植物組培快繁程序

植物組培快繁程序第三章植物組培快繁程序

植物快速繁殖就是應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù),快速繁殖名優(yōu)特新品物，使其在較短時(shí)間內(nèi)繁衍較多的植株?？旆笔钱?dāng)前植物細(xì)胞組織培養(yǎng)中應(yīng)用最廣泛，又最有效的方法之一。一、供體植株的培養(yǎng)與取材二、外植體的滅菌與接種三、培養(yǎng)四、馴化移栽五、組培快繁計(jì)劃安排與實(shí)施主要內(nèi)容一、供體植株的培養(yǎng)與取材

一般來說，無論何種類型的細(xì)胞組織培養(yǎng)技術(shù)，起始階段均涉及外植體取材、滅菌與接種培養(yǎng)等基本過程。外植體來源的環(huán)境以及外植體的類型，均會(huì)影響將來培養(yǎng)的效果，而滅菌、接種和培養(yǎng)條件的選擇與控制，也與外植體的來源和類型有關(guān)。1、外植體的來源-生長在自然環(huán)境下的植物-有目的地培育在溫室控制條件下生長的植物-無菌環(huán)境下已經(jīng)過離體培養(yǎng)的植物自然環(huán)境中生長的植株，一般帶有微生物，甚至與某些微生物具有寄生關(guān)系，使植株具有內(nèi)生菌。取自這些植物的外植體，在培養(yǎng)過程中會(huì)有微生物滋生，從而影響培養(yǎng)效果。

自然環(huán)境生長植株溫室控制條件下生長植株已離體培養(yǎng)植株

在多數(shù)情況下，應(yīng)盡量使用溫室或人工氣候室控制培養(yǎng)的植物材料作為外植體來源，減少培養(yǎng)過程中的微生物感染概率。同時(shí)，生長在控制條件下的植物可以保持培養(yǎng)材料間的一致性，提高實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，也便于培養(yǎng)技術(shù)的規(guī)范。

某些多年生植物或特殊材料，必須取自自然生長的植物，就需要盡可能避免使用那些生長過于潮濕和不潔凈環(huán)境中的植物。對(duì)于培養(yǎng)過程中可能出現(xiàn)內(nèi)生菌污染的材料，應(yīng)盡量取生長旺盛期的生長點(diǎn)部位作為起始培養(yǎng)的材料。

2、供體植株的管理取自室外的外植體材料，供體植株的管理十分重要，這與外植體培養(yǎng)時(shí)的污染率密切相關(guān)。植株管理中應(yīng)注意：⑴避免昆蟲危害許多昆蟲如蚜蟲、螨類和飛虱是許多植物病蟲害的傳播媒介，會(huì)引起植物組織的潛在感染。⑵注意防病尤其是真菌和細(xì)菌病害的侵染，取自感病植株的外植體，在培養(yǎng)中的污染率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于來自健康植株的外植體，必要時(shí)需使用化學(xué)藥劑防治病害。⑶控制濕度給供體植株澆水時(shí)應(yīng)從根部給水，避免從上部澆水，以免上部形成易于病原侵染的濕度環(huán)境；盡可能降低溫室濕度；取材前盡可能保持植株干爽。3、材料取材⑴材料選擇培養(yǎng)材料應(yīng)選擇有代表性的主要植物、選擇性狀優(yōu)良的種質(zhì)或特殊的基因型。快速繁殖時(shí)應(yīng)在植株生長的最適時(shí)期取材，如花藥培養(yǎng)應(yīng)在花粉發(fā)育到單核期取材。⑵取材從生長健壯的無病蟲害的植株上選取發(fā)育正常的器官和組織。最好采用莖尖，后代性狀較穩(wěn)定，攜帶細(xì)菌較少。選取材料的大小一般在之間。胚胎培養(yǎng)或脫毒在0.5cm以下。材料太大易污染，材料太小難于成活。

1、預(yù)處理先對(duì)植物材料進(jìn)行修剪整理，去掉不需要部分，將準(zhǔn)備使用的植物材料（外植體）在流水中沖洗20-60分鐘，備用。如特別不潔的外植體，可先用加有洗滌劑的水清洗10-15分鐘，再用流水沖洗干凈。二、外植體的滅菌與接種2、表面滅菌（1）操作人員穿戴滅過菌的工作服、口罩。進(jìn)入接種室前雙手用洗滌劑清洗干凈，操作前再用70%酒精或消毒劑擦洗雙手。（2）操作期間雙手和臺(tái)面常用70%酒精或消毒劑擦拭。超凈工作臺(tái)使用前必須用紫外燈照射殺菌，然后開啟風(fēng)機(jī)。

（3）接種用工具（解剖刀、剪刀、鑷子）可放入70-75%酒精中，使用時(shí)需火焰灼燒滅菌，冷卻后使用。（4）外植體放入超凈工作臺(tái)內(nèi)，置70-75%酒精中5-60秒，0.1％氯化汞6-10分鐘，或10%的漂白粉上清液中10-15分鐘，然后用無菌水沖洗3-5次。滅菌時(shí)需進(jìn)行攪動(dòng)。

常用滅菌藥劑的使用和效果

滅菌劑使用濃度（%）清除的難易消毒時(shí)間效果次氯酸鈉9—10易5—30很好次氯酸鈣2易5—30很好漂白粉飽和濃度易5—30很好氯化汞0.1—1較難2—10最好酒精70—75易0.2—2好過氧化氫10—12最易5—15好溴水1—2易2—10很好硝酸銀1較難5—30好抗菌素4—50mg/L中30—60較好（1）材料吸干后，一手拿鑷子，一手拿剪子或解剖刀，對(duì)材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)那懈睢Ｈ缛~片切成0.5cm見方的小塊；莖切成含有一個(gè)節(jié)的小段。微莖尖要?jiǎng)兂芍缓琹—2片幼葉的莖尖大小等。在接種過程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。（2）解開包口紙，將培養(yǎng)瓶口幾乎水平拿著，避免灰塵落入瓶中。使瓶囗靠近酒精燈火焰，并將瓶口在火焰上方轉(zhuǎn)動(dòng)，使管口里外灼燒數(shù)秒鐘。3、外植體的接種（3）迅速用鑷子夾取切割分離下的所需組織、細(xì)胞、器官，送入培養(yǎng)容器內(nèi)，輕輕插入培養(yǎng)基。若是葉片直接附在培養(yǎng)基上，以放1—3塊為宜。接完種后，將管口在火焰上再灼燒數(shù)秒鐘。然后及時(shí)蓋上瓶蓋或封口。注意：所有操作均應(yīng)嚴(yán)格保持瓶口在操作區(qū)以內(nèi)，且不遠(yuǎn)離酒精燈；工具用后應(yīng)及時(shí)滅菌，避免交叉污染；工作人員操作時(shí)禁止不必要的談話。三、培養(yǎng)

指把離體植物材料放在培養(yǎng)室(有光照、溫度條件)里，使之生長，分裂和分化形成愈傷組織或進(jìn)一步分化成再生植株的過程。1、培養(yǎng)含義2、培養(yǎng)方法(1)固體培養(yǎng)法即用瓊脂固化培養(yǎng)基來培養(yǎng)植物材料的方法。是現(xiàn)在最常用的方法。雖然該方法設(shè)備簡單，易行，但養(yǎng)分分布不均，生長速度不均衡，并常有褐化中毒現(xiàn)象發(fā)生。(2)液體培養(yǎng)法即用不加固化劑的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)植物材料的方法。由于液體中氧氣含量較少，所以通常需要通過攪動(dòng)或振動(dòng)培養(yǎng)液的方法以確保氧氣的供給，采用往復(fù)式搖床或旋轉(zhuǎn)式搖床進(jìn)行培養(yǎng)，其速度一般為50～100r/min，這種定期浸沒的方法，既能使培養(yǎng)基均一，又能保證氧氣的供給。

培養(yǎng)步驟初代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)生根培養(yǎng)3、培養(yǎng)步驟（1）初代培養(yǎng)目的：獲得無菌材料和無性繁殖系。無性繁殖系：是指由一個(gè)外植體繼代增殖，繁殖出的具有相同遺傳物質(zhì)的植株群體。包括：芽叢、不定芽、胚狀體、原球莖等。培養(yǎng)基：誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中CTK多，IAA少。類型（根據(jù)發(fā)育方向）：叢生芽增殖型器官發(fā)生型胚狀體發(fā)生型原球莖發(fā)生型

根、芽胚狀體根、芽愈傷組織芽根

芽外植體試管苗★

原球莖根、芽

外植體成苗途徑根類型方式事例叢生芽增殖型腋芽萌發(fā)，以芽增殖芽，擴(kuò)大繁殖系數(shù)甘蔗、香蕉、香石竹、絲石竹器官發(fā)生型通過脫分化形成愈傷組織，再分化出苗煙草、油菜等胚狀體發(fā)生型從愈傷組織或直接從子葉、下胚軸和花藥培養(yǎng)中產(chǎn)生甘蔗、胡蘿卜、石刁柏等原球莖型由莖尖或腋芽產(chǎn)生原球莖放入培養(yǎng)基中發(fā)育成小植株蘭花球莖芽型葉柄表面產(chǎn)生圓球形小突起（球莖芽），一端出芽一端出根觀葉海棠塊莖型葉片或葉柄上形成粒狀芋塊，進(jìn)一步分化出芽和根花葉芋鱗莖型鱗片近軸面或邊緣直接形成帶根的小鱗莖百合、郁金香、貝母等孢子型用成熟或未成熟的孢子進(jìn)行培養(yǎng)地錢、狼尾蕨等根莖型蕨類具有橫向的莖及直立的短根莖，為組培的最佳外值體腎蕨、裂葉腎蕨、波士頓蕨等微枝扦插型帶芽的小插條在試管內(nèi)進(jìn)行無菌扦插葡萄、楊樹頂芽腋芽叢生芽增殖型Ⅰ微型扦插頂芽CTK刺激帶芽的莖切段側(cè)芽接種培養(yǎng)形成的莖梢節(jié)長，直立向上呈小灌木叢狀獲得較多嫩莖梢莖段培養(yǎng)繼代擴(kuò)繁試管苗生根培養(yǎng)無愈傷組織產(chǎn)生初代繼代叢生芽增殖型Ⅱ器官發(fā)生型Ⅰ脫分化分化愈傷組織芽、芽叢切割芽叢繼代培養(yǎng)大量芽叢試管苗生根培養(yǎng)外植體初代繼代器官發(fā)生型Ⅱ①②愈傷組織培養(yǎng)

愈傷組織具分裂能力的細(xì)胞已分化細(xì)胞脫分化繼代

愈傷組織分裂誘導(dǎo)期

分裂期

分化期愈傷組織誘導(dǎo)◆雙子葉植物>單子葉植物和裸子植物◆

幼年細(xì)胞和組織>成年細(xì)胞和組織◆

二倍體細(xì)胞>單倍體細(xì)胞◆

根據(jù)培養(yǎng)目的選取外植體愈傷組織誘導(dǎo)◆

外植體大小一般為0.5cm的圓柱形或方形塊◆添加植調(diào)劑和天然提取物利于誘導(dǎo)和維持◆生長旺盛的愈傷組織一般呈乳黃色或白色或淺綠色或綠色，老化的多為黃色或褐色脫分化因植物種類、器官及生理狀況有大差異：◆禾谷類植物脫分化較難?！艏?xì)嫩組織脫分化較易；成熟組織較難?！艋ㄆ髅摲只^易；莖葉難。誘導(dǎo)期◆誘導(dǎo)期長短與植物種類、生理狀態(tài)有關(guān)?！粽T導(dǎo)期長短與環(huán)境因素有關(guān)。

母株生長在弱光下的外植體易于誘導(dǎo)，分裂頻率高。

增加O2和迅速釋放CO2利于細(xì)胞分裂?！籼砑又舱{(diào)劑誘導(dǎo)分裂效果好?！艉铣纱x迅速。分裂期特征：細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，缺少有組織的結(jié)構(gòu)，顏色淺而透明。分化期特征：形成瘤狀結(jié)構(gòu)的外表和內(nèi)部分化；出現(xiàn)多種類型的細(xì)胞。石龍芮下胚軸培養(yǎng)產(chǎn)生胚狀體過程體細(xì)胞胚狀體發(fā)生型Ⅰ

外植體愈傷組織小孢子游離單細(xì)胞器官

胚狀體

試管苗體細(xì)胞胚狀體發(fā)生型Ⅱ胚狀體形成植株的特征：1.具兩極性

2.胚狀體的維管組織與外植體的維管組織無解剖結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系

3.胚狀體的維管組織的分布是獨(dú)立的“Y”形

4.數(shù)量多，速度快，結(jié)構(gòu)完整，成苗率高原球莖：縮短的、呈珠粒狀的、由胚性細(xì)胞組成的、類似嫩莖的器官。原球莖發(fā)生型1.初代培養(yǎng)時(shí)外植體發(fā)育途徑有幾條？2.正常的愈傷組織一般為何種顏色？其誘導(dǎo)有何特點(diǎn)？思考題：目的：擴(kuò)繁無根苗（生產(chǎn)上邊擴(kuò)繁邊生根）。擴(kuò)繁方法：以幾何級(jí)數(shù)增加，可切割莖段，分離芽叢、胚狀體、原球莖。培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基或分化培養(yǎng)基實(shí)質(zhì)：增殖培養(yǎng)物。（2）繼代培養(yǎng)（3）壯苗和生根培養(yǎng)◆生根培養(yǎng)基：1／2或1／4MS基本培養(yǎng)基；不加或少加CTK，適量添加NAA；糖濃度1-1.5%?！襞囵B(yǎng)條件：增加光強(qiáng)，達(dá)3000-10000lx?！魤衙?/p>

◆生根方法與途徑①新梢基部浸入50或100ppmIBA液4－8h；②在含IAA類培養(yǎng)基中培養(yǎng)4－6d；③移入含活性碳的生根培養(yǎng)基培養(yǎng)。⑤其它方法④生根困難的則在培養(yǎng)基中搭濾紙橋或按①生根其它方法

延長在增殖培養(yǎng)時(shí)間

降低增殖倍率，減少CTK用量

對(duì)易生根植物，切割粗壯嫩枝在營養(yǎng)缽中直接生根

胚狀體發(fā)育成小苗不經(jīng)生根階段，但需壯苗生根

接種只是完成了離體培養(yǎng)的第一步，植物離體培養(yǎng)和栽培植物一樣，生長過程中也受到各種環(huán)境因素的影響。培養(yǎng)條件是離體培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵。在培養(yǎng)基條件適宜的基礎(chǔ)上，影響試管苗生長的主要因素有光照、溫度、濕度、氧氣。（4）培養(yǎng)條件光照1）光強(qiáng)★影響外植體細(xì)胞的增殖、組織和器官的分化。一般培養(yǎng)室的光照強(qiáng)度要求1000～5000lx?！镉鷤M織的誘導(dǎo)有的在光照下有促進(jìn)作用；光照強(qiáng)，幼苗生長健壯；光照弱，幼苗生長弱小，容易徒長?！锊煌ㄩL的光對(duì)細(xì)胞的分裂和器官的分化有影響。2）光質(zhì)②白光促進(jìn)小花天竺葵愈傷組織的生長，藍(lán)光則無作用。如：①紅光促進(jìn)楊樹愈傷組織的生長，藍(lán)光阻礙其生長。3）光照時(shí)間根據(jù)植物生物學(xué)特性決定；光照長短對(duì)試管內(nèi)花的形成是個(gè)重要影響因素，一般給予周期性光照比較好。多數(shù)植物8-10小時(shí)黑暗為宜。光周期長短因植物種類而異。在胡蘿卜組織培養(yǎng)中隨著日照長度的增加，而促進(jìn)生長。

1）大多數(shù)植物23-32℃，一般控制在25±2oC。低于15

C或高于35

C，對(duì)生長都是不利的。

2）植株種類及外植體的不同，其最適溫度也是不同的。如百合20℃；月季25－27℃；番茄28℃。

△

溫度濕度1）瓶內(nèi)的濕度：一般為100％，主要受到培養(yǎng)基含水量和封口膜透性的影響。如培養(yǎng)基過硬，則不利于外植體接觸和插入培養(yǎng)基，導(dǎo)致生長遲緩；封口膜過于透氣，也會(huì)使瓶內(nèi)濕度下降。

濕度過低會(huì)使培養(yǎng)基喪失大量水分，滲透勢(shì)升高，影響材料對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，也會(huì)阻礙外植體的生長。濕度過高會(huì)造成雜菌滋長，導(dǎo)致大量污染。一般為70－80%。2）環(huán)境濕度：1）培養(yǎng)基適宜pH值5-6.5，一般為5.8，調(diào)整用0.1M的NaOH和HCl溶液。pH值2）ｐH影響培養(yǎng)基的硬度。ｐH＞6.5培養(yǎng)基會(huì)變硬；ｐH＜5.0培養(yǎng)基不易凝固。3）滅菌之前，培養(yǎng)基的pH要比標(biāo)準(zhǔn)提高0.2－0.3個(gè)單位。氣體(必要條件)1）培養(yǎng)瓶內(nèi)氧氣的充足與否與封口材料有關(guān)。可用棉塞或特制的封口塑料。通氣最好的是棉塞，但棉塞易使培養(yǎng)基干燥，夏季易引起污染。2）培養(yǎng)基內(nèi)氧氣充足與否與培養(yǎng)基的種類和培養(yǎng)方式有關(guān)?！艄腆w培養(yǎng)基可加進(jìn)活性炭來增加通氣度,以利于發(fā)根?！粢后w培養(yǎng)時(shí)，可考慮采取振蕩培養(yǎng)的方式，以增加通氣性。

2）２個(gè)大氣壓以上就對(duì)生長有阻礙作用，5～６個(gè)大氣壓生長就完全停止，６個(gè)大氣壓細(xì)胞就不能生存。滲透壓1）1-2個(gè)大氣壓促進(jìn)生長。復(fù)習(xí)思考題：1.繼代培養(yǎng)有何意義？其目的和實(shí)質(zhì)是什么?2.組培苗生根方法有哪些？3.外植體成苗途徑有幾條？四、馴化移栽高溫且恒溫

高濕

弱光

無菌1、試管苗生態(tài)環(huán)境與自然環(huán)境的差異▼

2、試管苗的特點(diǎn)

生長細(xì)弱，角質(zhì)層不發(fā)達(dá)光合作用差葉片氣孔數(shù)少，活性差根吸收功能弱對(duì)逆境的適應(yīng)性和抵抗能力較差3、試管苗的馴化

目的：提高試管苗的適應(yīng)性，促其健壯，最終提高移栽成活率原則：★從溫、光、濕度及有無雜菌等環(huán)境因素考慮?！锺Z化開始數(shù)天內(nèi)，與培養(yǎng)環(huán)境條件相似；后期與預(yù)計(jì)栽培條件相似，逐步適應(yīng)。方法：即煉苗。不開口自然光下2-3天，然后開口1-2天。試管苗的移栽方法Ⅰ

組培馴化移栽常用基質(zhì)組培馴化移栽用穴盤試管苗的移栽方法Ⅱ試管苗的移栽

移栽方法：取出試管苗，全部輕洗去培養(yǎng)基栽入基質(zhì)(事先澆透水)后，栽后輕澆薄水，移入高濕環(huán)境(90%以上)。移栽場(chǎng)所：日光溫室塑料大棚馴化室注意：1.保持小苗水分供需平衡2.防止菌類滋生3.給予一定溫光條件4.注意基質(zhì)配比并保持適當(dāng)?shù)耐庑?）保持小苗水分供需平衡

1周內(nèi)：

環(huán)境高濕，遮光。

1周后：

小苗生長后逐漸降濕，拱棚兩端通風(fēng)。

半個(gè)月后：

揭膜，控水，增加光強(qiáng)。▼

2）防止菌類滋生

◆基質(zhì)高壓滅菌或3h烘烤滅菌或太陽能滅菌?！暨m當(dāng)使用殺菌劑、消毒劑?！粢圃詴r(shí)少傷苗。◆噴水加0.1%尿素或1/2MS大量元素液追肥，加快苗生長。3）給予一定溫光條件

適宜生根溫度：18－20℃，溫度低可加地?zé)峋€。移栽初期弱光，后逐漸加強(qiáng)光照，過渡到自然光照。

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◆保持基質(zhì)通氣性：選顆粒狀基質(zhì)，澆水勿多。4）注意基質(zhì)配比并保持適當(dāng)?shù)耐庑渊?/p>

◆基質(zhì)配比：珍：蛭：草(腐殖土)=1：1：0.5珍：草(腐殖土)=1：1

提高試管苗移栽成活率的途徑？1、壯苗移栽比弱苗移栽成活率高2、生長素（NAA）利于生根3、低無機(jī)鹽濃度生根效果好4、活性炭利于嫩莖生根5、避免太陽直射，溫度25-30℃，濕度在85%以上6、使試管苗逐漸從無菌向有菌過渡組織培養(yǎng)工廠化育苗生產(chǎn)流程簡圖

五、組培快繁計(jì)劃安排與實(shí)施

商業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模的確定應(yīng)以市場(chǎng)需求為標(biāo)準(zhǔn)，否則試管苗難以銷售，造成經(jīng)濟(jì)損失。

外植體的入瓶；器官形成及增殖；試管小植株出瓶等試管苗生產(chǎn)過程均是在無菌條件下進(jìn)行的，因此，試管苗生產(chǎn)規(guī)模可以用無菌工作臺(tái)的數(shù)量來衡量的。1.試管苗生產(chǎn)規(guī)模的確定

一般一個(gè)單人無菌工作臺(tái)可年生產(chǎn)10萬～15萬株苗，一個(gè)1.2m×0.6m×2.0m的6層培養(yǎng)架可年繁殖1.5萬～2萬株試管苗。年產(chǎn)100萬株的組培苗生產(chǎn)工廠，需8～10個(gè)無菌工作臺(tái)，培養(yǎng)架40～50個(gè)。接種室面積應(yīng)為40～50m2，培養(yǎng)室面積則為100～120m2。

培養(yǎng)容器的數(shù)量取決于生產(chǎn)規(guī)模，一個(gè)6層培養(yǎng)架(1.2mX0.6mX2.0m)可放置900個(gè)左右三角瓶或360個(gè)左右蘭花瓶，還需增加10％～15％的周轉(zhuǎn)用培養(yǎng)容器。

馴化室可內(nèi)裝噴灌設(shè)施和可移動(dòng)苗床。每平方米苗床可栽種800株試管苗，一茬苗的過渡周期為30d，年產(chǎn)100萬株苗的過渡培養(yǎng)室，建造面積應(yīng)為400~600m2。2.試管苗增殖率的估算Y=xn年增殖率全年增殖周期數(shù)n=365/每