軇┩苿訒r，混合物中各種成分在兩相（固

定相和流淌相）間具有不同的安排系數(shù)，所以移動速度不同，經(jīng)過肯定時

間后，可將各種色素分開。

?花色素昔分布廣，溶解于細胞液中，與花、果、葉的顏色有關(guān)。

?顏色受多因素影響：

1B環(huán)上羥基和甲氧基數(shù)目

羥基數(shù)多，汲取光向長波遷移，顏色偏藍

羥基被甲氧基替代，汲取光向短波遷移，顏色偏紅

2芳香酸對主要骨架的酯化

a）液泡中pH值酸紅堿藍

b）養(yǎng)分狀況低溫、缺氮、缺磷促進化色素的形成和積累

3葉綠素的化學性質(zhì)很不穩(wěn)定，簡潔受強光的破壞，特殊是葉綠素與

蛋白質(zhì)分別后，破壞更快；葉綠素中的鎂可被H+取代而生成褐色

的去鎂葉綠素；加入銅鹽作用，后者則成為綠色的銅代葉綠素，銅

代葉綠素很穩(wěn)定，在光下不易破壞。

試驗用品

?1.材料：植物葉片

?2.器材和儀器：大試管、天平、研缽、量筒、移液管、燒杯、漏斗、毛

細管、剪刀、滴管、濾紙。

?3.試劑：丙酮、醋酸銅、6N鹽酸、30%氫氧化鉀甲醇溶液、石英砂、

碳酸鈣、四氯化碳、乙醛。

方法步驟

1.葉綠體色素的提取和分別

?稱取新奇葉片2克，放入研缽中加丙酮5毫升（分批，即少量多次），少

許石英砂，研成勻漿，再加丙酮10毫升，以漏斗過濾（最好用脫脂棉）

即為色素提取液。定量至20mL,放于暗處備用。

?把展層用的濾紙剪成2cmX10cm的紙條，將一端剪去兩側(cè)，中間留一長

約1.5cm的窄條。

?用毛細管吸取葉綠素溶液點于窄條的上方，留意一次所點溶液不易過多，

風干后再點，這樣重復點幾次，使展層效果好一些。

?在大試管（染色缸）中加四氯化碳3-5ml及少許無水硫酸鈉。將濾紙條

固定在軟木塞（玻璃蓋）上，插入試管內(nèi)，使窄條浸入溶劑中（色素點要

略高于液面，濾紙條邊緣不行遇到試管壁），直立于陰暗處進行層析。待

溶劑前沿達濾紙條上沿0.5-1.0cm時，取出濾紙條，馬上用鉛筆在溶劑前

沿劃線作記號。最前端橙黃色的是胡蘿卜素，其次黃色為葉黃素，再下面

藍綠色為葉綠素a,最終的黃綠色為葉綠素b。

2.葉綠體色素的理化性質(zhì)

?葉綠素的熒光現(xiàn)象：

?取上述色素丙酮提取液少許于試管中，分別觀看在反射光和透射光一側(cè)，

提取液的顏色有無不同。

?光對葉綠素的破壞作用：

?取上述色素丙酮提取液少許分裝于2支試管中，1支試管放在黑暗處（或

用黑紙包裹），另一支試管放在強光下，經(jīng)2-3小時后，觀看兩支試管中

溶液顏色有何不同。

,銅代反應(yīng)：

?取上述色素丙酮提取液少許于試管中，一滴一滴加濃鹽酸，直至溶液消

失褐綠色，此時葉綠素分子已破壞，形成去鎂葉綠素。然后加醋酸銅晶體

少許，漸漸加熱溶液，則又產(chǎn)生鮮亮的綠色，此即形成銅代葉綠素。

?黃色素與綠色素的分別（皂化反應(yīng)）

?取上述色素丙酮提取液10mL,加到盛有20mL乙醛的分液漏斗中，搖動

分液漏斗，并沿漏斗邊緣加入30mL蒸儲水，輕輕搖動分液漏斗，靜止片

亥U，溶液即分為兩層。色素已全部轉(zhuǎn)入上層乙醛中，棄去下層丙酮和水，

再用蒸儲水沖洗乙醛層1-2次。然后于色素乙醛溶液中加入5mL30%KOH

甲醇溶液（皂化反應(yīng)），用力搖動分液漏斗，靜止lOmin,再加蒸儲水約

10mL,搖動后靜止分別，則得到黃色素層和綠色色素層，分別保存于試

管中。

試驗結(jié)果

?1.在層析紙上標出各個條帶分別是什么色素。

?2.紀錄葉綠素在反射光和透射光下的顏色

?3.紀錄光對葉綠素的破壞作用及銅代反應(yīng)的結(jié)果

,4.紀錄皂化反應(yīng)的結(jié)果

留意事項

?1.為了避開葉綠素的光分解，操作應(yīng)在弱光下進行。

?2.研磨時間盡可能短些，以不超過5分鐘為宜。并將葉片中色素浸提潔

凈。

?丙酮，乙醛等試劑易著火，遠離火源

思索題

1.研磨提取葉綠素時加入CaC03有什么作用？加多了會消失什么問題？

2.葉綠素a、葉綠素b、葉黃素和胡蘿卜素在濾紙上的分別速度不一樣，這

與它們的分子量有關(guān)嗎？

3.銅在葉綠素中取代鎂的作用，有何有用意義？

4葉綠素、熒光素酶以及綠色熒光蛋白都能產(chǎn)生熒光，它們的原理有什么不

同？能量來源有何差異？

5轉(zhuǎn)GFP的植物在檢測綠色熒光時為何沒有看到葉綠素的紅色熒光?若選擇

熒光標記綠色植物細胞,在選擇熒光物質(zhì)時應(yīng)首先考慮什么問題？

6如何推斷呈橙黃色的花和果實中含的是類胡蘿卜素還是花色素？

皂化反應(yīng)

?皂化反應(yīng)是堿催化下的酯水解反應(yīng)，尤指油脂的水解。

?狹義的講，皂化反應(yīng)僅限于油脂與氫氧化鈉混合，得到高級脂肪酸的鈉鹽

和甘油的反應(yīng)（還有部分水）。這個反應(yīng)是制造肥皂流程中的一步，因此而

得名。

取代反應(yīng)：口卜咻環(huán)中的Mg2+可被H2+、Cu2+、Zn2+取代，被Cu2+、Zn2+取代

后仍保持綠色

試驗三葉綠素a、b含量測定

目的要求

?熟識分光光度法測定物質(zhì)濃度的原理

?把握在未經(jīng)分別的葉綠體色素溶液中測定葉綠素a和b的方法及其計算。

基本原理

?依據(jù)葉綠體色素提取液對可見光譜的汲取，采用分光光度計在某一特定波

長測定其吸光度，即可用公式計算出提取液中各色素的含量。

?依據(jù)朗伯一比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質(zhì)濃度C和液層

厚度L成正比，式中：a比例常數(shù)。當溶液濃度以百分濃度

為單位，液層厚度為1cm時，a為該物質(zhì)的吸光系數(shù)

?各種有色物質(zhì)溶液在不同波長下的吸光系數(shù)（a）可通過測定已知濃度

的純物質(zhì)在不同波長下的吸光度而求得。

?假如溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長下的總吸光度等于各

組分在相應(yīng)波長下吸光度的總和。這就是吸光度的加和性。

?欲測定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b的含量，只需測定該提取液

在兩個特定波長下的吸光度A,并依據(jù)葉綠素a、b在該波長下的吸光系

數(shù)即可求出其濃度。

?在測定葉綠素a、b時為了排解類胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長選

擇葉綠素在紅光區(qū)的最大汲取峰。

Arnon公式

?葉綠素a的最大汲取峰在663nm,葉綠素b的最大汲取峰在645nm,汲

取曲線彼此又有重疊。依據(jù)Lambert—Beer定律，最大汲取峰不同的兩個

組分的混合液，它們的濃度C與光密度OD之間有如下關(guān)系：

?Ca=12.7XOD663-2.69XOD645

?Cb=22.9XOD645-4.68XOD663

?CT=Ca+Cb

?其中Ca、Cb和CT分別為葉綠素a的濃度、葉綠素b的濃度和葉綠素的

總濃度，單位為mg/L

試驗用品

?材料：植物葉片

?器材和儀器：722型分光光度計、研缽、剪刀、玻棒、10mL容量瓶、

小漏斗、濾紙、吸水紙、擦鏡紙、滴管、電子天平

?試劑：80%丙酮、石英砂。

方法步驟

?1.色素提取

?取新奇葉片，剪去粗大的葉脈稱取0.5g放于研缽中加2ml丙酮、少許碳

酸鈣和石英砂，研磨成勻漿，加入80%丙酮4mL過濾后，再用4mL80%

丙酮沖洗，并用80%丙酮定容至10mL。

?2.測定吸光值

?取上述色素提取液1mL,加80%丙酮4mL稀釋后轉(zhuǎn)入比色杯中，以80%

丙酮為對比，分別測定663nm、645nm處的吸光值。

?3.計算葉綠素含量

?帶入公式計算葉綠素a、葉綠素b及葉綠素a和b的總濃度。再依據(jù)稀釋

倍數(shù)分別計算每克鮮重葉片中色素的含量。（Ug/gFW）

試驗結(jié)果

,1.紀錄樣品663nm、645nm處的吸光值

?2.計算樣品中葉綠素a、b與總?cè)~綠素濃度

留意事項

?1.為了避開葉綠素的光分解，操作時應(yīng)在弱光下進行，研磨時間應(yīng)盡量

短些。

?2.葉綠體色素提取液不能渾濁?？稍?10或750nm波長下測量吸光

值，其值應(yīng)小于當波長為葉綠素a汲取峰時吸光值的5%,否則應(yīng)重新

過濾。

思索題

?葉綠素a、b在藍光區(qū)也有汲取峰，能否用這一汲取峰波進步行葉綠素

a、b的定量分析？為什么？

?為什么提取葉綠素時干材料肯定要用80%的丙酮，而新奇的材料可以用

無水丙酮提??？

Arnon公式推導

?已知葉綠素a、b的80%丙酮提取液在紅光區(qū)的最大汲取峰分別為663nm

和645nm,又知在波長663nm下，葉綠素a、b在該溶液中的比汲取系數(shù)

分別為82.04和9.27,在波長645nm下分別為16.75和45.60,可依據(jù)加

和性原則列出以下關(guān)系式：

?(1)D663=82.04Ca+9.27Cb

?(2)D645=16.75Ca+45.60Cb

?式(1)、(2)中的D663和D645為葉綠素溶液在波長663nm和645nm時

的光密度，Ca、Cb分別為葉綠素a和b的濃度，以mg/L為單位。解方

程組(1)、(2),得：

?(3)Ca=12.72D663-2.59D645

?(4)Cb=22.88D645-4.67D663

將Ca與Cb相加即得葉綠素總量(CT)：

?(5)CT=Ca+Cb=20.29D645+8.05D663

?在有葉綠素存在的條件下，用分光光度法可同時測定出溶液中類胡蘿卜素

的含量。Lichtenthaler等對Amon法進行了修正，提出了80%丙酮提取

液中三種色素含量的計算公式：

?(7)Ca=12.21D663-2.81D646

?(8)Cb=20.13D646-5.03D663

?(9)Ccar=(1000D470-3.27Ca-104Cb)/229

?式中：Ca、Cb分別為葉綠素a和b的濃度；Ccar為類胡蘿卜素的總濃

度；D663、D646和D470分別為葉綠體色素提取液在波長663nm、646nm

和470nm下的光密度。

由于葉綠體色素在不同溶劑中的汲取光譜有差異，因此，在使用其他溶劑提

取色素時，計算公式也有所不同。葉綠素a、b在96%乙醇中最大汲取峰的波長

分別為665nm和649nm,類胡蘿卜素為470nm,可據(jù)此列出以下關(guān)系式：

?Ca=13.95D665-6.88D649(10)

?Cb=24.96D649-7.32D665(11)

?Ccar=(1000D470-2.05Ca-114.8Cb)/245(12)

試驗四植物組織中可溶性糖含量的測定

目的要求

?把握植物組織中可溶性糖的測定原理與方法。

?了解不同植物組織中可溶性糖含量的變化

基本原理

?植物體內(nèi)的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的單糖和寡聚糖。

?糖在濃硫酸作用下，可經(jīng)脫水反應(yīng)生成糠醛或羥甲基糠醛，生成的糠醛或

羥甲基糠醛可與慈酮反應(yīng)生成藍綠色糠醛衍生物，顏色的深淺與糖的含量

成正比，在625nm波長下的0D值與糖含量成正比，故可用于糖的定量

測定。

?由于慈酮試劑與糖反應(yīng)的顯色強度隨時間變化，故必需在反應(yīng)后馬上在同

一時間內(nèi)比色。該法簡便但沒有專一性，絕大部分的碳水化合物都能與慈

酮試劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色，所以用意酮法測出的碳水化合物含量，實際上是溶

液中全部可溶性碳水化合物總量。

試驗用品

?1.材料：各種植物葉片或種子。

?2.器材和儀器：試驗儀器722s型分光光度計或其它型號、恒溫水浴、

烘箱、電子天平、研缽。

?3.試劑：80%酒精、葡萄糖標準液、K酮試劑。

方法步驟

(1)可溶性糖的提?。?/p>

I植物葉片于110C烘箱烘15分鐘，然后調(diào)至70C過夜。

2稱取磨碎的干葉片50mg(0.05g)倒入試管中,加6ml80%的酒精，置于80℃

水浴中溫浴40分鐘，過濾。濾渣加2mL80%的酒精重復提取兩次，過濾。

3濾液加0.02g活性炭，于80℃水浴中脫色30min,過濾，定容到15mL的容

量瓶中，靜止10min。

(2)顯色及比色：

取0.5mL上清夜，加入4.5mL意酮試劑混合，搖勻，沸水浴煮10分鐘，冷

卻后在625nm處測OD值。從標準曲線上得到提取液中糖的含量。

附注:包菜取上清夜0.1mL,加4.9mL慈酮試劑混合，搖勻.

(3)繪制標準曲線：

取標準葡萄糖溶液0、5、10、20、40、60、80、100ug/mL的不同濃度的

溶液各0.5mL加入4.5mL蔥酮試劑，搖勻，沸水浴煮10分鐘，冷卻后在625nm

處測OD值。

試驗結(jié)果

?1.繪制葡萄糖標準曲線。

?2.計算可溶性糖的含量。

可溶性糖含量(%)=—C-.xlOO%

t^x^xlO

?公式中：

?C——從標準曲線查得葡萄糖濃度，Ug/mLo

?VT——樣品提取液總體積，mLo

?V1——顯色時取樣品液量，mLo

?W——樣品干重(g)o

留意事項

?脫色的時候肯定要混勻，是石炭粉與提取液充分混合。

?惠酮試劑含有濃硫酸，使用時應(yīng)當當心

思索題

?應(yīng)用慈酮比色法測得的糖包括那些類型？

?你知道還有那些方法可以測定可溶性糖類？

苯酚法測定可溶性糖：

【試驗原理】

植物體內(nèi)的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的單糖和寡聚糖。苯酚法測定可

溶性糖的原理是：糖在濃硫酸作用下，脫水生成的糠醛或羥甲基糠醛能與苯酚

縮合成一種橙紅色化合物，在10—100mg范圍內(nèi)其顏色深淺與糖的含量成正

比，且在485nm波長下有最大汲取峰，故可用比色法在此波長下測定。苯酚

法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的測定，方法簡潔，靈敏度高，試驗時基

本不受蛋白質(zhì)存在的影響，并且產(chǎn)生的顏色穩(wěn)定160min以上。

試驗五過氧化物酶活性的測定(分光光度法)

目的要求

?學習和把握比色法測定過氧化物酶(Peroxidase,POD)活性的原理和方

法。

基本原理

?過氧化物酶(Peroxidase,POD),是一族能夠采用H202氧化供氫體的酶。

它對H2O2的需求是特別專一的，而對供氫體的要求則較為廣泛。酚類、

胺類化合物、某些雜環(huán)化合物和一些無機離子等都可以作為過氧化物酶的

供氫體。它們的催化反應(yīng)式為：

?AH2+H202fA+2H2O

?式中AH2,為供氫休，A為氧化型產(chǎn)物，E為過氧化物酶。

?過氧化物酶(E.C.1.11.1.7)是一類氧化還原酶。是由一個糖蛋白和一個

氯正鐵血紅素IX(ProtoheminIX)的鐵嚇啾輔基綴合而成，是一種血紅素

蛋白(hemoprotein)。主要存在于植物細胞的過氧化物酶體中。具有消退

過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用。

?植物體中含有大量過氧化物酶，是活性較高的一種酶。它與呼吸作用、光

合作用及生長素的氧化等都有關(guān)系。

?在植物活性氧愛護系統(tǒng)中，其重要作用的是APX,GPXo

?在植物生長發(fā)育過程中它的活性不斷發(fā)生變化。一般老化組織中活性較

高，幼嫩組織中活性較弱。如：過氧化物酶能使組織中所含的某些碳水化

合物轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素，增加木質(zhì)化程度。

?所以，過氧化物酶可作為組織老化的一種生理指標。

?目前，辣根過氧化物酶、木質(zhì)素過氧化物酶及從多種植物中提取的過氧化

物酶在含酚廢水及含難降解的芳香族化合物廢水、造紙廢水處理中進行廣

泛的應(yīng)用?？山档陀卸居袡C污染物的含量取得很好的效果。

?在本試驗中氫供體是愈創(chuàng)木酚，在過氧化氫存在下，過氧化物酶能使愈創(chuàng)

木酚(鄰甲氧基苯酚)氧化，生成茶褐色物質(zhì)(4-鄰甲氧基苯酚)，該物

質(zhì)在470nm處有最大光汲取，可用分光光度計測量生成物的含量。

試驗用品

?材料：馬鈴薯塊莖或豆芽或其它植物材料。

?器材和儀器：分光光度計、臺式高速冷凍離心機、天平、研缽

?試劑：提取液20mmol/LKH2Po4,反應(yīng)混合液：100mmol/L磷酸緩沖

液(pH6.0)50ml+愈創(chuàng)木酚28uL,于磁力攪拌器上加熱攪拌，直至

愈創(chuàng)木酚溶解，待溶液冷卻后，加入30%過氧化氫19UL,混合勻稱,

保存于冰箱中。

方法步驟

1、稱取馬鈴薯塊莖1g(或2g豆芽)，力口5mL20mmol/LKH2Po4,于研缽中

研磨成勻漿，勻漿液裝于10mL小離心管中，在4℃下以5000g離心10分鐘，

取上清液即為酶的粗提液，用4mL20mmol/LKH2PO4洗滌沉淀，離心合并上

清液,定容至10mLo

2、取光徑1cm比色杯2只，于1只中加入反應(yīng)混合液2.5ml,KH2PO40.5ml,

作為校零對比；另1只中加入反應(yīng)混合液2.5ml,上述酶液0.5ml快速混勻，

于分光光度計上測量3至5分鐘的吸光度值，每隔30秒鐘讀數(shù)一次，讀數(shù)于

波長470nm下進行，以A470值對反應(yīng)時間做POD的反應(yīng)進程曲線。

試驗結(jié)果

?POD酶活性計算：

?以每分鐘吸光度變化值表示酶活性大小，即以△A470/mimgFW表示之。

?也可以用每min內(nèi)A470變化0.01為1個過氧化物酶活性單位

(u)表示。

以每分鐘內(nèi)A470變化0.01為1個過氧化物酶活性單位(u)。

式中：為反應(yīng)時間內(nèi)吸光值的變化；W為所稱樣品重，g；t為反應(yīng)時間，

min；VT為提取酶液總體積，mL。

留意事項

?依據(jù)酶活性大小可測定0~3min或0~5min的OD值，取變化勻稱一段求

平均值計算。

?酶提取過程中留意保持低溫。

思索題

?測定酶的活性要留意掌握那些條件？

?要測定過氧化物酶的活性，除比色法外，你還知道其他什么方法？

試驗六：根系活性的測定（a一蔡胺氧化法）

目的要求

?把握a—蔡胺氧化法測定植物根系活力的原理與方法。

基本原理

?植物根系是活躍的汲取器官和合成器官，根的生長狀況和活力水平直接影

響地上部的生長和養(yǎng)分狀況及產(chǎn)量水平。測定根系活力為植物養(yǎng)分討論供

應(yīng)依據(jù)。

?植物的根系能氧化吸附在根表面的a一蔡胺，生成紅色的a—羥基—1—

蔡胺，沉淀于有氧化力的根表面，使這部分根染成紅色，其反應(yīng)如下：

?根對a—蔡胺的氧化力量與其呼吸強度有親密關(guān)系。有報道認為a—蔡胺

氧化的本質(zhì)就是過氧化物酶的催化作用，該酶的活力愈強，對a—蔡胺的

氧化力也愈強，染色也愈深。所以，可依據(jù)染色深淺定性地推斷根的活力；

?也可測定溶液中未被氧化的a—蔡胺量，以確定根系活力的大小。a—蔡

胺在酸性環(huán)境中與對氨基苯磺酸和亞硝酸鹽作用生成紅色的偶氮染料，可

供比色測定a—蔡胺含量。

試驗用品

?材料：水培或砂培水稻、小麥、玉米，大蒜，洋蔥等植物根系。

?器材和儀器：分光光度計、電子天平、培育箱、三角燒瓶、量筒、移液管、

容量瓶等

?試劑：a—蔡胺溶液（稱10mga—蔡胺，先用2ml左右的95%酒精溶

解，然后加水到200ml,成50Ng/ml的溶液。另取150ml50口g/ml溶

液再加水150ml成25Ug/ml的a—蔡胺溶液），

?O.lmol/L磷酸緩沖液（pH7.0）,1%對氨基苯磺酸（將1g對氨基苯磺酸溶

解于100ml30%的醋酸溶液中），亞硝酸鈉溶液（稱10mg亞硝酸鈉溶于

100ml水中。

方法步驟

1、定性觀看：

用水沖洗根部所附著的砂粒，洗凈后再用濾紙吸去附著在大蒜根上的水分。

然后將植株根系浸入加有50Ug/mL的a—蔡胺溶液與磷酸緩沖液（pH7.0）等量

混合液50mL的三角燒瓶（100mL）中。容器的外面用黑紙包裹，靜置24~36

小時后觀看根系著色狀況。著色深者，其活力較著色淺者為大。

2、定量測定：

1）a—蔡胺的氧化：

1取出培育的植株，并用水洗凈根系上的砂粒，剪下它的根系，再用水洗，待

洗凈后用濾紙吸去根表面的水分，稱取1~2g放在100mL三角燒瓶中。然

后加50ug/mL的a—蔡胺溶液與磷酸緩沖液（pH7.0）等量混合液50mL,

輕輕振蕩，并用玻璃棒將根全部浸入溶液中，靜置10分鐘。

2吸取2mL溶液，測定a—蔡胺含量［測定方法見下面（2）］,用為試驗開頭時的

數(shù)值。

3再將三角燒瓶加塞，放在25℃恒溫箱中，經(jīng)80min后，吸取2mL溶液，再

進行測定a—蔡胺含量。

4此外，還要用一只三角燒瓶置同樣數(shù)量的溶液，但不放根，作為a—蔡胺自

動氧化的空白，也同樣吸取2mL溶液，測定a—蔡胺含量，求它自動氧化

量的數(shù)值。

5每次取樣均為三次重復。

2）a—蔡胺含量的測定：

吸取2mL待測溶液，加入10mL蒸儲水，再在其中加入ImLl%對氨基苯

磺酸溶液和1mL亞硝酸鈉溶液，在室溫中放置5分鐘，待混合液變成紅色,

再用蒸儲水定容到25mL。在20—60分鐘內(nèi)進行比色。選用波長510nm,

讀取吸光度，查對標準曲線得相應(yīng)的a-蔡胺濃度。

3）繪制a一蔡胺標準曲線：

取濃度為50Ug/mL的a-蔡胺溶液，配制成濃度為50、40、30、20、10、5、

Oug/mL的系列溶液，各取2mL放入試管中，加蒸儲水10mL,1mL1%

對氨基苯磺酸溶液，和1mL亞硝酸鈉溶液，在室溫中放置5分鐘，混合液

即變成紅色，再加蒸儲水定容到25mL,在20—60分鐘內(nèi)進行比色，波長

為510nm,讀取吸光度OD,然后以O(shè)D510為縱坐標，a-蔡胺濃度為橫坐

標，繪制標準曲線。

試驗結(jié)果

1.繪制a—蔡胺標準曲線。

2.計算根系活力。

1用試驗開頭（10分鐘）時的a-蔡胺含量減去自動氧化的a-蔡胺量，再減

去試驗結(jié)束時a-蔡胺含量，即得多驗其間為根系所氧化的a一蔡胺量。

2被氧化a-蔡胺量以ug/hgFW表示之。

留意事項

?根系應(yīng)吸干水分但不能用力擠壓傷及細胞，才能測定精確。

思索題

1、測定根系活力有哪些方法？

1）a一蔡胺氧化法

2）甲烯藍吸附法

3）氯化三苯基四氮理（TTC）法

2、植物根系的主要作用？

1）對地上部分起支持和固定作用

2）物質(zhì)的貯存

3）對水分和無機鹽類的汲取

4）合成氨基酸、激素等物質(zhì)

試驗七丙二醛含量測定

目的要求

?熟識植物組織內(nèi)丙二醛（MDA）含量的測定原理與方法

?了解丙二醛積累對細胞的損害

?植物器官年輕或在逆境下患病損害，往往發(fā)生膜脂過氧化作用，丙二醛

（MDA）是膜脂過氧化作用的最終分解產(chǎn)物，其含量可以反映植物患病

逆境損害的程度。

?丙二醛在酸性和高溫條件，可以與硫代巴比妥酸（TBA）反應(yīng)生成紅棕色

的三甲川（3,5,5—三甲基惡嗖2,4-二酮），在532nm處有最大光汲取。

但該反應(yīng)會受到可溶性糖的極大干擾，糖與TBA的反應(yīng)產(chǎn)物在532nm處

也有汲取，但其最大汲取波長在450nm。植物在經(jīng)受逆境脅迫時可溶性

糖增加，因此測定中需排解前者的干擾，通常加入低濃度Fe3+（使其終

濃度為0.5nmol/L,植物組織中鐵的含量一般為100~300ug-g-1-DW）,

以增加TBA與糖的顯色反應(yīng)產(chǎn)物在450nm處的汲取。采納雙組分分光光

度法可分別求出MDA和可溶性糖的含量。

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