傳染性胰臟壞死病診斷方法 編制說明

《傳染性胰臟壞死病診斷方法》征求意見稿編制說明根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)計劃項目信息：2024年1月2日，傳染性胰臟壞死病診斷方法（計劃號：20233360-T-326）修訂工作正式啟動，歸口單位為全國水產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會，主管部門（二)制定背景傳染性胰臟壞死?。↖nfectiouspancreaticnecrosis,IPN）是一種嚴(yán)重危重危害性，在我國被列為三類動物疫病，國家水生動物疫病監(jiān)測計劃中規(guī)定的專項調(diào)查對鱒10﹪~90﹪的死亡率，急性感染時累計死亡率可達(dá)100﹪。發(fā)病魚體色發(fā)黑、眼突出、該病呈急性流行，且發(fā)病后殘存未死的魚可數(shù)年以上直到終身帶毒，依然能夠傳播病2個殼粒。衣殼內(nèi)有由2個片段組成的雙股RNA基因，片段A編碼一個多聚蛋白，包括VP2、斷及疫苗研究的主要靶點。IPNV分離株含有10個血清型，包括A組血清型A1（West1-6）。不同IPN病毒株對鱒魚的毒力相差很大。國際上公認(rèn)的強毒株是歐洲的sp株（即A2），法第1部分：傳染性胰臟壞死病毒（IPNV）》，采用CHSE、PG、R由于IPN在世界范圍分布廣泛，從2008年起將IPN診斷相關(guān)章節(jié)從OIE《水生動物疾病診斷由于較多水生動物疫病檢測實驗室不具備抗體制備技術(shù)，或不熟悉免疫學(xué)技術(shù)，且3物學(xué)檢測也開展了多年的研究工作，有較好的研究基礎(chǔ)，研制的成果已經(jīng)用于國家水生動本標(biāo)準(zhǔn)起草組成員在標(biāo)準(zhǔn)制修定方面具有較強的工作基礎(chǔ)和豐富的工作經(jīng)驗。已主持術(shù)規(guī)范，SC/T7016.13-2019魚類細(xì)胞系第13斷規(guī)程，SC/T7221-2016蛙病毒檢測方法，DB11/T374—2021起草組成員包括3名以上全國水產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治分技術(shù)委員會規(guī)范傳染性胰臟壞死病的診斷方法，保障傳染性胰臟壞死病的流行病學(xué)調(diào)查、診斷、集國內(nèi)外關(guān)于傳染性胰臟壞死病的發(fā)病信息及檢測方法等相關(guān)資料，并對資料進(jìn)行分析、研究階段：起草組先后承擔(dān)了北京市漁業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊病毒病防控崗位、北京市農(nóng)業(yè)農(nóng)村4研究所研究建立的RT-PCR檢測方法，收集大量疑似感染IPNV樣品組織，利用RT-qPCR方制定征求意見稿和編制說明：組成起草工作小組，制定傳染性胰臟壞死病診斷方法大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院、青海省漁業(yè)技術(shù)共收到家單位的位專家的回復(fù)意見共起草單位：全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站、北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站、中國水產(chǎn)科學(xué)院黑龍江5二、國家標(biāo)準(zhǔn)編制原則、主要內(nèi)容及其確定依據(jù)，修訂前后技術(shù)內(nèi)容的對比第十六條和《農(nóng)業(yè)部國家（行業(yè)）標(biāo)準(zhǔn)的計劃編制、制定和審查管理辦法》第二章的基本要求而編寫。在編寫過程中，嚴(yán)格遵循一致性、協(xié)調(diào)性、易用性等原則；同時還遵照以下通用性強原則：本標(biāo)準(zhǔn)的修訂主要是充分考慮方法成熟性、檢測工作效率、試劑耗材等院校和研究所相關(guān)專業(yè)技術(shù)人員的使用。標(biāo)準(zhǔn)中主要技術(shù)內(nèi)容修訂是增加了RT-qPCR方6(二)主要內(nèi)容及其確定依據(jù)液不必勻漿，稀釋兩倍以上。用相同的方法離心卵巢液樣品并在以后的步驟中直接用其上7BF-2；但在當(dāng)年國標(biāo)制定過程中，由于考慮到國內(nèi)還沒有BF-2細(xì)胞系，因此就沒有包括），8123456789A細(xì)胞對照BCDE病毒對照FGH定中和試驗檢測結(jié)果陽性，否則為陰性。原國標(biāo)中中和試驗判定部分較為復(fù)雜，且難理解37℃反應(yīng)15min以除掉非特異性的過氧陽性對照孔的A450值（P）與陰性對照孔的A450值（N）之比大于等于2.1（即/N≥2.1），判定ELISA檢測結(jié)果陽性，否則為陰性。采用CTAB抽提核酸，或采用等效的商品化RNA提取試劑盒。這兩種方法均為檢測實采用2篇文獻(xiàn)建立的IPNVRT-PCR檢測方法中引物序列及退火溫度[3,7]。），結(jié)果表明，2017年—2020年，在甘肅檢出Genogroup5和Genogroup1；遼寧檢出明顯目的條帶，經(jīng)測序所獲得的序列與參考序列同源性均可達(dá)到99% 10051AJ4892252310AF343572VR299 10051AJ4892252310AF343572VR2996591 666591 66 43 43 4399 AJ622822SP99 AJ622822SP 7676AY354520SP 76 AF342732Canada16161AJ4892285786161 AF342734Canada3 99AF342733Canada2 69AF342727WBAF342735Jasper AF343573Buh17770M18049Jasper6570M18049Jasper6583 3830#2018年遼寧 0.05Genogroup5Genogroup3Genogroup6采用CTAB抽提核酸，或采用等效的商品化RNA提取試劑盒。這兩種方法均為檢測實IPNV分為6個基因簇（Genogroup1-6）,將GenBank上公布的6種基因簇126個代表11AJ489225northwesternSpain2131VR299AF343572USA41AF343573USA516171AF342727USA81AF342735USA92USA2AF3427332AF3427343AJ489223northwesternSpain3AJ489224northwesternSpain3AJ489228northwesternSpain4AF3427325AF342728USA555AJ62282256AF342730USAUSA12345671AJ48922523AF3435724M180495AF343573678AF3435709AF342728AJ489222AJ622822AJ489229U48225U56907序列網(wǎng)址：NucleotideBLAST:Searchnucleotidedatabasesusinganucl最佳引物探針對模板進(jìn)行擴增，產(chǎn)物送至北京天成新脈對質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（原液濃度為5×1010copies/μL）進(jìn)行10倍系列稀釋，以濃度為濃度(μmol/L）123456789ABCDEFGHIJ通過矩陣法確定最佳退火溫度和時間。退火溫度設(shè)定為50℃~60℃六個梯度，退火-3-4退火時間-5-3-4-5-3-4-5＋12345-3-4-5-3-5-3-5-3-4/Ct值123456789++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ⅤⅤⅤⅠⅠⅤⅤⅤⅤⅤⅠⅠⅤⅤⅤⅤⅤⅠⅤⅤⅤⅤⅠⅠⅠ///////////////(三)修訂前后技術(shù)內(nèi)容的對比2、修訂后變化的內(nèi)容壞死病毒（IPNV）》相比，除編輯性修——增加了傳染性胰臟壞死病（IPN）資料性附錄；主要引起人工養(yǎng)殖的虹鱒魚苗生病和死亡。發(fā)病魚體色膚和鰭條出血、腸內(nèi)無食物且充滿了黃色黏液，胃幽門部出血。組織壞死，細(xì)胞壞死；黏膜上皮壞死；腸系膜，胰腺泡壞死，脂肪病變（6）傳染性胰臟壞死?。↖PN）資料性附錄CAGACCTCCTGAAGAACATGGTCACCAAGTATGGCAAATATGAC①增加臨床癥狀，可進(jìn)一步明確傳染性胰臟壞死病的發(fā)病癥狀②更改中和試驗結(jié)果判定，原因在于原國標(biāo)中中和試驗判定部分但在當(dāng)年國標(biāo)制定過程中，由于考慮到國內(nèi)還沒有BF-），毒的分離鑒定及聚類分析[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報,2017,32XinTang,WenwenZhaoandLimingXu.三、試驗驗證的分析、綜述報告，技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證，預(yù)期的經(jīng)濟(jì)效益、社會（一）試驗驗證的分析業(yè)技術(shù)推廣中心三家單位對本標(biāo)準(zhǔn)提供的檢測方法進(jìn)行驗證，結(jié)果證明理，操作流程清晰明確，結(jié)果易于判斷；樣品檢測結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一高等院校和研究所相關(guān)專業(yè)技術(shù)人員均可在配備實驗條件的基礎(chǔ)上按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法使控制和撲滅，動物和動物產(chǎn)品的檢疫，動物診療，監(jiān)督管理和保障措定。傳染性胰臟壞死病