固相析出分離法

1、固相析出分離法 藥物化學(xué) 蘇元元 目的：目的： (濃縮；濃縮； (初步純化初步純化 ； (將已純化的將已純化的產(chǎn)品由液態(tài)變成固態(tài)產(chǎn)品由液態(tài)變成固態(tài)，加以保存或進(jìn)一步處理。，加以保存或進(jìn)一步處理。 固相析出法是最古老的分離和純化生物物質(zhì)的方法，但目前固相析出法是最古老的分離和純化生物物質(zhì)的方法，但目前 仍廣泛應(yīng)用在工業(yè)上和實驗室中。仍廣泛應(yīng)用在工業(yè)上和實驗室中。 概述 n固相析出分離法：生化物質(zhì)目的物經(jīng)常作為溶質(zhì) 存在于溶液中，改變?nèi)芤簵l件，使它以固體形式從 溶液中分離的操作技術(shù)。 n 固相析出操作常在發(fā)酵液經(jīng)過過濾和離心（除固相析出操作常在發(fā)酵液經(jīng)過過濾和離心（除 去不溶性雜質(zhì)及細(xì)胞碎片）以后

2、進(jìn)行，得到的沉去不溶性雜質(zhì)及細(xì)胞碎片）以后進(jìn)行，得到的沉 析物可直接干燥制得成品或經(jīng)進(jìn)一步提純，如透析物可直接干燥制得成品或經(jīng)進(jìn)一步提純，如透 析、超濾、層析或結(jié)晶制得高純度生化產(chǎn)品。析、超濾、層析或結(jié)晶制得高純度生化產(chǎn)品。 固相析出法不僅用于實驗室中，因其不需專門設(shè)備，且固相析出法不僅用于實驗室中，因其不需專門設(shè)備，且 易于放大，也廣泛用于生產(chǎn)的制備過程，易于放大，也廣泛用于生產(chǎn)的制備過程， 是分離純化生物大分子，特別是制備蛋白質(zhì)和酶時最常是分離純化生物大分子，特別是制備蛋白質(zhì)和酶時最常 用的方法。用的方法。 鹽析法 有機(jī)溶劑沉淀法 固相析出法 等電點沉淀法 結(jié)晶法 其它多種沉淀法 n結(jié)晶法

3、：析出物為晶體。 n沉淀法：析出物為無定形固體。 固相析出法分類固相析出法分類 n第一節(jié) 鹽析法 n第二節(jié) 有機(jī)溶劑沉淀法 n第三節(jié) 其它沉淀方法 n第四節(jié) 結(jié)晶 第一節(jié) 鹽析法 n一、基本原理 n二、影響因素 n三、鹽析操作 定義：鹽析法是利用各種生物定義：鹽析法是利用各種生物 分子分子在濃鹽溶液中溶解度的在濃鹽溶液中溶解度的 差異差異，通過向溶液中引入一，通過向溶液中引入一 定數(shù)量的中性鹽，使定數(shù)量的中性鹽，使目的物目的物 或或雜蛋白雜蛋白以沉淀以沉淀析出析出，達(dá)到，達(dá)到 純化目的的方法。純化目的的方法。 優(yōu)點：簡單、經(jīng)濟(jì)、較少變性優(yōu)點：簡單、經(jīng)濟(jì)、較少變性 缺點：分辨率不高；沉淀含大缺點

4、：分辨率不高；沉淀含大 量鹽析劑，要除鹽；產(chǎn)生氨量鹽析劑，要除鹽；產(chǎn)生氨 的惡臭的惡臭 7 兩種現(xiàn)象：兩種現(xiàn)象： 鹽溶鹽溶：低鹽情況，：低鹽情況， 鹽離子強(qiáng)度的增鹽離子強(qiáng)度的增 高，蛋白質(zhì)溶解高，蛋白質(zhì)溶解 度增大度增大 鹽析鹽析：高鹽，鹽離：高鹽，鹽離 子強(qiáng)度增加，蛋子強(qiáng)度增加，蛋 白質(zhì)白質(zhì)溶解度減小溶解度減小 8 2021-7-16南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院9 2021-7-16南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院10 一、基本原理一、基本原理 11 鹽析作用（salting out）原理 n破壞雙電層： q在高鹽溶液中，帶大量電荷的鹽離子能中和蛋白質(zhì)

5、 表面的電荷，使蛋白質(zhì)分子之間電排斥作用相互減 弱而能相互聚集起來。 n破壞水化層： q中性鹽的親水性比蛋白質(zhì)大，鹽離子在水中發(fā)生水 化而使蛋白質(zhì)脫去了水化膜，暴露出疏水區(qū)域，由 于疏水區(qū)域的相互作用，使其沉淀。 loglogS S= = - -K Ks s S S蛋白質(zhì)溶解度蛋白質(zhì)溶解度，g/Lg/L； 鹽離子強(qiáng)度鹽離子強(qiáng)度, , C Ci ii i離子濃度，離子濃度，mol/Lmol/L； Z Zi ii i離子化合價；離子化合價； 常數(shù)常數(shù), ,為縱坐標(biāo)上的截距為縱坐標(biāo)上的截距; ; K Ks s鹽析常數(shù)鹽析常數(shù)。 13 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 -0.5 -1.0 -

6、1.5 1 2 3 4 5 6 logS S0 鹽析和鹽析和K KS S鹽析鹽析 右圖示：鹽離子濃度與蛋白質(zhì)溶解度關(guān)系 曲線，在鹽析區(qū)，符合公式 n兩種類型：兩種類型： （1 1）在一定的）在一定的pHpH和溫度下改變離子強(qiáng)度（鹽濃度）和溫度下改變離子強(qiáng)度（鹽濃度） 進(jìn)行鹽析，稱作進(jìn)行鹽析，稱作KsKs鹽析法鹽析法。 由于蛋白質(zhì)對離子強(qiáng)度的變化非常敏感，易產(chǎn)生由于蛋白質(zhì)對離子強(qiáng)度的變化非常敏感，易產(chǎn)生 共沉淀現(xiàn)象，因此常用于提取液的前處理。共沉淀現(xiàn)象，因此常用于提取液的前處理。 （2 2）在一定離子強(qiáng)度下僅改變）在一定離子強(qiáng)度下僅改變pHpH和溫度進(jìn)行鹽析，和溫度進(jìn)行鹽析， 稱作稱作鹽析法鹽析

7、法。 由于溶質(zhì)溶解度變化緩慢，且變化幅度小，因此由于溶質(zhì)溶解度變化緩慢，且變化幅度小，因此 分辨率更高，后期分離（結(jié)晶）分辨率更高，后期分離（結(jié)晶） 14 二、影響鹽析的因素二、影響鹽析的因素 1.無機(jī)鹽的種類 在相同離子強(qiáng)度下，鹽的種類對蛋白質(zhì)溶解度的影響有在相同離子強(qiáng)度下，鹽的種類對蛋白質(zhì)溶解度的影響有 一定差異，一般的規(guī)律為：半徑小的高價離子的鹽析作一定差異，一般的規(guī)律為：半徑小的高價離子的鹽析作 用較強(qiáng)，半徑大的低價離子作用較弱用較強(qiáng)，半徑大的低價離子作用較弱 陰離子鹽析效果陰離子鹽析效果 ： 檸檬酸檸檬酸POPO4 43- 3- SOSO4 42- 2- CHCH3 3COOCOO-

8、 - ClCl- - NONO3 3- -SCNSCN- - 陽離子鹽析效果：陽離子鹽析效果： NHNH4 4+ + K K+ +NaNa+ + 高價陽離子高價陽離子 陰離子的影響大于陽離子陰離子的影響大于陽離子 l鹽析用鹽的選擇 鹽析中常用的鹽：硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉鹽析中常用的鹽：硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉 硫酸銨是最常用的蛋白質(zhì)鹽析沉淀劑硫酸銨是最常用的蛋白質(zhì)鹽析沉淀劑 u（1 1） 價廉價廉 ； u（2 2） 溶解度大，溫度系數(shù)小，許多蛋白質(zhì)可以鹽析出來；溶解度大，溫度系數(shù)小，許多蛋白質(zhì)可以鹽析出來； u（3 3）硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，）硫酸銨分段鹽析效果也比其他

9、鹽好， u（4 4）不易引起蛋白質(zhì)變性。）不易引起蛋白質(zhì)變性。 n缺點： n（1）水解變酸； n（2）高pH 釋氨，腐蝕； n（3）殘留產(chǎn)品有影響。 n不同種類蛋白質(zhì)所需的無機(jī)鹽量不同 n先后加入不同量無機(jī)鹽分級沉淀蛋白質(zhì) 2.溶質(zhì)（蛋白質(zhì)等）種類：Ks、 血 纖 維 蛋 白 原 碳 氧 血 紅 蛋 白 血 清 白 蛋 白 擬 球 蛋 白 碳 氧 肌 紅 蛋 白 0.50 0 -0.50 -1.00 0 2 4 6 8 10 log S 不同蛋白溶解度與離子強(qiáng)度的關(guān)系 鹽析分布曲線鹽析分布曲線 19 n蛋白質(zhì)濃度不同：所需無 機(jī)鹽用量不同 n蛋白質(zhì)濃度高：所需無機(jī) 鹽量少 n制成品：可適當(dāng)高濃

10、度， 但濃度過高，易共沉淀 n重疊蛋白分級：適當(dāng)稀釋， 共沉淀小，但回收率降低。 3.溶質(zhì)（蛋白質(zhì)等）濃度：23% - d d S P 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 40 50 60 70 80 P 30g/L 3g/L 不同濃度碳氧肌紅蛋白的鹽析分布曲線 n無機(jī)或稀鹽溶液：T蛋 白質(zhì)溶解度 n高鹽溶液： T蛋白質(zhì)溶 解度 n蛋白質(zhì)：室溫鹽析 n對溫度敏感的酶， 0C4C 4.溫度： 2 1 0 log S 2 3 4 25 0 pH6.6 溫度對溶解度的影響 5.pH： nPl鹽析 n注意高鹽下pl的偏移： 與負(fù)離子結(jié)合向低 pH偏移，與正離子 結(jié)合向高pH偏移 n利用蛋白質(zhì)

11、pl的不同： 可分級沉淀蛋白質(zhì) 卵清蛋白 碳氧血紅蛋白 7 6 5 4 3 2 1 0 3 4 5 6 7 8 pH 三、鹽析操作三、鹽析操作 1.鹽析用鹽的濃度表示 硫酸銨的加入有以下幾種方法：硫酸銨的加入有以下幾種方法： 1 1）加入固體鹽法）加入固體鹽法 用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況；用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況； 工業(yè)上常采用這種方法，加入速度不能太快，應(yīng)分批加入，并充分?jǐn)嚬I(yè)上常采用這種方法，加入速度不能太快，應(yīng)分批加入，并充分?jǐn)?拌，使其完全溶解和防止局部濃度過高；拌，使其完全溶解和防止局部濃度過高； 2 2）加入飽和溶液法）加入飽和溶液法 用于要求飽和度不

12、高而原來溶液體積不大的情用于要求飽和度不高而原來溶液體積不大的情 況；它可防止局部過濃，但加量較多時，料液會被稀釋。況；它可防止局部過濃，但加量較多時，料液會被稀釋。 3 3）透析平衡法）透析平衡法 先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和硫酸銨先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和硫酸銨 中進(jìn)行透析，袋內(nèi)飽和度逐漸提高，達(dá)到設(shè)定濃度后，目的蛋白析出。中進(jìn)行透析，袋內(nèi)飽和度逐漸提高，達(dá)到設(shè)定濃度后，目的蛋白析出。 該法優(yōu)點在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性，鹽析效果好，但程序煩瑣，該法優(yōu)點在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性，鹽析效果好，但程序煩瑣， 故多用于結(jié)晶。故多用于結(jié)晶。 鹽析用鹽量的鹽析用鹽量的表征

13、表征- - -飽和度：飽和度： u目標(biāo)蛋白質(zhì)的鹽析沉淀操作之前，所需的硫酸銨濃度目標(biāo)蛋白質(zhì)的鹽析沉淀操作之前，所需的硫酸銨濃度 或飽和濃度可通過實驗確定?；蝻柡蜐舛瓤赏ㄟ^實驗確定。 u對多數(shù)蛋白質(zhì)，當(dāng)達(dá)到對多數(shù)蛋白質(zhì)，當(dāng)達(dá)到85%85%飽和度時，溶解度都小于飽和度時，溶解度都小于 0.l mg0.l mgL L，通常為兼顧收率與純度，飽和度的操作，通常為兼顧收率與純度，飽和度的操作 范圍在范圍在40%-60%40%-60%之間。之間。 調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算表調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算表 n鹽析方法： l1）分步鹽析法(不同的鹽濃度) l2）重復(fù)鹽析法 l高蛋白質(zhì)濃度下共沉淀重復(fù)鹽析提高純度

14、l3）反抽提法(相同鹽濃度) 2、鹽析方法和注意事項 n分級鹽析法 n不斷提高鹽濃度：不同蛋白質(zhì)分級沉淀 n低飽和度：除雜蛋白，高飽和度：沉淀目的物 血清血清 球蛋白球蛋白 清蛋白清蛋白 (NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4 50%50%飽和度飽和度 飽和飽和 析出析出析出析出 單酶鹽析曲線 雙酶鹽析曲線 n反抽提法 n共沉淀較低濃度鹽溶液溶雜蛋白 大腸桿菌RNA聚合酶的制備 n防止“局部過濃”：慢加，攪拌 n溫度：不宜過低，室溫1025C，易失活： 010C n時間：沉淀需經(jīng)一段老化時間（1小時）后分離 注意事項： 第二節(jié) 有機(jī)溶劑沉淀法 一、基本原理 二、影響沉淀效果的因素 l有機(jī)

15、溶劑對于許多蛋白質(zhì)（酶）、核酸、多糖有機(jī)溶劑對于許多蛋白質(zhì)（酶）、核酸、多糖 和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用，是較早和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用，是較早 使用的沉淀方法之一。使用的沉淀方法之一。 l優(yōu)點：優(yōu)點： l1 1）分辨能力比鹽析法高，即蛋白質(zhì)等只在一個比較）分辨能力比鹽析法高，即蛋白質(zhì)等只在一個比較 窄的有機(jī)溶劑濃度下沉淀；窄的有機(jī)溶劑濃度下沉淀； l2 2）溶劑易除去）溶劑易除去 l3 3）沉淀不用脫鹽，過濾較為容易；）沉淀不用脫鹽，過濾較為容易； l缺點：缺點： l1 1）對具有生物活性的大分子容易引起變性失活，）對具有生物活性的大分子容易引起變性失活， l2 2）操作要求在

16、低溫下進(jìn)行。）操作要求在低溫下進(jìn)行。 l3 3）成本高，）成本高，需需防火防爆防火防爆 l總體來說，蛋白質(zhì)和酶的有機(jī)溶劑沉淀法不如總體來說，蛋白質(zhì)和酶的有機(jī)溶劑沉淀法不如 鹽析法普遍。鹽析法普遍。 一、基本原理 n1、降低了介質(zhì)的介電常數(shù)，使溶質(zhì)分子之間 的靜電引力增加，聚集形成沉淀。 n 2、水溶性有機(jī)溶劑本身的水合作用降低了自 由水的濃度，壓縮了親水溶質(zhì)分子表面原有水 化層的厚度，降低了它的親水性，導(dǎo)致脫水凝 集。 n脫水作用比靜電作用強(qiáng) 一些溶劑的介電常數(shù)一些溶劑的介電常數(shù) 35 二、影響沉淀效果的因素 1.有機(jī)溶劑種類及用量 n能與水無限混溶 n介電常數(shù)小、沉淀強(qiáng) n變性小 n毒性小，

17、揮發(fā)性適中 常用：乙醇、丙酮（揮發(fā)肝毒性著火點低）和甲 醇（口服毒性） 介電常數(shù)：無水乙醇24，甲醇33，丙酮22 乙醇：沉析作用強(qiáng)，揮發(fā)性適中，無毒，常用于蛋白質(zhì)、核 酸、多糖等生物大分子的沉析； 丙酮：沉析作用更強(qiáng)，用量省，但毒性大，應(yīng)用范圍不廣； 用量：（了解） 2.pH的影響 nPl附近、穩(wěn)定性 n控制溶液pH時務(wù)必使溶液中大多數(shù)蛋白質(zhì)分子 帶有相同電荷，勿使目的物與雜質(zhì)帶異電荷導(dǎo) 致共沉淀。 n嚴(yán)格控制低溫 有機(jī)溶劑與水混合時產(chǎn)生放熱反應(yīng) q預(yù)冷（有機(jī)溶劑-10以下，蛋白質(zhì)0左右）， q在冰鹽浴中進(jìn)行， q加入有機(jī)溶劑時必須緩慢且不斷攪拌以免局部過濃 變性，并散熱。 n溫度影響有機(jī)溶

18、劑對蛋白質(zhì)的沉淀能力，一般 溫度越低，沉淀越完全。 3.溫度 n低濃度緩沖液（0.01-0.05mol/L），0.2mol/L）：鹽溶，增大蛋白質(zhì)在 有機(jī)溶劑水溶液中的溶解度，會增加溶媒用量， 沉淀物中可能夾帶鹽，需除鹽 q常用的中性鹽為醋酸鈉、醋酸銨、氯化鈉等。 4.無機(jī)鹽的含量 5.某些金屬離子的助沉淀作用 nZn、Cu等與呈陰離子狀態(tài)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合 物，而活性不變，有助于沉淀，降低有機(jī)溶劑 用量。 n胰島素精制：胰島素精制： 6.樣品濃度 n較?。喝軇┝?，收率，稀釋變性 n較高：共沉淀，分辨率，溶劑量，回收率， 變性小 n蛋白質(zhì)初濃度：0.5%2% n粘多糖：12% 舉例：固體發(fā)酵生產(chǎn)

19、舉例：固體發(fā)酵生產(chǎn)-淀粉酶的提取工藝研究淀粉酶的提取工藝研究 -淀粉酶（米曲霉）菌體淀粉酶（米曲霉）菌體 + 水水 過濾過濾 水抽提清液水抽提清液 加乙醇（加乙醇（70%）攪拌）攪拌 -淀粉酶淀粉酶 * pH影響影響 收率收率% 酶活酶活 收率收率 酶活酶活 6.5 pH * 適宜的適宜的pH 5.6 6.0 * 溫度影響溫度影響 收率收率% 酶活酶活 酶活酶活 收率收率 10 20 T * 適宜的溫度適宜的溫度10 20 第三節(jié) 其它沉淀方法 n一、等電點沉淀 n二、成鹽沉淀法 n三、親和沉淀 n四、高分子聚合物沉淀法 n五、表面活性劑沉淀法 一、等電點沉淀法 原理： nPl時分子表面靜電荷

20、為零，雙電層及水化膜的削 弱或破壞，分子間引力增加，溶解度降低。 n常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起 配合使用。 n主要：去除雜蛋白，而不用于沉淀目的物。 二、成鹽沉淀法 n1.金屬離子沉淀 n所用的金屬離子，包括MnMn2+ 2+、 、FeFe2+ 2+、 、CoCo2+ 2+、 、NiNi2+ 2+、 、 ZnZn2+ 2+、 、CaCa2+ 2+、 、BaBa2+ 2+、 、MgMg2+ 2+等。 n蛋白質(zhì)和酶分子中因為含有羥基、氨基、咪唑基 和硫氫基等，均可以和上述金屬離子作用形成鹽 復(fù)合物。 n分離沉淀復(fù)合物分解除金屬離子（離子交換 或金屬螯合劑EDTA） n應(yīng)用： 目的蛋

21、白分離，去雜質(zhì) n缺點：有時復(fù)合物分解較困難，蛋白質(zhì) 易變性 2.有機(jī)酸類復(fù)合鹽 含氮有機(jī)酸如苦味酸、苦桐酸和鞣酸等能 夠與有機(jī)分子的堿性功能團(tuán)形成復(fù)合物而沉淀析 出。 工業(yè)上用此法制備蛋白質(zhì)時，需采取較溫 和的條件，有時還加入一定的穩(wěn)定劑，以防止蛋 白質(zhì)變性。 n單寧：結(jié)合后牢固，競爭結(jié)合法分解 n雷凡諾：不影響蛋白質(zhì)活性 n三氯乙酸（TCA）：變性，除雜蛋白 雷凡諾雷凡諾 n 豬心提取液豬心提取液 洗脫液洗脫液 上清液上清液 上清上清 細(xì)胞色素細(xì)胞色素C C 沉淀（去除）沉淀（去除） 吸附 人造沸石 鹽析 45%飽和硫酸銨 沉淀 TCA 透析 三、親和沉淀法 n配基+可溶性載體偶聯(lián)成載體-

22、配基復(fù)合物（親 和沉淀劑） n可選擇性地與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀出來 u它是利用蛋白質(zhì)與特定的生物合成分子（免疫配它是利用蛋白質(zhì)與特定的生物合成分子（免疫配 位體、基質(zhì)、輔酶等）之間高度專一的相互作用位體、基質(zhì)、輔酶等）之間高度專一的相互作用 而設(shè)計出來的一種特殊選擇性的分離技術(shù)。而設(shè)計出來的一種特殊選擇性的分離技術(shù)。 u所以所以其沉淀原理不是依據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異，其沉淀原理不是依據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異， 而是依據(jù)而是依據(jù)“吸附吸附”有特殊蛋白質(zhì)的聚合物的溶解有特殊蛋白質(zhì)的聚合物的溶解 度的大小。度的大小。 親親 和和 沉沉 淀淀 過程過程 n親和過程提供了一個從復(fù)雜混合物中分離提取單親和過程提供了

23、一個從復(fù)雜混合物中分離提取單 一產(chǎn)品的有效方法。一產(chǎn)品的有效方法。 初始階段，將一個目標(biāo)初始階段，將一個目標(biāo)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)與鍵合在可溶性載與鍵合在可溶性載 體上的體上的親合配位體親合配位體絡(luò)和形成沉淀；絡(luò)和形成沉淀； 所得沉淀物用一種適當(dāng)?shù)木彌_溶液進(jìn)行洗滌，所得沉淀物用一種適當(dāng)?shù)木彌_溶液進(jìn)行洗滌，洗洗 去去可能存在的可能存在的雜質(zhì)雜質(zhì)； 用一種適當(dāng)?shù)脑噭⒂靡环N適當(dāng)?shù)脑噭⒛繕?biāo)蛋白質(zhì)目標(biāo)蛋白質(zhì)從配位體中離解從配位體中離解 出來。出來。 四、高分子聚合物沉淀法 n水溶性非離子型高分子聚合物能使蛋白質(zhì)水合作 用減弱而發(fā)生沉淀。 nPEG、壬苯乙烯化氮（NPEO)、葡聚糖 n雙水相或單高聚物 q其中應(yīng)

24、用最多的是聚乙二醇。 n無毒，對產(chǎn)品的影響小，但不易除去 56 五、表面活性劑沉淀法 nCTAB （十六烷基三甲基季胺溴化物） 、CPC (十六烷基氯化吡啶) ：沉淀酸性多糖 n與多糖上的陰離子形成形成季銨絡(luò)合物，降低離子強(qiáng)度，絡(luò) 合物析出。 nSDS：分離胰蛋白或核蛋白 q目的是使核酸和蛋白質(zhì)分離，蛋白質(zhì)變性沉淀，核酸則 存在于水溶液中。 討論：咸鴨蛋煮熟了，蛋黃里會有油，這 是什么緣故？ n熟鴨蛋蛋黃中脂肪的含量高達(dá)熟鴨蛋蛋黃中脂肪的含量高達(dá)3131，為什么看，為什么看 不到一點油？可是在熟咸蛋的蛋黃中，卻經(jīng)常不到一點油？可是在熟咸蛋的蛋黃中，卻經(jīng)常 可以看到黃色的油滴往外流？可以看到黃色

25、的油滴往外流？ n蛋黃中除了脂肪以外，還含有豐富的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)蛋黃中除了脂肪以外，還含有豐富的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì) 就是一種高明的乳化劑，它能夠把蛋黃中的脂肪分散就是一種高明的乳化劑，它能夠把蛋黃中的脂肪分散 成很小的油滴，這樣就騙過了我們的眼睛和舌頭。成很小的油滴，這樣就騙過了我們的眼睛和舌頭。 n在鹽漬過程中，作為乳化劑的蛋白質(zhì)被鹽析出來，乳在鹽漬過程中，作為乳化劑的蛋白質(zhì)被鹽析出來，乳 濁液被破壞了，那些原來分散成極小的油滴，彼此就濁液被破壞了，那些原來分散成極小的油滴，彼此就 互相聚集起來，變成大油液，使得整個蛋黃變成油滋互相聚集起來，變成大油液，使得整個蛋黃變成油滋 滋的，甚至流出油來了

26、。滋的，甚至流出油來了。 第四節(jié) 結(jié)晶 n定義：溶液中的溶質(zhì)在一定條件下因分子有規(guī)則 的排列而結(jié)合成晶體。 q只有同類分子或離子才能排列成晶體，因此結(jié)晶過程有 良好的選擇性。 q通過結(jié)晶，溶液中的大部分雜質(zhì)會留在母液中，經(jīng)過濾、 洗滌可得到純度高的晶體。 一、結(jié)晶過程 二、過飽和溶液的形成 三、提高晶體質(zhì)量的途徑 n飽和溶液：當(dāng)溶液中溶質(zhì)濃度等于該溶質(zhì)在同等 條件下的飽和溶解度時，該溶液稱為飽和溶液； n過飽和溶液：溶質(zhì)濃度超過飽和溶解度時，該溶 液稱之為過飽和溶液； n溶質(zhì)只有在過飽和溶液中才能析出； 一、結(jié)晶過程 1.概念 n推動力： q形成新相（固體）需要一定的表面自由能。因此，溶液 濃

27、度達(dá)到飽和溶解度時，晶體尚不能析出，只有當(dāng)溶質(zhì) 濃度超過飽和溶解度后，才可能有晶體析出。 n晶核： q最先析出的微小顆粒是以后晶體的中心，稱為晶核。 q首先形成晶核，微小的晶核具有較大的溶解度。實質(zhì)上， 在飽和溶液中，晶核是處于一種形成溶解再形成的 動態(tài)平衡之中，只有達(dá)到一定的過飽和度以后，晶核才 能夠穩(wěn)定存在。 2.晶體的形成 結(jié)晶是指溶質(zhì)自動從過飽和溶液中析出，形成 新相的過程。條件： 過程： n形成過飽和溶液 n晶核形成 n晶體生長 3.結(jié)晶曲線 n穩(wěn)定態(tài)：不沉淀結(jié)晶 n亞穩(wěn)定態(tài)：不自動生 產(chǎn)結(jié)晶，加入晶體能 誘導(dǎo)結(jié)晶。控制條件， 讓晶體緩慢長大。 n不穩(wěn)定態(tài)：自動沉淀 結(jié)晶，大量細(xì)小結(jié)

28、晶 結(jié)晶操作通常都在亞穩(wěn)區(qū)中進(jìn)行結(jié)晶操作通常都在亞穩(wěn)區(qū)中進(jìn)行 4.起晶方法 自然起晶自然起晶 n把溶液蒸發(fā)把溶液蒸發(fā) 濃縮至過飽濃縮至過飽 和區(qū)（不穩(wěn)和區(qū)（不穩(wěn) 定區(qū)），則定區(qū)），則 有大量晶核有大量晶核 自然形成。自然形成。 n但晶核數(shù)量但晶核數(shù)量 難以控制，難以控制， 晶粒小。晶粒小。 刺激起晶刺激起晶 n把溶液蒸發(fā)至接近過飽和把溶液蒸發(fā)至接近過飽和 線后把溶液放出，使溶液線后把溶液放出，使溶液 突然冷卻，進(jìn)入過飽和區(qū)突然冷卻，進(jìn)入過飽和區(qū) 形成大量晶核。形成大量晶核。 n當(dāng)晶核達(dá)到一定數(shù)量后，當(dāng)晶核達(dá)到一定數(shù)量后， 回升溫度，使溶液進(jìn)入介回升溫度，使溶液進(jìn)入介 穩(wěn)區(qū)，停止晶核產(chǎn)生，然穩(wěn)區(qū)

29、，停止晶核產(chǎn)生，然 后再慢慢冷卻，同時攪拌，后再慢慢冷卻，同時攪拌， 使晶核長大。使晶核長大。 晶種起晶晶種起晶 n將溶液濃縮到介穩(wěn)定區(qū)將溶液濃縮到介穩(wěn)定區(qū) 的飽和濃度后，加入一的飽和濃度后，加入一 定大小和數(shù)量的晶種，定大小和數(shù)量的晶種， 同時均勻攪拌，使晶體同時均勻攪拌，使晶體 長大。長大。 n優(yōu)點：控制方便，產(chǎn)品優(yōu)點：控制方便，產(chǎn)品 晶體大小均勻。晶體大小均勻。 二、過飽和溶液的形成（結(jié)晶方法） 1.蒸發(fā)法 q蒸發(fā)除去部分溶劑，在常壓或減壓下加熱除去一部 分溶劑，以達(dá)到或維持過飽和度。 q適用于小分子化合物的結(jié)晶，受熱變性的蛋白質(zhì)或 酶類不宜采用。 2.溫度誘導(dǎo)法 n通過升高或降低溫度，

30、使溶液逐漸達(dá)到飽和， 可緩慢析出晶體。 n熱盒技術(shù) n耐熱生化物質(zhì)高溫溶解溫度逐漸下降析出 晶體 3.鹽析結(jié)晶法 n固體鹽粉末、飽和 鹽溶液（中性鹽） n蛋白質(zhì)及酶類藥物 制備中常用方法 4.透析結(jié)晶法 72 使溶解度的變 化連續(xù)又緩慢 5.有機(jī)溶劑結(jié)晶 常用的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、甲醇、丁醇、異丙醇、乙 腈、2、4二甲基戊二醇（MPO）等。 蛋白質(zhì)變性 溶劑回收 6.等電點結(jié)晶 7.微量擴(kuò)散法 n通過氣相擴(kuò)散使樣品中溶質(zhì)達(dá)到飽和晶體 8.化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶法 n調(diào)pH或加反應(yīng)劑生成新物質(zhì)結(jié)晶 其實質(zhì)是利用化學(xué) 反應(yīng)，對待結(jié)晶的 物質(zhì)進(jìn)行修飾，一 方面可以調(diào)節(jié)其溶 解特性，同時也可 以進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)

31、； 9.共沸蒸餾結(jié)晶 n共沸物的共沸點 n真空下共沸點 n真空低溫下進(jìn)行共沸蒸餾結(jié)晶 n常多種方法綜合應(yīng)用 n工業(yè)上通常希望得到工業(yè)上通常希望得到粗大而均勻粗大而均勻的晶體，便于的晶體，便于 過濾與洗滌。過濾與洗滌。 n晶體質(zhì)量包括三個方面的內(nèi)容：晶體質(zhì)量包括三個方面的內(nèi)容： 晶體大小、形狀和純度晶體大小、形狀和純度 三、提高晶體質(zhì)量的途徑 n1）過飽和度 q過飽和度值應(yīng)大至使結(jié)晶操作控制在過飽和度值應(yīng)大至使結(jié)晶操作控制在亞穩(wěn)區(qū)亞穩(wěn)區(qū)內(nèi)，又內(nèi)，又 保持較高的晶體生長速率，使結(jié)晶高產(chǎn)而優(yōu)質(zhì)。保持較高的晶體生長速率，使結(jié)晶高產(chǎn)而優(yōu)質(zhì)。 n2）溫度（緩慢冷卻） 1.1.晶體大小晶體大小 快速冷卻或蒸

32、發(fā)快速冷卻或蒸發(fā) 大量細(xì)小的晶體大量細(xì)小的晶體 緩慢冷卻或蒸發(fā)緩慢冷卻或蒸發(fā) 大而均勻的晶體大而均勻的晶體 n3）攪拌速度：適當(dāng)，不宜太快 攪拌的作用攪拌的作用: : 加速溶液的熱傳導(dǎo)，加快生產(chǎn)過程。加速溶液的熱傳導(dǎo)，加快生產(chǎn)過程。 加速溶質(zhì)擴(kuò)散過程的速率，有利于晶體成長。加速溶質(zhì)擴(kuò)散過程的速率，有利于晶體成長。 使溶液的溫度均勻，防止溶液局部濃度不均，結(jié)垢等。使溶液的溫度均勻，防止溶液局部濃度不均，結(jié)垢等。 使晶核散布均勻，防止晶體粘連在一起形成晶簇，降低產(chǎn)品質(zhì)量使晶核散布均勻，防止晶體粘連在一起形成晶簇，降低產(chǎn)品質(zhì)量。 n4）晶種：誘導(dǎo)結(jié)晶，控制晶體形狀大小均勻度 2.2.晶體形狀晶體形狀

33、 n晶體生長速度 n過飽和度 n溶劑 npH： pH的變化，可以改變?nèi)苜|(zhì)分子的帶電性質(zhì)，是影響溶質(zhì)分 子溶解度的一個重要因素。一般結(jié)晶液所選用的pH 與沉淀大致相 同。 n雜質(zhì) 3.3.晶體純度晶體純度 n母液中的雜質(zhì) n晶體越細(xì)小，雜質(zhì)越多 n洗滌有利提高純度 n結(jié)晶速度過快，易產(chǎn)生“晶蔟”，包含雜質(zhì) 雜質(zhì)雜質(zhì)對對晶體的成長晶體的成長速率的影響較為復(fù)雜，有的雜質(zhì)能抑制晶體速率的影響較為復(fù)雜，有的雜質(zhì)能抑制晶體 的成長，有的能促進(jìn)成長，有的能改變晶型。的成長，有的能促進(jìn)成長，有的能改變晶型。 4.4.晶體結(jié)塊晶體結(jié)塊 n原因： n粒度不齊、空氣濕度高、溫度高、受壓、貯存 時間增長 n措施： n

34、控制粒度分布、良好外形、干燥密閉容器貯存 5.5.重結(jié)晶重結(jié)晶 n晶體用合適溶劑溶解后再 次結(jié)晶，提高純度 n用于生物物質(zhì)重結(jié)晶的溶 劑一般有蒸餾水、丙酮、 石油醚、乙酸乙酯、低級 醇等。 n結(jié)晶是分離純化蛋白質(zhì)、酶等生化產(chǎn)品的結(jié)晶是分離純化蛋白質(zhì)、酶等生化產(chǎn)品的 一種有效手段一種有效手段。變性蛋白質(zhì)不能結(jié)晶，所。變性蛋白質(zhì)不能結(jié)晶，所 以凡結(jié)晶狀態(tài)的蛋白質(zhì)都能保持天然狀態(tài)。以凡結(jié)晶狀態(tài)的蛋白質(zhì)都能保持天然狀態(tài)。 2021-7-16南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院842021-7-1684南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 谷氨酸結(jié)晶谷氨酸結(jié)晶 固相析出法的應(yīng)

35、用固相析出法的應(yīng)用 例例1 1：尿激酶的沉淀分離：尿激酶的沉淀分離 n尿激酶：分離方法包括沉淀法、吸尿激酶：分離方法包括沉淀法、吸 附法、層析法附法、層析法 n沉淀法：沉淀法： q金屬離子形成復(fù)合鹽金屬離子形成復(fù)合鹽 q脫鹽脫鹽 q鹽析鹽析 Zn Zn 離子沉淀尿激酶離子沉淀尿激酶 低濃度時低濃度時，zn 能選擇沉淀尿激酶。能選擇沉淀尿激酶。 在在3mM可得可得85-92 回收率，而沉回收率，而沉 淀物的量并不多；淀物的量并不多； 加大加大Zn 濃度濃度雖然能提高有限回收雖然能提高有限回收 率，但沉淀物量大，純度降低。率，但沉淀物量大，純度降低。 沉淀量沉淀量 酶活酶活 EDTA 溶出效應(yīng) 硫

36、酸銨溶解尿激酶鋅絡(luò)合物 n硫酸銨的選用硫酸銨的選用 n1) 1)它在低濃度時可能有鹽溶作用，促進(jìn)沉淀蛋它在低濃度時可能有鹽溶作用，促進(jìn)沉淀蛋 白溶解；白溶解； n2)2)因為本身有因為本身有NHNH4 4+ +，與，與Zn Zn 2+ 2+有絡(luò)合作用，有 有絡(luò)合作用，有 利利 于沉淀物溶解；于沉淀物溶解； n3)3)硫酸銨為鹽析所用，在最終鹽析中，只需補(bǔ)硫酸銨為鹽析所用，在最終鹽析中，只需補(bǔ) 加規(guī)定量即可，而不引入其他成分。加規(guī)定量即可，而不引入其他成分。 尿激酶鹽析沉淀尿激酶鹽析沉淀 沉淀量沉淀量 回收率回收率 純度純度 例例2：檸檬酸的生產(chǎn)：檸檬酸的生產(chǎn) n檸檬酸是一種重要的有機(jī)酸，它在食

37、品、醫(yī)藥、化工、檸檬酸是一種重要的有機(jī)酸，它在食品、醫(yī)藥、化工、 皮革、環(huán)保等工業(yè)部門都有廣泛的用途。皮革、環(huán)保等工業(yè)部門都有廣泛的用途。 n目前檸檬酸極大多數(shù)是通過微生物發(fā)酵法（黑曲霉）目前檸檬酸極大多數(shù)是通過微生物發(fā)酵法（黑曲霉） 生產(chǎn)，生產(chǎn)， n提取工藝中，目前大多通過沉淀法制備（碳酸鈣沉淀提取工藝中，目前大多通過沉淀法制備（碳酸鈣沉淀 及硫酸酸解）及硫酸酸解） 標(biāo)準(zhǔn)沉淀法回收檸檬酸流程圖標(biāo)準(zhǔn)沉淀法回收檸檬酸流程圖 加熱到加熱到70度度 pH1.82.0 過濾 例例3：胰蛋白酶的提?。阂鹊鞍酌傅奶崛?從動物胰臟中提取胰蛋白酶工藝從動物胰臟中提取胰蛋白酶工藝 u胰蛋白酶原的溶解：酸性條件下

38、穩(wěn)定胰蛋白酶原的溶解：酸性條件下穩(wěn)定 u溶解液中含有大量的酸性雜蛋白（溶解液中含有大量的酸性雜蛋白（pI10.8)pI10.8) u濃縮分離胰蛋白酶原（鹽析）濃縮分離胰蛋白酶原（鹽析） u溶解激活（酶原溶解激活（酶原- -酶）酶） u胰蛋白酶的進(jìn)一步分離：酶溶液中糜蛋白彈性蛋白等胰蛋白酶的進(jìn)一步分離：酶溶液中糜蛋白彈性蛋白等 與胰蛋白酶在不同的鹽濃度下溶解度不同與胰蛋白酶在不同的鹽濃度下溶解度不同 胰蛋白酶的提取胰蛋白酶的提取 （二）胰蛋白酶原激活（二）胰蛋白酶原激活 o濾餅溶解濾餅溶解, , 加入無水加入無水CaClCaCl2 2, ,邊加邊攪拌邊加邊攪拌, ,最終含有最終含有0.1M Ca

39、Cl0.1M CaCl2 2； o5MNaOH5MNaOH調(diào)調(diào)pHpH至至8.0,8.0,加極少量胰酶攪拌，于室溫下活化加極少量胰酶攪拌，于室溫下活化8 81010小時；小時； A.A.活化完成，用活化完成，用2.5M H2.5M H2 2SOSO4 4調(diào)調(diào)pHpH至至2.5-3.02.5-3.0，抽濾除去，抽濾除去CaSOCaSO4 4沉淀。沉淀。 （一）豬胰蛋白酶原的提?。ㄒ唬┴i胰蛋白酶原的提取 胰臟絞碎加入胰臟絞碎加入2 2倍體積冷乙酸倍體積冷乙酸 (pH2.5)(pH2.5)低溫攪拌低溫攪拌2424小時，過濾；小時，過濾； 濾液用濾液用2.5M H2.5M H2 2SOSO4 4調(diào)調(diào)pHpH至至2.52.53.03.0，放置，放置3 34 4小時后，用濾紙過濾；小時后，用濾