(高清版)GBT 42366-2023 化學(xué)品 靜水椎實(shí)螺繁殖試驗(yàn)

化學(xué)品靜水椎實(shí)螺繁殖試驗(yàn)2023-03-17發(fā)布國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局 I Ⅱ l2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語(yǔ)、定義和縮略語(yǔ) 4試驗(yàn)原理 25受試物信息 26參比物 37試驗(yàn)準(zhǔn)備 38試驗(yàn)程序 49質(zhì)量保證與質(zhì)量控制 710數(shù)據(jù)處理 7 附錄A(資料性)靜水椎實(shí)螺的馴養(yǎng) 附錄B(資料性)異常卵 附錄C(資料性)時(shí)間-加權(quán)平均值的計(jì)算 附錄D(資料性)飼養(yǎng)液更換，物理化學(xué)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)和喂食數(shù)據(jù)記錄表 附錄E(資料性)靜水椎實(shí)螺繁殖量和存活情況數(shù)據(jù)記錄表 附錄F(資料性)靜水椎實(shí)螺繁殖量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)方法 參考文獻(xiàn) I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本文件由全國(guó)危險(xiǎn)化學(xué)品管理標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC251)提出并歸口。本文件起草單位：廣東省科學(xué)院微生物研究所(廣東省微生物分析檢測(cè)中心)、生態(tài)環(huán)境部固體廢物與化學(xué)品管理技術(shù)中心、中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院、杭州瑞歐科技有限公司、廈門(mén)市格靈生物技術(shù)有限公司、廣東環(huán)境保護(hù)工程職業(yè)學(xué)院、廣東全慶檢測(cè)有限公司、西安凱金哲檢測(cè)有限公司、金久科技有限公司。本文件主要起草人：許玫英、范雪瀅、許玉潔、劉純新、余明喧、梁秋、劉桃妹、竇從從、梅承芳、Ⅱ關(guān)于軟體動(dòng)物毒性測(cè)試的綜述性論文強(qiáng)調(diào)了有必要針對(duì)部分化學(xué)品開(kāi)展水生軟體動(dòng)物繁殖毒性試驗(yàn)，特別強(qiáng)調(diào)了這類(lèi)重要的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)生物的毒性測(cè)試方法的缺失?，F(xiàn)有的繁殖試驗(yàn)方法很少涉及雌雄同體的水生物種。試驗(yàn)的測(cè)試終點(diǎn)是化學(xué)品在28d暴露期間，螺的存活數(shù)和每只螺產(chǎn)出的卵群數(shù)。每個(gè)親本殼長(zhǎng)的增長(zhǎng)量和產(chǎn)卵數(shù)量也可作為附加的測(cè)試終點(diǎn)。如采用本方法對(duì)混合物開(kāi)展測(cè)試并將獲得的數(shù)據(jù)用于監(jiān)管時(shí)，需考慮試驗(yàn)結(jié)果是否充分且有效。如有法規(guī)明確規(guī)定可對(duì)混合物進(jìn)行測(cè)試，則可直接采用本文件。1化學(xué)品靜水椎實(shí)螺繁殖試驗(yàn)1范圍本文件描述了化學(xué)品靜水椎實(shí)螺繁殖試驗(yàn)的試驗(yàn)原理、受試物信息、參比物、試驗(yàn)準(zhǔn)備、試驗(yàn)程序、本文件用于評(píng)價(jià)長(zhǎng)期暴露下化學(xué)品對(duì)雌雄同體的淡水螺靜水椎實(shí)螺(Lymnaeastagnalis)生存和繁殖的潛在影響。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T21801化學(xué)品快速生物降解性呼吸計(jì)量法試驗(yàn)GB/T21802化學(xué)品快速生物降解性改進(jìn)的MITI試驗(yàn)(I)GB/T21803化學(xué)品快速生物降解性DOC消減試驗(yàn)GB/T21831化學(xué)品快速生物降解性密閉瓶法試驗(yàn)GB/T21856化學(xué)品快速生物降解性二氧化碳產(chǎn)生試驗(yàn)GB/T21857化學(xué)品快速生物降解性改進(jìn)的OECD篩選試驗(yàn)3.1術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。x%效應(yīng)濃度x%effectiveconcentration;EC,在給定測(cè)試周期內(nèi)，與對(duì)照組相比，導(dǎo)致靜水椎實(shí)螺繁殖量降低x%時(shí)的受試物濃度。最低可觀察效應(yīng)濃度lowestobservedeffectconcentration;LOEC暴露期間與對(duì)照組相比，對(duì)受試生物產(chǎn)生顯著效應(yīng)(p<0.05)的最低受試物濃度，LOEC以上的所有試驗(yàn)濃度所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)等于或者顯著高于LOEC中所觀察到的毒性效應(yīng)。無(wú)可觀察效應(yīng)濃度noobservedeffectconcentration;NOEC試驗(yàn)中低于LOEC的最高受試物測(cè)試濃度，即在暴露期間與對(duì)照組相比，對(duì)受試生物未產(chǎn)生顯著效應(yīng)(p≥0.05)的受試物濃度。個(gè)體的總觀察期。2生物體的實(shí)際繁殖率。以其繁殖量為試驗(yàn)終點(diǎn)的繁殖成體。28d試驗(yàn)周期內(nèi)，每個(gè)存活親代產(chǎn)生的子代數(shù)量。下列縮略語(yǔ)適用于本文件。TWA:時(shí)間-加權(quán)平均值(TimeWeightedAverage)4試驗(yàn)原理試驗(yàn)主要用于評(píng)估受試物對(duì)靜水椎實(shí)螺繁殖量的影響。將用于繁殖的親螺暴露于一定濃度范圍的受試物中，觀察螺的存活數(shù)和繁殖量，試驗(yàn)周期為28d。椎實(shí)螺需取自無(wú)寄生物的試驗(yàn)環(huán)境，在試驗(yàn)前測(cè)量螺的大小，并放入試驗(yàn)容器中馴養(yǎng)。在添加受試物(測(cè)試的第0d)后，每天在喂食螺時(shí)記錄存活率，并將死螺從試驗(yàn)容器中取出。每周至少2次測(cè)定螺的繁殖量，收集卵群，并計(jì)數(shù)。也可用每個(gè)卵群中的產(chǎn)卵數(shù)以及試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)的殼長(zhǎng)作為附加的測(cè)試終點(diǎn)。試驗(yàn)需記錄存活親螺數(shù)量和每個(gè)試驗(yàn)容器中卵群的數(shù)量。繁殖量反映每個(gè)存活親螺的卵群產(chǎn)量。其他與受試物效應(yīng)相關(guān)的參數(shù)，如每個(gè)存活親螺的產(chǎn)卵數(shù)和生長(zhǎng)情況(殼長(zhǎng))也宜記錄。受試物對(duì)個(gè)體存活天數(shù)內(nèi)每天卵群累積量的毒性效應(yīng)，以EC,表示?？衫没貧w模型估算導(dǎo)致繁殖量出現(xiàn)x%下降時(shí)的受試物濃度。受試物的毒性效應(yīng)也可用NOEC和LOEC表示。同一試驗(yàn)中可同時(shí)得到EC,值、NOEC和LOEC。5受試物信息a)結(jié)構(gòu)式；c)光穩(wěn)定性；d)試驗(yàn)條件下的穩(wěn)定性；e)解離常數(shù)(pK。);f)正辛醇-水分配系數(shù)(Pow);g)按照GB/T21801、GB/T21802、GB/T21803、GB/T21831、GB/T21856、GB/T21857測(cè)定的快速生物降解性；h)水中溶解度；j)受試物在試驗(yàn)溶液中的定量分析方法、方法回收率和定量限。36參比物為確保試驗(yàn)條件的一致性和受試生物的敏感性，測(cè)試中宜設(shè)置參比物試驗(yàn)。已通過(guò)驗(yàn)證的參比物為氯化鎘，其繁殖量EC5值范圍為40μg/L～230μg/L(以Cd計(jì))。7試驗(yàn)準(zhǔn)備7.1儀器設(shè)備與試驗(yàn)溶液直接接觸的容器及其他設(shè)備應(yīng)由玻璃或其他惰性材料制成，常用的儀器設(shè)備包括：a)用于控溫的人工氣候箱、恒溫室或其他適用的設(shè)備；b)用于調(diào)節(jié)光照的設(shè)備和光照強(qiáng)度的測(cè)量設(shè)備；c)溶氧儀調(diào)節(jié)；e)電導(dǎo)率儀；f)用于測(cè)量水硬度的試劑盒或其他適用的設(shè)備；g)用于測(cè)量水中氨氮、亞硝酸鹽和硝酸鹽濃度的試劑盒或其他相關(guān)的設(shè)備；h)1L玻璃容器，可用開(kāi)孔蓋、網(wǎng)或其他器具覆蓋，保證容器的透氣性且能防止螺從容器內(nèi)爬出；i)氣泵、通氣管和巴斯德管；j)氣流調(diào)節(jié)閥；k)數(shù)顯游標(biāo)卡尺；1)刀片或尖勺；m)配有光源的體視顯微鏡(用于卵的計(jì)數(shù));n)用于配制溶液的容量瓶和其他玻璃器皿；o)玻璃滴管。7.2.1受試生物的選擇試驗(yàn)推薦的受試生物為靜水椎實(shí)螺(Lymnaeastagnalis)。試驗(yàn)中所使用的成螺應(yīng)取自同一實(shí)驗(yàn)室在無(wú)寄生物環(huán)境下馴養(yǎng)的群體。靜水椎實(shí)螺的馴養(yǎng)環(huán)境條件(特別是光照和溫度)應(yīng)與試驗(yàn)環(huán)境條件相似(靜水椎實(shí)螺的馴養(yǎng)程序參考附錄A)。野外采集的群體不宜立即用于繁殖試驗(yàn)。7.2.2受試生物的準(zhǔn)備試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，用于試驗(yàn)的靜水椎實(shí)螺殼長(zhǎng)應(yīng)在2.5cm～3.0cm范圍內(nèi)，使用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)量最大殼長(zhǎng)，檢查長(zhǎng)度是否滿(mǎn)足要求。測(cè)量過(guò)程中應(yīng)謹(jǐn)慎操作，不宜破壞殼體，測(cè)量或操作過(guò)程中需注意保護(hù)殼尖。7.3試驗(yàn)用水7.3.1試驗(yàn)用水可使用經(jīng)活性炭過(guò)濾脫氯的自來(lái)水、重組水或其他清潔用水，水質(zhì)需符合7.3.2的要求。不宜使用自來(lái)水，水管中可能含有或釋放金屬銅，銅對(duì)受試生物具有較大毒性作用，不利于實(shí)驗(yàn)室間的結(jié)果比對(duì)。試驗(yàn)用水宜與飼養(yǎng)液保持一致(見(jiàn)附錄A)。試驗(yàn)用水及更換用的水，在使用前的溫度和溶解氧濃度應(yīng)達(dá)到試驗(yàn)要求。47.3.2在試驗(yàn)開(kāi)始及試驗(yàn)期間，水質(zhì)應(yīng)達(dá)到并維持以下要求：a)pH:6.5～8.5;b)溶解氧(對(duì)照組):大于6mg/L,20℃(即大于60%溶解氧飽和度);c)電導(dǎo)率：600μS/cm±200μS/cm;d)硬度：140mg/L～250mg/L(以CaCO?計(jì)),以接近250mg/L為宜。7.4試驗(yàn)溶液7.4.1可通過(guò)稀釋貯備液得到不同濃度的試驗(yàn)溶液。采用振蕩、攪拌、超聲或者其他適用的方法使受試物溶解至試驗(yàn)用水中以獲得貯備液，盡量避免使用助溶劑。對(duì)于難測(cè)試化學(xué)物質(zhì)，可參考國(guó)外關(guān)于難測(cè)試物質(zhì)和混合物水生毒性試驗(yàn)的測(cè)試方法。7.4.2如使用助溶劑配制穩(wěn)定均勻的貯備液，宜盡可能降低助溶劑的最終濃度，且最終濃度不應(yīng)超過(guò)20μL/L。如使用助溶劑，試驗(yàn)應(yīng)增加溶劑對(duì)照組作為陰性對(duì)照。所有試驗(yàn)處理組和溶劑對(duì)照組的助溶劑濃度應(yīng)一致。助溶劑應(yīng)對(duì)試驗(yàn)生物無(wú)任何顯著毒性效應(yīng)。應(yīng)根據(jù)受試物的物理化學(xué)參數(shù)和對(duì)受試生物的敏感性選擇合適的助溶劑，宜通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。8試驗(yàn)程序8.1暴露條件試驗(yàn)周期為28d。8.1.2.1試驗(yàn)開(kāi)始前兩天，往試驗(yàn)容器中注入1L干凈的試驗(yàn)用水，水溫應(yīng)達(dá)到試驗(yàn)要求。使用刷子或平薄的勺子伸入螺體和玻璃的間隙中，收集試驗(yàn)用水中浮動(dòng)或在缸壁爬行的成螺。移動(dòng)螺體時(shí)宜佩戴手套，可不使用其他特定設(shè)備。收集前或收集時(shí)損壞的螺不可用于試驗(yàn)，同時(shí)應(yīng)檢查殼長(zhǎng)是否在2.5cm～3.0cm。每組5只成螺，應(yīng)隨機(jī)分到裝有清潔試驗(yàn)用水和飼料的試驗(yàn)容器中。不同容器間受試生物的平均殼長(zhǎng)不應(yīng)存在顯著差異(使用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行驗(yàn)證)。8.1.2.2在兩天的適應(yīng)期內(nèi)，需確認(rèn)成螺在試驗(yàn)條件下可進(jìn)行繁殖。如未能開(kāi)始繁殖，適應(yīng)期需延長(zhǎng)至2/3以上試驗(yàn)容器中的成螺開(kāi)始繁殖為止(至少觀察到1個(gè)卵群)。適應(yīng)期內(nèi)，每周至少更換2次試驗(yàn)用水，移走并處理產(chǎn)生的卵群。在第0d,根據(jù)卵群產(chǎn)生量進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，將成螺隨機(jī)分配到不同處理組中，以保證試驗(yàn)的均勻性。同時(shí)更換試驗(yàn)用水，添加受試物。8.1.3.1用清水洗凈螺體后，給螺喂食新鮮生菜。推薦采用具備有機(jī)認(rèn)證或同等認(rèn)證品質(zhì)的生菜。宜采用結(jié)球生菜，或其他葉子平滑的生菜品種。螺一般不會(huì)食用葉片的堅(jiān)硬部分。剩余菜葉不宜在試驗(yàn)容器中堆積，這可能會(huì)造成受試物的損失，宜清除。8.1.3.2在試驗(yàn)期內(nèi)，受試生物自由進(jìn)食，宜每個(gè)工作日喂食，或至少在每周2次更換試驗(yàn)用水時(shí)，進(jìn)行喂食。每只成螺每周自由進(jìn)食新鮮生菜量約為3.5g。如螺在兩次喂食期間完全消耗所提供的食物，應(yīng)增加投餌量；如觀察到由受試物導(dǎo)致的受試生物攝食量下降，應(yīng)減少投餌量，以防止食物殘?jiān)姆e累，食物殘?jiān)赡軙?huì)導(dǎo)致氨氮和亞硝酸鹽等有害物質(zhì)的產(chǎn)生。應(yīng)在換水時(shí)從試驗(yàn)容器中取出食物殘?jiān)?。投餌量會(huì)對(duì)繁殖量產(chǎn)生影響，如受試生物攝食量減少，應(yīng)及時(shí)記錄。5試驗(yàn)過(guò)程中，每天光暗比為16h:8h。光源(波長(zhǎng)在天然白光段)應(yīng)安裝在試驗(yàn)容器的上方。試驗(yàn)溶液表面的光照強(qiáng)度范圍為250lx～500lx。試驗(yàn)過(guò)程中，應(yīng)控制試驗(yàn)溶液的溫度為20℃±1℃,可允許在1d～2d內(nèi)出現(xiàn)短暫性溫度偏離，但不應(yīng)超過(guò)±2℃。8.1.6.1通過(guò)玻璃管(巴斯德管)連接氣泵對(duì)試驗(yàn)溶液進(jìn)行曝氣，使用氣流調(diào)氣閥，以確保連續(xù)穩(wěn)定地供氣。8.1.6.2溶解氧飽和度應(yīng)大于60%,宜緩慢通氣以避免受試物的損失。采用開(kāi)孔蓋、網(wǎng)等覆蓋試驗(yàn)容器，可減少受試物的揮發(fā)。8.1.7.1試驗(yàn)一般為半靜態(tài)測(cè)試，每周換水兩次。對(duì)于易揮發(fā)的受試物，可以增加換水頻率以保證受試物的暴露濃度維持在理論濃度的80%以上。靜水椎實(shí)螺同樣也適用于流水式測(cè)試。如為流水式測(cè)試，應(yīng)對(duì)系統(tǒng)(包括流量)進(jìn)行調(diào)整，以滿(mǎn)足試驗(yàn)有效性的要求。8.1.7.2試驗(yàn)至少設(shè)置5個(gè)濃度，每個(gè)濃度6個(gè)平行，每個(gè)平行5只螺(即每個(gè)試驗(yàn)濃度30只螺),試驗(yàn)濃度按幾何級(jí)數(shù)排列，各濃度的間隔系數(shù)不大于3.2。如果試驗(yàn)濃度少于5個(gè)或濃度間隔系數(shù)大于3.2,應(yīng)在報(bào)告中予以說(shuō)明(如根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的濃度效應(yīng)曲線(xiàn)進(jìn)行解釋)。提前了解受試物的毒性(如通過(guò)預(yù)試驗(yàn)),有助于選擇合適的試驗(yàn)濃度。如旨在獲得NOEC,試驗(yàn)濃度應(yīng)包括NOEC的預(yù)期值。如旨在獲得EC,值，無(wú)論x是多少，理想情況下，該濃度應(yīng)包含在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)。8.1.7.3設(shè)計(jì)試驗(yàn)時(shí)，需要考慮試驗(yàn)?zāi)康氖谦@得NOEC/LOEC、EC,值還是在理論模型中其他相關(guān)的試驗(yàn)終點(diǎn)。如旨在獲得NOEC/LOEC,需增設(shè)平行數(shù)。如旨在估算EC,值，則需增設(shè)試驗(yàn)濃度。如有必要，可增設(shè)試驗(yàn)濃度或各濃度的平行數(shù)，以確保有足夠的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。8.1.7.4往試驗(yàn)容器中加入受試物即為試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)間(第0d)。喂食前應(yīng)先加入受試物，往裝有1L試驗(yàn)用水的試驗(yàn)容器中加入適量的貯備液，攪拌均勻，得到一定濃度的試驗(yàn)溶液。或往裝有6L試驗(yàn)用水的容器中加入適量的貯備液，配制一定濃度的試驗(yàn)溶液，攪拌均勻后分裝到不同的試驗(yàn)容器中。預(yù)試驗(yàn)宜采用最優(yōu)方案。暴露條件(包括質(zhì)控要求)應(yīng)與正式試驗(yàn)一致，但預(yù)試驗(yàn)可減少試驗(yàn)濃度的設(shè)置、增加相鄰濃度間隔系數(shù)、各處理組的平行數(shù)可減少至4個(gè)或縮短試驗(yàn)周期。如預(yù)試驗(yàn)觀察到最高濃度組無(wú)顯著毒性效應(yīng)，或已知受試物對(duì)其他生物無(wú)毒性，或攝入量低時(shí)，該受試物極可能屬于低毒或無(wú)毒物質(zhì)，此時(shí)宜開(kāi)展限度試驗(yàn)。限度試驗(yàn)設(shè)有1個(gè)處理組(10mg/L濃度處理組或最大水溶解度處理組)和1個(gè)對(duì)照組。處理組和對(duì)照組各設(shè)置10個(gè)平行。限度試驗(yàn)說(shuō)明在極限濃度下受試物對(duì)受試生物無(wú)顯著效應(yīng)，如受試物對(duì)個(gè)體存活天數(shù)內(nèi)每天產(chǎn)生的卵群數(shù)存在顯著影響，則需開(kāi)展正式試驗(yàn)。對(duì)照組(不含受試物)至少設(shè)置6個(gè)平行。如配制受試物貯備液時(shí)使用了助溶劑，則需增設(shè)至少66個(gè)溶劑對(duì)照平行，且濃度與處理組的助溶劑濃度一致。如為限度試驗(yàn)，對(duì)照組平行數(shù)應(yīng)增加至10個(gè)。8.1.11試驗(yàn)溶液的更換8.1.11.1對(duì)于半靜態(tài)暴露體系，各試驗(yàn)容器中的溶液至少每周更換2次，以保證暴露濃度在理論濃度的80%以上，同時(shí)保證兩次連續(xù)換水周期之間維持一定的水質(zhì)理化參數(shù)。如受試物可快速降解，更換頻率宜增加至每周3次。降解速率可通過(guò)前期穩(wěn)定性試驗(yàn)或受試物的理化參數(shù)獲取。選擇更換時(shí)間點(diǎn)時(shí)，需保證兩次連續(xù)更換時(shí)間間隔相同(如在星期一早上和星期四下午，兩次更換的間隔均為3.5d)。8.1.11.2試驗(yàn)溶液更換可參考以下流程：將溶液從試驗(yàn)容器中緩慢抽出，避免螺在試驗(yàn)容器中翻滾導(dǎo)致殼體損壞。用篩網(wǎng)收集在缸壁和食物殘?jiān)械挠H螺，檢查殘?jiān)惺欠裼新讶汉?，清理殘?jiān)?。用布清理試?yàn)容器中的糞便、食物殘?jiān)蜕锬ぃ蚋鼡Q干凈的容器。往試驗(yàn)容器重新注入達(dá)到溫度要求的試驗(yàn)用水后，迅速加入受試物貯備液，攪拌均勻，并將螺放回試驗(yàn)容器中。完成上述步驟后，給螺投喂食8.2試驗(yàn)觀察宜在每天喂食時(shí)進(jìn)行觀察，每周至少觀察2次，記錄螺的異常行為(如浮出水面、厭食、聚集、嗜睡、收縮反射遲鈍、同類(lèi)相食)。8.3死亡率測(cè)量8.3.1死螺很容易辨認(rèn)，它們會(huì)有將螺足伸出殼外的異常行為，可能伴有難聞的氣味。死螺會(huì)失去收縮反射能力，當(dāng)用鈍針刺激螺足時(shí)沒(méi)有反應(yīng)即可認(rèn)定為死亡。8.4繁殖量測(cè)量更換試驗(yàn)溶液時(shí)，記錄每個(gè)平行產(chǎn)生的卵群數(shù)量，每周至少2次。用刀片或尖勺小心地將卵群從缸壁上移走并計(jì)數(shù)。如旨在以產(chǎn)卵數(shù)作為附加的測(cè)試終點(diǎn)，需統(tǒng)計(jì)每個(gè)卵群的產(chǎn)卵數(shù)和異常卵出現(xiàn)的頻次(異常卵的描述見(jiàn)附錄B)。將卵群放到培養(yǎng)皿中(或其他適用的容器，如6孔板),用立體顯微鏡進(jìn)行觀察并計(jì)數(shù)，記錄每個(gè)卵群的產(chǎn)卵數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)束后，速凍處死卵群。8.5生長(zhǎng)量測(cè)量8.5.1如旨在以生長(zhǎng)量作為附加的測(cè)試終點(diǎn)，需使用數(shù)字游標(biāo)卡尺測(cè)定成螺殼長(zhǎng)。計(jì)算處理組和對(duì)照組在試驗(yàn)開(kāi)始和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)殼長(zhǎng)的平均生長(zhǎng)量。8.5.2測(cè)定螺的生長(zhǎng)量后，如沒(méi)有其他測(cè)試終點(diǎn)(如組織病理學(xué)),試驗(yàn)后的成螺宜通過(guò)一80℃速凍或長(zhǎng)期冷凍的方式處死。8.6.1受試物的濃度8.6.1.1試驗(yàn)期間，應(yīng)定期測(cè)定受試物濃度。結(jié)果一般采用實(shí)測(cè)濃度，如整個(gè)測(cè)試過(guò)程中，試驗(yàn)溶液受試物濃度均達(dá)到理論濃度的±20%范圍內(nèi)，則結(jié)果既可使用理論濃度表示，也可使用實(shí)測(cè)濃度表示。8.6.1.2試驗(yàn)開(kāi)始第一周內(nèi)更換溶液時(shí)(最好在加入受試物貯備液后的第1個(gè)小時(shí)內(nèi)),至少測(cè)定1次最高濃度和最低濃度試驗(yàn)處理組中新、舊試驗(yàn)溶液的濃度。宜將組內(nèi)各平行的試驗(yàn)溶液混合后測(cè)定。此后每周測(cè)定1次。8.6.1.3當(dāng)受試物濃度不在理論濃度的±20%范圍內(nèi)，應(yīng)在更換溶液后分析所有處理組的新、舊溶液。7此時(shí)，結(jié)果應(yīng)采用平均實(shí)測(cè)濃度或時(shí)間-加權(quán)平均濃度來(lái)表示(見(jiàn)附錄C)。8.6.1.4如受試物濃度分析所需樣品體積較多，且取樣時(shí)易對(duì)試驗(yàn)系統(tǒng)產(chǎn)生影響，應(yīng)增設(shè)相同處理的試驗(yàn)平行(包含受試生物)專(zhuān)門(mén)用于分析測(cè)試，此平行不進(jìn)行生物學(xué)觀察。8.6.2物理化學(xué)參數(shù)更換溶液前后，每個(gè)處理組選取一個(gè)平行，使用儀器設(shè)備測(cè)量新、舊溶液的pH、溶解氧濃度和溫度。試驗(yàn)開(kāi)始和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)至少測(cè)定對(duì)照組和最高濃度處理組中一個(gè)平行的硬度。硬度會(huì)影響離子化合物的毒性，對(duì)于此類(lèi)化合物的測(cè)試，應(yīng)在試驗(yàn)開(kāi)始、中期和結(jié)束時(shí)測(cè)定水的硬度。當(dāng)在對(duì)照組或最低濃度處理組的一個(gè)平行中發(fā)現(xiàn)較高死亡率時(shí)，應(yīng)測(cè)定溶液中氨氮、亞硝酸鹽和硝酸鹽的濃度。用表格記錄所有理化參數(shù)值(示例見(jiàn)附錄D)。9質(zhì)量保證與質(zhì)量控制如果滿(mǎn)足以下條件，試驗(yàn)結(jié)果有效：a)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)照組中所有平行的平均死亡率不能超過(guò)20%;b)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)照組每只親螺個(gè)體存活天數(shù)內(nèi)所產(chǎn)的卵群數(shù)不少于4個(gè)；c)試驗(yàn)期間溶解氧飽和度不低于60%;d)試驗(yàn)期間水溫應(yīng)維持在20℃±1℃,允許水溫出現(xiàn)短暫(1d～2d)的偏離，但不應(yīng)超過(guò)±2℃。10數(shù)據(jù)處理10.1結(jié)果處理10.1.1本試驗(yàn)的目的是確定受試物對(duì)靜水椎實(shí)螺繁殖量的影響。應(yīng)使用表格記錄親螺的存活率和每個(gè)試驗(yàn)容器產(chǎn)生的卵群數(shù)量(示例見(jiàn)附錄E)。其他負(fù)面效應(yīng)如喂食或生長(zhǎng)方式的改變、異常行為以及與毒理相關(guān)的關(guān)鍵變化，也應(yīng)記錄在最終報(bào)告中。10.1.2繁殖量應(yīng)反映每只存活親螺在試驗(yàn)期間(28d)卵群的產(chǎn)量。對(duì)于任一平行，卵群繁殖量的計(jì)算方法是：將某一試驗(yàn)容器在28d內(nèi)收集的卵群總數(shù)除以該試驗(yàn)容器的NID值(見(jiàn)附錄F)。10.1.3如必要，可分析其他與受試物相關(guān)的效應(yīng)，如每只存活親螺的產(chǎn)卵數(shù)和平均生長(zhǎng)量。對(duì)于任一平行，卵繁殖量的計(jì)算方法是：將某一試驗(yàn)容器在28d內(nèi)收集的總卵數(shù)除以該試驗(yàn)容器的NID(見(jiàn)附錄F)。10.1.4如試驗(yàn)中同時(shí)包含空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組，且它們之間沒(méi)有顯著差異，可將兩個(gè)對(duì)照組合并。當(dāng)監(jiān)管部門(mén)有相關(guān)要求時(shí)，可只采用溶劑對(duì)照組數(shù)據(jù)。10.2.1采用統(tǒng)計(jì)方法對(duì)個(gè)體存活天數(shù)內(nèi)每天產(chǎn)生的卵群(或卵數(shù))進(jìn)行擬合和回歸分析得到EC,值及置信上下限。本試驗(yàn)推薦使用在靜水椎實(shí)螺繁殖試驗(yàn)驗(yàn)證過(guò)程中開(kāi)發(fā)的軟件(詳細(xì)信息見(jiàn)附錄F)。10.2.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)能得出EC??值、NOEC值和LOEC值，還可得出EC值或EC20值，但應(yīng)通過(guò)結(jié)果的95%置信區(qū)間范圍檢查所得結(jié)果的可信性和生物學(xué)相關(guān)性。應(yīng)選擇適宜的試驗(yàn)濃度，當(dāng)設(shè)置的試驗(yàn)濃度范圍包含EC5值時(shí)，可能得不到準(zhǔn)確的EC值或EC?0值，所得的EC值或EC2o值可能是由最低濃度值外推所得的估算值。當(dāng)設(shè)置的試驗(yàn)濃度范圍包含EC。值或EC?o值時(shí)，可能得不到準(zhǔn)確的ECs值，所得的EC5?值可能是由最高濃度值外推所得的估算值。10.3.1如要確定NOEC或LOEC,應(yīng)根據(jù)相關(guān)的文獻(xiàn)選擇合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行分析。通常采用單8邊假設(shè)檢驗(yàn)(p<0.05)研究與對(duì)照組相比受試物產(chǎn)生的有害效應(yīng)。10.3.2建議采用遞減趨勢(shì)檢驗(yàn)，以確定對(duì)照組和各處理組之間是否存在顯著差異(p<0.05)。使用參數(shù)檢驗(yàn)(如Williams’檢驗(yàn))或非參數(shù)檢驗(yàn)(如Jonckheere-Terpstra趨勢(shì)檢驗(yàn))對(duì)個(gè)體存活天數(shù)內(nèi)每天產(chǎn)生的卵群數(shù)量進(jìn)行比較，以確定NOEC和LOEC。計(jì)算NOEC時(shí)，平行的卵群數(shù)量或卵數(shù)。計(jì)算可使用R軟件或其他以R軟件為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的軟件(見(jiàn)附錄F)。測(cè)試報(bào)告應(yīng)包括以下內(nèi)容。a)受試物：1)單組分物質(zhì)：物理性狀、水溶解度以及其他相關(guān)的物理化學(xué)性質(zhì)；化學(xué)特性鑒定，如提供雜質(zhì)的化學(xué)鑒別信息(必要時(shí)包括有機(jī)碳含量)。2)多組分物質(zhì)、不明復(fù)雜物質(zhì)(UVCB)和混合物：宜盡可能提供各組分的化學(xué)鑒別信息(同單組分物質(zhì))、含量和相關(guān)的物理化學(xué)特性。3)合適的受試物定量分析方法。b)受試生物：學(xué)名、供應(yīng)商/來(lái)源和飼養(yǎng)條件。c)試驗(yàn)條件：1)采用的試驗(yàn)體系(如半靜態(tài)或流水式、體積、每升試驗(yàn)溶液中螺的數(shù)量);2)光照周期和光照強(qiáng)度；3)試驗(yàn)設(shè)計(jì)(如使用的試驗(yàn)濃度、平行的數(shù)量和每個(gè)平行中螺的數(shù)量等);4)試驗(yàn)溶液的水質(zhì)指標(biāo)(即pH、電導(dǎo)率、溫度、溶解氧濃度、硬度、氨氮濃度以及其他測(cè)試指標(biāo));5)飼喂的詳細(xì)信息(例如食物的類(lèi)型、來(lái)源、投餌量和投餌頻率);6)試驗(yàn)貯備液的配制方法和更換頻率(如使用助溶劑，應(yīng)給出濃度)。1)與受試物穩(wěn)定性相關(guān)的所有預(yù)試驗(yàn)結(jié)果。2)各試驗(yàn)組的理論濃度和各試驗(yàn)容器中受試物的所有實(shí)測(cè)濃度結(jié)果；分析方法的回收率、重復(fù)性和檢出限也應(yīng)報(bào)告。3)試驗(yàn)溶液的水質(zhì)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果(即pH、溫度、溶解氧濃度、硬度和氨氮濃度，見(jiàn)附錄D的范例表格)。4)試驗(yàn)過(guò)程中親螺死亡數(shù)和死亡時(shí)間(表格示例見(jiàn)附錄E)。5)試驗(yàn)過(guò)程各平行產(chǎn)生卵群數(shù)的完整記錄(表格示例見(jiàn)附錄E)。6)繪制各平行個(gè)體存活天數(shù)內(nèi)每天產(chǎn)生卵群總數(shù)與受試物濃度的效應(yīng)圖。7)如適用，應(yīng)報(bào)告繁殖量的LOEC和NOEC,包括采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的描述和預(yù)判毒性效應(yīng)范圍的依據(jù)(應(yīng)在試驗(yàn)開(kāi)始前進(jìn)行全面分析);如適用，報(bào)告親螺死亡率的LOEC和NOEC。8)如適用，繁殖量的EC,值和置信區(qū)間(如95%)以及適用的曲線(xiàn)模型；濃度-效應(yīng)曲線(xiàn)的斜率及置信區(qū)間。9)其他可觀察或測(cè)定的生物學(xué)效應(yīng)：各卵群的產(chǎn)卵數(shù)、卵群中異常卵的比例、螺生長(zhǎng)量、異常行為，并加以合理的解釋。10)對(duì)本文件偏離的解釋說(shuō)明。9(資料性)靜水椎實(shí)螺的馴養(yǎng)A.1概述本附錄描述了淡水螺靜水椎實(shí)螺(大池塘蝸牛)的實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)程序。通過(guò)馴養(yǎng)可提供滿(mǎn)足全年試驗(yàn)需求的親螺，使螺達(dá)到理想的健康狀態(tài)并保持對(duì)參比物的高敏感度。親螺體內(nèi)無(wú)寄生物，低死亡率，且能夠全年繁殖?？刹捎帽靖戒浰龇椒?，適當(dāng)控制飼喂、光照周期和群體密度以培養(yǎng)合格的親螺。A.2受試生物A.2.1分類(lèi)要體現(xiàn)在殼的形狀和顏色上。A.2.2生活習(xí)性靜水椎實(shí)螺常見(jiàn)于歐洲、亞洲北部和北美地區(qū)。它主要棲息在靜水或緩流的淡水水域內(nèi)，且群體密度較低。靜水椎實(shí)螺主要以水生植物為食，隨著體型大小不同，螺的攝食量也隨之改變。幼體大多以植物碎屑為食，而成體則以植物體和植物殘?bào)w為食。幼體和成體也以微藻、著生生物、細(xì)菌為食，偶爾以小型無(wú)脊椎動(dòng)物殘?bào)w(包括同類(lèi))為食。A.2.3生物學(xué)特性靜水椎實(shí)螺的野外壽命為一至兩年，取決于環(huán)境條件。成體平均殼長(zhǎng)范圍為2cm～6cm(從殼尖至螺口的下邊緣，見(jiàn)圖A.1)。靜水椎實(shí)螺是雌雄同體生物，但雄性生殖器官早于雌性生殖器官發(fā)育成熟(雄性先熟雌雄同體)。在交配過(guò)程中，個(gè)體的性角色不可轉(zhuǎn)換。如其他有肺目動(dòng)物一樣，它能自我受精，且較少表現(xiàn)出近親交配衰退的現(xiàn)象。最常見(jiàn)的生殖方式為異體受精。交配后，螺可以將精子儲(chǔ)存一至三個(gè)月。一般在初夏進(jìn)行繁殖，此時(shí)卵群常在水生植物上堆積。根據(jù)成體大小，每個(gè)卵群的產(chǎn)卵數(shù)可到50個(gè)～120個(gè)不等。在未受污染的水體中，孵化率一般在70%以上。胚胎發(fā)育時(shí)間通常為10d~30d,這取決于卵群中卵的數(shù)量和環(huán)境條件。A.2.4實(shí)驗(yàn)室特性螺的實(shí)驗(yàn)室壽命預(yù)期也為一至兩年，殼長(zhǎng)為3cm～4cm(從殼尖至螺口的下邊緣，見(jiàn)圖A.1)。全年均可繁殖，但2月～3月繁殖力存在季節(jié)性下降。研究表明更換水體是產(chǎn)卵的觸發(fā)因素。卵群常堆積在飼養(yǎng)缸面上。使用立體顯微鏡可以很容易地觀察透明卵群中的胚胎(每個(gè)卵群20個(gè)～160個(gè)，取決于成體大小),同時(shí)可區(qū)分胚胎的4個(gè)連續(xù)發(fā)育階段。28d后，卵的孵化率一般達(dá)到90%以上。圖A.1靜水椎實(shí)螺殼長(zhǎng)測(cè)量點(diǎn)A.3設(shè)備A.3.1飼養(yǎng)缸及輔助設(shè)備可使用以下設(shè)備：a)人工氣候箱或有溫度監(jiān)控的恒溫室；b)飼養(yǎng)缸(5L和35L～50L,玻璃材質(zhì));c)水過(guò)濾裝置(配備陶瓷環(huán)、粗砂、海扇殼和/或珊瑚碎片，或使用商業(yè)濾芯);d)水泵；f)彈性通氣管(帶玻璃吸管);g)溫度、電導(dǎo)率、溶解氧濃度和pH的測(cè)量電極；h)用于測(cè)定水中氨氮、亞硝酸鹽和硝酸鹽濃度的儀器設(shè)備或試劑盒；i)用于測(cè)定硬度的儀器設(shè)備；j)數(shù)顯游標(biāo)卡尺；k)刀片或尖勺。注：過(guò)濾器(生物材料制備或商業(yè)產(chǎn)品)和其他用于培養(yǎng)的塑料材料不宜滲出增塑劑和其他化合物。不宜使用PVC材料。A.3.2水處理劑及產(chǎn)品如果使用自來(lái)水，需在使用前用活性炭過(guò)濾并進(jìn)行脫氯處理，還可使用硬度適中(約250mg/L,以CaCO?計(jì))的重組水。飼養(yǎng)液制備方法見(jiàn)表A.1。表A.1飼養(yǎng)液的制備方法貯備液(單一成分)每升飼養(yǎng)液"中各貯備液的添加量mL成分每升水“中的添加量/g氯化鈣(CaCl?·2H?O)硫酸鎂(MgSO?·7H?O)4.93碳酸氫鈉(NaHCO?)2.59氯化鉀(KCl)0.23可使用電導(dǎo)率不超過(guò)10μS/cm的去離子水、蒸餾水或反滲水等純度較高的水。A.3.3生物A.3.3.1用于馴養(yǎng)的親螺可從現(xiàn)有系統(tǒng)中獲得，也可以從野外獲取。如從現(xiàn)有的培養(yǎng)系統(tǒng)中獲得，每個(gè)飼養(yǎng)缸內(nèi)至少要放置10個(gè)卵群。如果從野外群體中獲取，需尋找一個(gè)沒(méi)有污染、群體密度大的采集點(diǎn)。值得關(guān)注的是，不同的野外螺種可能繁殖能力也有所不同，至少使用30只野生親螺。據(jù)記載，野生捕獲的靜水椎實(shí)螺寄生物侵染率很高。感染寄生物(主要是尾蚴、吸蟲(chóng)、絳蟲(chóng)、原蟲(chóng)和扇形蟲(chóng))的螺可引發(fā)疾病。因此，應(yīng)至少解剖20只螺并用立體顯微鏡觀察螺的消化道和全長(zhǎng)矢狀切片來(lái)檢查體內(nèi)是否存在寄生物，受感染的群體需予以剔除。如未發(fā)現(xiàn)寄生物，親螺需在培養(yǎng)條件下隔離至少30d。實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)是從第二代開(kāi)始的。A.3.3.2卵群在孵化前置于溫度為20℃的1L～5L飼養(yǎng)缸中培養(yǎng)，孵化一般在產(chǎn)卵10d后開(kāi)始。新生螺有爬出水面進(jìn)行呼吸的特性，幼螺容易附在缸壁上干涸死亡。因此，在第一個(gè)月內(nèi)新生螺預(yù)計(jì)會(huì)有約50%的損失。降低飼養(yǎng)缸高度，并在水面上放置生菜葉使新生螺能夠躲藏和攝食，有利于減少損失。當(dāng)逃逸行為不再發(fā)生時(shí)(約在孵化后3周),將幼螺以100只～120只為組轉(zhuǎn)移到35L的飼養(yǎng)缸中。A.4.1溫度和光照條件靜水椎實(shí)螺在水溫恒定在20℃±2℃,光暗比為16h:8h,然白光段)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。光照強(qiáng)度為250lx～500lx(波長(zhǎng)在天A.4.2飼養(yǎng)液可使用脫氯自來(lái)水或重組水。水質(zhì)示例可參考表A.1和國(guó)外的相關(guān)文獻(xiàn)，飼養(yǎng)液水質(zhì)需滿(mǎn)足以下要求：b)pH:7～8.5;c)溶解氧濃度：大于6mg/L,20℃(即大于60%溶解氧飽和度);e)硬度：約250mg/L,以CaCO?計(jì)。在使用飼養(yǎng)液前，需檢查上述參數(shù)的符合性。A.4.3食物和飼喂A.4.3.1螺一般喂食生菜(具備有機(jī)認(rèn)證或同等認(rèn)證，并在清水中洗凈)。如有需要，可添加輔食以提高生長(zhǎng)速度，如商業(yè)魚(yú)糜。在每個(gè)飼養(yǎng)缸底中鋪一層薄的珊瑚砂，可促進(jìn)螺的消化并有助于pH值維持在要求的范圍內(nèi)。擇投餌量以確保在毒性試驗(yàn)開(kāi)始前試驗(yàn)生物已達(dá)到適當(dāng)?shù)陌l(fā)育階段和大小。毒性試驗(yàn)開(kāi)始前至少兩周A.4.3.3每周每100只螺投餌量至少為160g新鮮生菜，每100只成螺每周自由攝食量預(yù)計(jì)約320g。A.4.3.4可用商用飼料或不含激素的專(zhuān)用食材進(jìn)行飼喂。以某商用飼料為例，每100只1.5cm幼螺每周的自由攝食量相當(dāng)于7g薄片。每100只成螺每周的自由攝食量為70g～100g薄片。如食物顆粒殘?jiān)诟椎锥逊e，需進(jìn)行清除(至少在喂養(yǎng)后6h),以減少細(xì)菌和真菌的滋長(zhǎng)。如果由于食物殘?jiān)癄€A.5操作規(guī)程A.5.1群體密度一般來(lái)說(shuō)，密度為每35L飼養(yǎng)缸中飼養(yǎng)100只～120只成螺。為促進(jìn)螺生長(zhǎng)至適當(dāng)?shù)陌l(fā)育階段和大小，可對(duì)群體密度進(jìn)行調(diào)整，以便進(jìn)行毒性試驗(yàn)。但調(diào)整后的密度不宜大于每升5只成螺。A.5.2清潔和養(yǎng)護(hù)A.5.2.1應(yīng)對(duì)所有飼養(yǎng)缸的溫度、pH、溶解氧濃度和電導(dǎo)率進(jìn)行監(jiān)控。如有必要(如新安裝的飼養(yǎng)缸、水質(zhì)異?；蚵莸男袨楫惓?,宜加測(cè)氨氮和硝酸鹽濃度以及硬度。在測(cè)量下一個(gè)飼養(yǎng)缸前，需徹底清洗電極，以防止疾病或病原體的潛在傳播。如發(fā)現(xiàn)有死螺，需要立即移除。A.5.2.2如給螺喂食生菜，飼養(yǎng)液需每周更換1次；如喂食魚(yú)糜，則每周更換3次。使用虹吸管等用具將飼養(yǎng)缸中1/3的水替換為儲(chǔ)水池中新鮮的水，虹吸管在用于下一個(gè)飼養(yǎng)缸前需徹底清潔。A.5.2.3同時(shí)，需移除缸中的碎屑(尤其是食物殘?jiān)?以及成螺產(chǎn)在缸壁上的卵群。用刀片小心移走缸壁上的卵群，然后用虹吸管收集。A.5.2.4更換飼養(yǎng)液前，應(yīng)先測(cè)定儲(chǔ)水池中水的溫度、pH、溶解氧濃度和電導(dǎo)率。更換飼養(yǎng)液后，如觀察到許多螺有脫殼現(xiàn)象，可最多加入1mL碳酸鈣飽和溶液到每個(gè)缸中，以保持殼的生長(zhǎng)。清洗過(guò)程A.5.2.5每6周～8周徹底清洗飼養(yǎng)缸和過(guò)濾泵。根據(jù)濾料的清潔度，可清洗濾料或者替換不超過(guò)2/3A.5.3疾病和死亡A.5.3.2在喂食時(shí)檢查飼養(yǎng)缸的情況，觀察繁殖環(huán)境(如細(xì)菌或真菌滋長(zhǎng))、生物體行為和健康狀況是否存在異常(如爬出水面、聚集、收縮反射遲鈍、同類(lèi)相食)。操作時(shí)可能會(huì)使螺爬出水面，當(dāng)感受到水面擾動(dòng)或移出水缸時(shí)，螺會(huì)排出空氣或血淋巴。聚集和偶然的同類(lèi)相食行為大多發(fā)生在大批量養(yǎng)殖的過(guò)程中，這些行為不代表螺健康狀況不佳。收縮反射遲鈍以及對(duì)刺激無(wú)感知?jiǎng)t表明螺即將死亡。這些癥狀一般僅會(huì)影響少數(shù)個(gè)體，發(fā)現(xiàn)時(shí)應(yīng)及時(shí)從群體中移出。如這些癥狀在飼養(yǎng)缸中頻繁發(fā)生，或發(fā)現(xiàn)回避水面的行為時(shí)，該飼養(yǎng)缸應(yīng)整體移除。A.5.3.3每周1次移除飼養(yǎng)缸中的死螺。如發(fā)現(xiàn)異常的高死亡率(死亡率高達(dá)養(yǎng)殖總數(shù)的15%且延續(xù)時(shí)間超過(guò)15d),應(yīng)舍棄整個(gè)飼養(yǎng)缸中的螺。在舍棄前，用過(guò)量的麻醉劑將螺處死(如暴露在2.5%MgCl?溶液中24h),然后徹底清潔和消毒該飼養(yǎng)缸及其他器具。A.5.4馴養(yǎng)群體繁殖能力的監(jiān)控為確保馴養(yǎng)群體的成功繁殖，需對(duì)年繁殖周期和馴養(yǎng)后成螺的繁殖能力進(jìn)行定期監(jiān)控，按照以下步驟進(jìn)行：a)從水中浮動(dòng)或缸壁爬行的螺中仔細(xì)挑選出20只大小相同的螺；b)用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)量殼長(zhǎng)，然后對(duì)螺進(jìn)行分組，每組5只；c)至少準(zhǔn)備5個(gè)玻璃容器，分別往其中注入1L試驗(yàn)用水；d)使用刀片或尖勺將3d培養(yǎng)期內(nèi)產(chǎn)生的卵群從容器中移出并計(jì)數(shù)。使用立體顯微鏡計(jì)算每個(gè)卵群的卵數(shù)，數(shù)據(jù)記錄表格中；e)根據(jù)以上數(shù)據(jù)計(jì)算每只螺的產(chǎn)卵數(shù)，如存在死亡，同時(shí)計(jì)算死亡率；f)計(jì)算容器中各測(cè)試終點(diǎn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差；g)使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)每只螺的產(chǎn)卵數(shù)和殼長(zhǎng)進(jìn)行評(píng)估，產(chǎn)卵數(shù)和殼長(zhǎng)可作為附加的測(cè)試終點(diǎn)。A.5.5馴養(yǎng)群體的維持A.5.5.1宜定期更換群體，以避免單個(gè)飼養(yǎng)缸中混雜螺齡差異較大的螺或持續(xù)養(yǎng)殖生殖能力較低的成螺(螺齡超過(guò)18個(gè)月)。替換的幼螺可由被替換的成螺繁殖獲得。所有飼養(yǎng)缸中產(chǎn)生的卵群，合并到一個(gè)5L的孵化池中孵化。新飼養(yǎng)缸中的群體按A.3.3的步驟開(kāi)始新一輪馴養(yǎng)。A.5.5.2宜定期(一年1次)引進(jìn)新的基因資源進(jìn)入馴養(yǎng)群體中，取自其他培養(yǎng)環(huán)境或野外采集至少30只螺，在隔離區(qū)進(jìn)行繁殖后，將繁殖出的第二代與原養(yǎng)殖群體合并(見(jiàn)A.3.3)。此時(shí)，為了保證基因特性的充分融合，新產(chǎn)出的后代需與原成螺所產(chǎn)后代進(jìn)行混合。GB/T42366—2023(資料性)異常卵卵的質(zhì)量可通過(guò)統(tǒng)計(jì)4種異常卵出現(xiàn)的頻率來(lái)評(píng)估：多胚卵(一個(gè)卵中出現(xiàn)多個(gè)胚胎);未受精卵(卵中缺少胚胎，只有卵膜和胚乳);胚乳萎縮卵(卵膜破損，胚乳質(zhì)量低);單一胚細(xì)胞(胚胎不生長(zhǎng)，沒(méi)有卵膜及胚乳)。靜水椎實(shí)螺中觀察到的異常卵見(jiàn)圖B.1。標(biāo)引符號(hào)說(shuō)明：A——正常卵；B—-多胚卵；C——未受精卵；D——胚乳萎縮卵；E——單一胚細(xì)胞。圖B.1靜水椎實(shí)螺中觀察到的異常卵(資料性)時(shí)間-加權(quán)平均值的計(jì)算在一個(gè)測(cè)量周期內(nèi)[t;;t;+i],如受試物濃度在更換試驗(yàn)用水期間呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(t?,t?,t?),以生物學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)為基礎(chǔ)，選擇某個(gè)濃度作為親螺暴露濃度范圍的代表。如繁殖受峰值濃度影響較大，宜采用最大濃度。如認(rèn)為受試物的累積和長(zhǎng)期效應(yīng)更為重要，則宜采用平均濃度。由于時(shí)間-加權(quán)平均值考慮了瞬時(shí)濃度隨時(shí)間的變化，因此平均濃度宜采用時(shí)間-加權(quán)平均濃度，示例見(jiàn)圖C.1。注3:水平虛線(xiàn)代表計(jì)算得到的時(shí)間-加權(quán)平均值。圖C.1時(shí)間-加權(quán)平均值示例計(jì)算時(shí)間-加權(quán)平均值的主要假設(shè)前提為兩個(gè)測(cè)試時(shí)間點(diǎn)內(nèi)(t;與t;+?)濃度的下降符合指數(shù)衰減，可按式(C.1)計(jì)算。C(t)=c;e*(-)t∈[t?;t+i]………(C.1)式中：c;——某個(gè)時(shí)間點(diǎn)的實(shí)測(cè)濃度，當(dāng)c;等于C(t;)即為時(shí)間點(diǎn)t;的實(shí)測(cè)濃度，單位為微克升(μg/L);k——t;和t+?時(shí)間內(nèi)的衰減強(qiáng)度。當(dāng)式(C.1)中t=t+1時(shí)，C+1=c;e-k;(t+1-;………式(C.2)經(jīng)變換后可得到式(C.3)。因時(shí)間-加權(quán)平均值下的面積與濃度曲線(xiàn)下的面積相等(見(jiàn)圖C.1),可經(jīng)計(jì)算得到時(shí)間-加權(quán)平均值。在單個(gè)周期[t;;t;+1],指數(shù)曲線(xiàn)下的面積可通過(guò)式(C.4)計(jì)算。式(C.4)換算后可得式(C.5)。經(jīng)式(C.5)中代入式(C.3),可得式(C.6)。GB/T42366—2023式中：A;——更換周期i指數(shù)曲線(xiàn)下的面積；t+i-t;——更換周期內(nèi)的天數(shù)，單位為天(d);c;——更換周期i開(kāi)始時(shí)測(cè)定的濃度，單位為微克升(μg/L)c?+1——更換周期i結(jié)束時(shí)測(cè)定的濃度，單位為微克升(μg/L)lnc;——濃度c;的自然對(duì)數(shù)；lnc;+?——濃度c;+i的自然對(duì)數(shù)?！?C.7)式中：TWA——時(shí)間-加權(quán)平均值，單位為微克每升(μg/L);Z"=1A——指數(shù)曲線(xiàn)下的總面積；Zγ=?(t+i-t;)——總天數(shù)，單位為天(d);n——更換的周期數(shù)。表C.1為時(shí)間-加權(quán)平均值計(jì)算過(guò)程的數(shù)據(jù)示例，根據(jù)表C.1計(jì)算，時(shí)間-加權(quán)平均濃度為表C.1時(shí)間-加權(quán)平均值的計(jì)算更換編號(hào)dCi+1A;142333總計(jì)僅在每次更換周期的開(kāi)始和結(jié)束時(shí)測(cè)定濃度，是不可能確定濃度呈指數(shù)衰減下降的。選用不同的曲線(xiàn)模型得到的面積是不同的，可能會(huì)得出不一樣的結(jié)果。但選擇指數(shù)衰減模型可能是在缺乏其他信息情況下的最佳選擇。如在更換周期結(jié)束時(shí)通過(guò)化學(xué)分析未檢出任何受試物，可估算出受試物從溶液中消散的速率除外，否則無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)算曲線(xiàn)下的面積，即無(wú)法獲得合理的時(shí)間-加權(quán)平均值。GB/TGB/T42366-2023(資料性)飼養(yǎng)液更換，物理化學(xué)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)和喂食數(shù)據(jù)記錄表靜水椎實(shí)螺繁殖試驗(yàn)飼養(yǎng)液更換，物理化學(xué)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)和喂食數(shù)據(jù)可參考表D.1范例進(jìn)行記錄。表D.1靜水椎實(shí)螺繁殖試驗(yàn)飼養(yǎng)液更換，物理化學(xué)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)和喂食數(shù)據(jù)記錄表試驗(yàn)時(shí)間/d123456789試驗(yàn)溶液類(lèi)型飼養(yǎng)液更換(√)——新舊溶解氧濃度"/(mg/L)新舊溫度“/℃新舊電導(dǎo)率"/(μS/cm)新舊是否提供食物(√)—硬度”(以CaCO?計(jì))/(mg/L)—記錄所測(cè)定容器的編號(hào)。二(資料性)靜水椎實(shí)螺繁殖量和存活情況數(shù)據(jù)記錄表典型的生物繁殖試驗(yàn)方法是將一組個(gè)體暴露在特定受試物濃度的溶液中，同時(shí)報(bào)告每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的子代數(shù)量和親代存活數(shù)。生物試驗(yàn)方法通常設(shè)置多個(gè)平行以評(píng)估試驗(yàn)效應(yīng)的可變性，兩個(gè)生物學(xué)指標(biāo)在每個(gè)濃度-時(shí)間關(guān)系中均包含3個(gè)平行。按照推薦軟件(見(jiàn)附錄F)的使用方式，建議使用文本文件來(lái)收集數(shù)據(jù)。收集數(shù)據(jù)記錄表格式見(jiàn)表E.1。表格的每一行相當(dāng)于在該濃度下該平行在該時(shí)間點(diǎn)的親代的存活數(shù)(Nsurv)及繁殖量(Nrepro)。請(qǐng)注意遵從表格每一列的順序，表格的首行包含每列的標(biāo)題，使用一個(gè)制表字符將各列的內(nèi)容分隔開(kāi)。表E.1靜水椎實(shí)螺繁殖量和存活情況數(shù)據(jù)記錄表平行濃度/(μg/L)時(shí)間/d親代存活數(shù)(Nsurv)繁殖量(Nrepro)A0050A050A050A050A050A050B0050B050B050B050B050B050C0050C050C050C050C050C050:::::A0355A355表E.1靜水椎實(shí)螺繁殖量和存活情況數(shù)據(jù)記錄表(續(xù))平行濃度/(μg/L)時(shí)間/d親代存活數(shù)(Nsurv)繁殖量(Nrepro)A354A354A351A350B0356B355B351B351B352B350C0353C352C353C351C351C352:::::GB/T42366—2023(資料性)靜水椎實(shí)螺繁殖量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)方