Reprimo-SDC2-TCF4基因甲基化檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）（CSZ2100221）

受理號：CSZ2100221體外診斷試劑產(chǎn)品注冊技術(shù)審評報告產(chǎn)品中文名稱：Reprimo/SDC2/TCF4基因甲基化檢測試劑盒（熒光探針法）產(chǎn)品管理類別：第三類申請人名稱：北京艾克倫醫(yī)療科技有限公司國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心—1—目錄基本信息.........................................................................................................3一、申請人名稱.............................................................................................3二、申請人住所.............................................................................................3三、生產(chǎn)地址.................................................................................................3技術(shù)審評概述.................................................................................................4一、產(chǎn)品概述.................................................................................................4二、臨床前研究概述...................................................................................5三、臨床評價概述.......................................................................................四、產(chǎn)品受益風(fēng)險判定...............................................................................綜合評價意見...............................................................................................—2—基本信息一、申請人名稱北京艾克倫醫(yī)療科技有限公司二、申請人住所北京市昌平區(qū)科技園區(qū)白浮泉路10號2號樓北控科技大廈3層302室三、生產(chǎn)地址北京市昌平區(qū)科技園區(qū)白浮泉路10號2號樓北控科技大廈3層302室、北京市昌平區(qū)超前路37號1幢4層5-4-2-01—3—技術(shù)審評概述一、產(chǎn)品概述（一）產(chǎn)品主要組成成分試劑組分主要成分體積數(shù)量1.PCR反應(yīng)液熱啟動聚合酶、dNTPsMgCl20.48mlx2引物混合液引物、探針0.19mlx1陰性質(zhì)控品人類基因組、BSA和4.2mlx1陽性質(zhì)控品人類基因組、Hela細(xì)胞基因組、BSA和4.2mlx1（二）產(chǎn)品預(yù)期用途本試劑盒用于體外定性檢測人外周血血漿中Reprimo、SDC2、TCF4基因的甲基化水平。病人外周血中甲基化的ReprimoSDC2TCF4基因可以通過鏡檢查，但本身不適合進(jìn)行胃鏡檢查或由于個人原因拒絕進(jìn)行胃鏡檢查的患者，僅作為胃癌輔助診斷供臨床醫(yī)生參考。（三）產(chǎn)品包裝規(guī)格30人份盒。（四）產(chǎn)品檢驗(yàn)原理提取血漿中的游離化的胞嘧啶，通過脫氨基反應(yīng)產(chǎn)生尿嘧啶磺酸鹽，發(fā)生甲基化—4—的胞嘧啶則不會被亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化。將亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的（BisDNA）做多重擴(kuò)增，反應(yīng)中的引物、探針能區(qū)分甲基化和非甲基化序列，甲基化序列優(yōu)先得到擴(kuò)增，與甲基化SDC2TCF4基因序列特異性結(jié)合的熒光素探針可以在反應(yīng)中專一地檢測出甲基化序列。內(nèi)參對照（β-actin）基因用于評估檢測中量是否足夠。二、臨床前研究概述（一）主要原材料1.主要原材料的選擇本產(chǎn)品的主要原材料包括引物干粉、反應(yīng)液、人類基因組和Hela細(xì)胞基因組方式獲得。其中引物的序列均由申請人自行設(shè)計，由合成公司經(jīng)過合反應(yīng)液由供應(yīng)商化學(xué)合成獲得；人類基因組和Hela細(xì)胞基因組由供應(yīng)商提取純化獲得。申請人對主要原材料進(jìn)行了供應(yīng)商的選擇，通過功能性實(shí)驗(yàn)篩選出合格供應(yīng)商，制定了各主要原材料的技術(shù)要求和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)檢驗(yàn)合格。2.企業(yè)參考品設(shè)置情況—5—本產(chǎn)品企業(yè)參考品包括陽性參考品、陰性參考品、精密度參考品以及檢測限參考品。企業(yè)參考品的主要原材料為胃癌早期患者樣本、人類基因組與細(xì)胞系基因組中Reprimo、SDC2、TCF4三個基因?qū)?yīng)位點(diǎn)均甲基化，細(xì)胞系包括Reprimo、SDC2、TCF4相應(yīng)位點(diǎn)單甲基化的三種胃癌細(xì)胞系基因組和其它癌癥ReprimoSDC2TCF4相應(yīng)位點(diǎn)無甲基化的細(xì)胞系基因組。陽性參考品個，包括不同濃度水平ReprimoSDC2TCF4三基因均甲基化的參考品、Reprimo單甲基化參考品、單甲基化參考品和TCF4基化參考品。陰性參考品7個，包括正常人基因組甲基化陰性參考品、其它消化道癌癥基因組甲基化陰性參考品、內(nèi)源干擾2個，包括一定濃度的SDC2TCF4三基因均甲基化、甲基化程度高低不同的精密度參考品。檢測限參考品3個，包括不同背景核酸濃度下，最低可檢出甲基化比例的Reprimo、SDC2、TCF4三基因甲基化參考品。（二）生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究申請人對試劑盒反應(yīng)體系的研究中包括靶標(biāo)序列的選擇、陽性質(zhì)控品配方—6—量以及樣本保存時間的研究；對該產(chǎn)品三種適用機(jī)型宏石分析系統(tǒng)SLAN-96P、AppliedBiosystems7500，RocheLightcycler480實(shí)驗(yàn)，最終確定了最佳的反應(yīng)體系。申請人根據(jù)試劑盒中試劑及組件的主要生產(chǎn)工藝的研究結(jié)果，確定了最佳的生產(chǎn)工藝。（三）分析性能評估分析特異性（交叉反應(yīng)和干擾研究）的評估及配套使用核酸提取試劑的性能評估。不同85.00%（95%CI：77.53%-90.30%90.00%（95%CI74.38%-96.54%精密度的研究使用臨床樣本的混合池，對重復(fù)性、室內(nèi)精密度、批間精密度、機(jī)型精密度及室間精密度進(jìn)行了研究。結(jié)SDC2、TCF4和基因平均Ct值的變異系數(shù)均低于5%樣本，基因平均Ct值的變異系數(shù)低于。檢測限的研究，在三種適用機(jī)型上分別進(jìn)行了檢測限的建—7—0.05ng/μL0.02ng/μL和0.01ng/μL血漿游離濃度下，試劑盒的檢測限分別為0.06%、0.15%和0.29%的三基因甲基化，約為18個拷貝。交叉反應(yīng)的研究結(jié)果表明，對于非典型性增生的檢出情況66.67%的特異性為96.67%、胃息肉96.67%、胃潰瘍93.33%、胃腸間質(zhì)瘤100%、胃淋巴瘤95%。檢測其它類型腫瘤樣本的特異性為：宮頸癌86.67%、食管癌83.33%90.00%90.00%90.00%、神經(jīng)內(nèi)分泌瘤100%。未甲基化DNA（150ng/ml0.20mg/ml（）、甘油三酯（）、蛋白（血清白蛋白，120mg/ml0.4%v/v（（5mg/ml0.235mg/ml）和葡萄糖（10mg/ml）對檢測結(jié)果無影響。常見治療藥物，包括感冒藥、消炎藥、心腦血管疾病藥、糖尿病藥、胃病藥、維生素、高血壓藥、安定藥、鎮(zhèn)痛藥等在最大使用劑量范圍內(nèi)，不影響試劑盒檢測結(jié)果。對與試劑盒配合使用的血漿游離提取和亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒（京昌械備20180004）進(jìn)行了提取效率、精密度及抗—8—干擾能力的性能研究，結(jié)果表明與市場常用的產(chǎn)品性能相當(dāng)。（四）陽性判斷值研究產(chǎn)品采用三基因擬合P值公式法確定陽性判斷值。每個樣本進(jìn)行3次ReprimoSDC2TCF4和基因3個復(fù)孔平均CtCt值定義為45.0基因的平均Ct值確定樣本檢測結(jié)果有效的情況下，樣本P值≥0.6則判斷樣本為陽性，樣本P值＜0.6則判斷樣本為陰性。陽性判斷值研究入組有效病例數(shù)470例，包括胃癌病人樣本193例和對照組樣本（包括胃炎、胃潰瘍、胃息肉、胃部良1/3次Ct值、2/3次Ct值、3/3次Ct值、平均CtCt擬合公式等，比較不同分析方法的檢測靈敏度、特異性、總符Ct值擬合P值公式法檢測準(zhǔn)確率最高。使用驗(yàn)證集樣本再次驗(yàn)證三基因擬合公式和其它陽性判斷值方法，驗(yàn)證研究入組有效病例數(shù)例，包括胃癌病人樣本99P值公式法特異性為91.92%，靈敏度為85.38%，總符合率為88.21%。（五）穩(wěn)定性研究—9—申請人對該產(chǎn)品的穩(wěn)定性的研究包括長期穩(wěn)定性、使用穩(wěn)定性及樣本穩(wěn)定性。-20±5存后的第、、9、1213個月進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示產(chǎn)品在生產(chǎn)后13劑盒于±℃存儲，有效期為12個月。-20±5℃開瓶放置66次、置于37℃3天后檢測產(chǎn)品性能，穩(wěn)定性結(jié)果P值及CV值均無顯著差異，無顯著變化趨勢，其產(chǎn)品的主要性能均符合技術(shù)要求?！娣胖?Cellfree6天以內(nèi)的新鮮血樣℃至-60保存6個月以內(nèi)，在5天以內(nèi)，在℃保存小時以內(nèi)進(jìn)行檢測，避免反復(fù)凍融；BisDNA保存期限為在±℃保存42-8℃保存16小時以內(nèi)進(jìn)行檢測，僅可凍融一次。三、臨床評價概述本產(chǎn)品在上海市東方醫(yī)院、河南省腫瘤醫(yī)院、山西省腫瘤—10—醫(yī)院三家臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行臨床試驗(yàn)，采用試驗(yàn)體外診斷試劑與臨床參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較研究，確認(rèn)本產(chǎn)品的臨床性能。其中胃癌和其它惡性腫瘤病例采用病理診斷確診，其它疾病根據(jù)相關(guān)診療指南進(jìn)行綜合診斷確診。入組病例為胃癌疑似病例，樣本類型為血漿。產(chǎn)品臨床靈敏度和特異性評價共納入臨床有效病例1490468胃癌的其它病例102280.77%（95%CI76.95%84.08%92.07%（90.26%，93.58%（86.81%90.04%述結(jié)果顯示試驗(yàn)體外診斷試劑具有良好的臨床靈敏度和特異性，滿足臨床使用需求。此外，臨床試驗(yàn)還納入例胃癌疑似病例，采用試驗(yàn)體外診斷試劑與數(shù)字PCR99.26%（95%CI：95.92%，99.87%93.59%（95%CI：85.86%，97.23%97.18%（95%CI：93.99%，98.70%基因，陰性符合率為96.92%（95%CI：92.36%，98.80%95.18%（95%CI：88.25%，——（92.76%98.08%對TCF496.30%（95%CI91.62%98.41%陽性符合率為94.87%（95%CI：87.54%，97.99%為95.77%（95%CI：92.17%，97.76%間具有良好的一致性，本產(chǎn)品臨床檢測性能滿足要求。40例胃癌患者手術(shù)前后的樣本進(jìn)行連續(xù)檢測，40例樣本術(shù)前檢測結(jié)果均為陽性，術(shù)后檢測結(jié)果均為陰性，表明胃癌手術(shù)切除后血漿中三基因的甲基化水平降低。綜上所述，臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示本產(chǎn)品的臨床性能滿足技術(shù)審評要求。四、產(chǎn)品受益風(fēng)險判定申報產(chǎn)品根據(jù)0316-2016醫(yī)療器械風(fēng)險管理對醫(yī)療Reprimo/SDC2/TCF4基因甲基化檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）進(jìn)行產(chǎn)品受益風(fēng)險判定。（一）受益評估申報產(chǎn)品用于體外檢測人外周血血漿中胃癌甲基化基因ReprimoSDC2TCF4檢查，但本身不適合進(jìn)行胃鏡檢查或由于個人原因拒絕進(jìn)行胃鏡檢查的患者，僅作為輔助診斷供臨床醫(yī)生參考，使病人多了—12—一種無創(chuàng)性胃癌輔助診斷方法的選擇。（二）風(fēng)險評估根據(jù)申請人提供的申報資料，經(jīng)綜合評價，在目前認(rèn)知水平上，認(rèn)為該產(chǎn)品上市帶來的受益大于風(fēng)險。但為保證用械安全，基于對主要剩余風(fēng)險的規(guī)避，需要在說明書中提示以下信息：1.只能用于體外診斷。2.該產(chǎn)品的有效性僅針對于血樣的收集方式不適用。3.該產(chǎn)品的使用者應(yīng)該是接受過反應(yīng)培訓(xùn)的專業(yè)技術(shù)人員。4.由于檢測依賴于樣品中腫瘤的量、所以可能受樣果。5.由于血漿樣本中游離含量低、易降解，應(yīng)嚴(yán)格按假陰性結(jié)果。6.由于擴(kuò)增的初始靶—13—陽性信號。7.樣本中含有超過以下濃度的干擾物：未甲基化（150ng/ml0.20mg/ml油三酯（12mg/ml120mg/ml（0.4%v/v（20mg/ml（0.235mg/ml）和葡萄糖（影響。8.別上皮內(nèi)瘤變的特異性為66.67%為40%96.67%96.67%、胃潰瘍93.33%、胃淋巴瘤95%。檢測其它類型腫瘤樣本的特異性為：宮頸癌86.67%、食管癌83.33%、結(jié)直腸癌90.00%、肝癌90.00%、胰腺癌90.00%。當(dāng)這類疾病檢測結(jié)果為陽性時，臨床醫(yī)生需要對上述疾病進(jìn)行綜合考慮。9.試劑盒臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示對食管癌/食管胃交界部癌有一定檢出率（21.28%14.29%，本產(chǎn)品檢測結(jié)果為陽性且通過胃鏡檢查顯示無病變的受檢者，腸腫瘤。—14—綜合評價意見本申報項(xiàng)目為境內(nèi)第三類醫(yī)療器械產(chǎn)品注冊。申請人的注華人民共和國國務(wù)院令第73948號）等相關(guān)醫(yī)療器械法規(guī)與配套規(guī)章，經(jīng)對申請人提交的注冊申報資料進(jìn)行系統(tǒng)評價，申報產(chǎn)品符合安全性、有效性的要求，符合現(xiàn)有認(rèn)知水平，建議準(zhǔn)予注冊。2024年4月7日附件：產(chǎn)品說明書—15—Reprimo/SDC2/TCF4基因甲基化檢測試劑盒（熒光探針法）說明書【產(chǎn)品名稱】通用名稱：Reprimo/SDC2/TCF4PCR-熒光探針法）【包裝規(guī)格】30人份/盒【預(yù)期用途】本試劑盒用于體外定性檢測人外周血血漿中Reprimo、SDC2、TCF4基因的甲基化水平。病人外周血中甲基化的ReprimoSDC2基因可以通過的特異擴(kuò)增而被檢測到。本試劑盒適用于臨床需進(jìn)行胃鏡檢查，但本身不適合進(jìn)行胃鏡檢查或由于個人原因拒絕進(jìn)行胃鏡檢查的患者，僅作為胃癌輔助診斷供臨床醫(yī)生參考?！緳z驗(yàn)原理】提取血漿中的游離DNA，然后用亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化未發(fā)生甲基化的胞嘧啶，通過脫氨基反應(yīng)產(chǎn)生尿嘧啶磺酸鹽，發(fā)生甲基化的胞嘧啶則不會被亞（BisDNAPCR反應(yīng)中的引物、探針能區(qū)分甲基化和非甲基化序列，甲基化序列優(yōu)先得到擴(kuò)增，與甲基化Reprimo、SDC2、基因序列特異性結(jié)合的熒光素探

針可以在PCRACTB（β-actin）

基因用于評估檢測中量是否足夠?！局饕M成成分】試劑組分主要成分體積數(shù)量1.PCR反應(yīng)液熱啟動聚合酶、dNTPs、MgCl20.48mlx22.引物混合液引物、探針0.19mlx13.陰性質(zhì)控品人類基因組DNABSA和4.2mlx14.陽性質(zhì)控品人類基因組DNAHela細(xì)胞基因組、BSA和TE4.2mlx1注意不同批次的試劑盒不能混用。以下試劑和耗材是本試劑盒不包含，但對該實(shí)驗(yàn)必需的：血漿游離取試劑；備案號：京昌械備20180004；公司名稱：北京艾克倫醫(yī)療科

無水乙醇；15聚丙烯離心管帶有圓錐型底，無菌；

1.5離心管；—16—移液器，包括1ml、200μL，20μL及10μL規(guī)格；

移液器適配的吸頭；5液體；磁力架；恒溫震蕩金屬浴；8聯(lián)排PCR管及管蓋；采血管：含抗凝劑的真空采血管（，，國械

注進(jìn)20152222083Streck游離Cell-FreeBCT?BLOODCOLLECTIONTUBE，10mL，貨號218962【儲存條件及有效期】1.試劑盒于-20±5℃存儲，有效期為個月。2.4所有試劑在-20±5℃可存儲6簽?！具m用儀器】宏石PCR分析系統(tǒng)SLAN-96P、AppliedBiosystems7500，RocheLightcycler480。【樣本要求】血樣的收集和保存按以下執(zhí)行：1.全血采集采血量：5ml。采血方法：采用抗凝管收集靜脈血（真空采血管，

6mL20152222083采血管，

Cell-FreeBCT?BLOODCOLLECTIONTUBE，10mL，貨號

218962。使用普通真空采血管采集后的血樣應(yīng)立即分離血漿，若不能立

即分離血漿，應(yīng)在2~8℃保存，保存時間不超過4小時；使用采血管采集后的血漿可以室溫保存6天。不得冰凍血樣。2.血漿樣本的制備和血漿保存禁止使用離心機(jī)剎車（急停）功能，以防止破壞血細(xì)胞層。離心裝有全血的采血管1350±150rcf錐底的離心管中。離心血漿121350±150rcf血漿移入標(biāo)記好的圓錐底的離心管中。血漿樣本可以在℃下保存不超過30℃存放不超過小時。血漿樣本僅可凍融1次?！?7—3.亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的（BisDNA）樣本保存使用北京艾克倫醫(yī)療科技有限公司的核酸提取試劑（京昌械備20180004BisDNA樣

本可以-20±5℃下保存不超過4天，可以在2~8℃存放不超過16小時。

BisDNA僅可凍融1次?！緳z驗(yàn)方法】1.血漿游離提取及亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化按照核酸提取試劑盒說明書提取、亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化血漿（質(zhì)控

35μ亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的（BisDNA試3個PCR復(fù)孔，亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的（BisDNA）模板體積不能少于

32μ。使用北京艾克倫醫(yī)療科技有限公司的核酸提取試劑（京昌械備20180004試劑配制洗液A使用前，須按瓶子標(biāo)簽所示，加入無水乙醇進(jìn)行稀釋。

洗液B使用前，須按瓶子標(biāo)簽所示，加入無水乙醇進(jìn)行稀釋。

核酸純化磁珠初次使用時，必須劇烈搖晃分鐘讓磁珠充分分散。裂解將2.0ml血漿樣本分別轉(zhuǎn)移到事先標(biāo)記好的裂解液DL室溫中速（大約10~20rpm）旋轉(zhuǎn)20分鐘。結(jié)合將100μl磁珠（新鮮懸?。┨砑拥诫x心管中，蓋緊離心管蓋，

顛倒混勻5~6次。把離心管置于輪狀旋轉(zhuǎn)混勻器上，室溫中速（大約

10~20rpm）旋轉(zhuǎn)分鐘。洗滌將離心管放置于磁力架上吸附分鐘。小心倒掉上清（注意

本中磁珠不能被磁力架有效分離，請將上述步驟的離心管取下，加

入2.5ml裂解吸附液顛倒混勻離心管置于（℃分鐘，放置磁力架上再次磁珠分離。加入洗液，渦旋混勻確保磁珠徹底重懸。用一次性移液管將

磁珠懸浮液移至標(biāo)記好的離心管中。再次用移液管吸取殘留磁珠懸

浮液，將其轉(zhuǎn)移至離心管中。將離心管放置于磁力架上吸附1分鐘，小心吸棄所有液體，注意不要吸取磁珠。短暫離心離心管。放置離心管在磁力架上重新吸附1分—18—鐘，用10~100μl移液器盡量除去殘余液體。將離心管放置室溫晾干分鐘亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化一次向晾干的磁珠中加入珠。將重懸磁珠轉(zhuǎn)移到PCRPCR℃恒溫孵育分

取出。結(jié)合將上述含有磁珠的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到裂解液，300μl無水乙醇（或洗液將離心管置于輪狀旋轉(zhuǎn)混勻器中，調(diào)整轉(zhuǎn)速為10~20rpm，孵育分

鐘。短暫離心，將離心管置于磁力架1分鐘，小心吸棄所有液體。

第一次洗滌洗液短暫離心。將離心管置于磁力架1分鐘，小心吸棄所有液體。

第二次洗滌1000μl洗液，渦旋混勻重懸磁珠，短暫離心，將含有磁珠的洗液轉(zhuǎn)移到新的離心管中。將離心管置于磁力架1分鐘，小心吸棄所有液體。第三次洗滌1000μl洗液，渦旋混勻重懸磁珠，

1離心，將離心管置于磁力架1分鐘，用10~100μl移液器盡量除去殘余液

體。晾干打開離心管管蓋，室溫靜置分鐘待乙醇揮發(fā)，不要震蕩。

洗脫30~100μl100±10rpm震蕩10

110~100μl移液器將洗脫

液轉(zhuǎn)移新的離心管中。2.檢測悉儀器的操作流程。2.1預(yù)反應(yīng)液的準(zhǔn)備根據(jù)反應(yīng)樣本量，融化PCR反應(yīng)液、引物混合液。渦旋混勻PCR反—19—應(yīng)液10-15秒，短暫離心。每個反應(yīng)需要10μlPCR引物混合液。按比例將相應(yīng)體積的PCR反應(yīng)液和引物混合液加入到離心管中。渦旋混勻PCR預(yù)反應(yīng)液，短暫離心，將管壁液滴離下來。注意：PCR反應(yīng)液和引物混合液使用完畢立即復(fù)凍。2.2反應(yīng)板準(zhǔn)備將12μl預(yù)反應(yīng)液加至選定好的8管的孔中。加入的BisDNA至PCR管對應(yīng)的孔中。用管蓋密封，1000±100rcf離心1氣泡出現(xiàn)。密封后的PCR管可在2~8℃放置不超過2小時。2.3宏石分析系統(tǒng)SLAN-96P上機(jī)1）PCR反應(yīng)板加載PCR預(yù)反應(yīng)液中不包含ROX選取熒光通

SDC2選取ACTB選

取通道，如表1所示設(shè)置反應(yīng)程序：表1：反應(yīng)程序步驟描述溫度時間熒光信號收集循環(huán)數(shù)階段1活化98℃5分鐘195℃10秒階段2PCR循環(huán)63℃5秒45

58℃30秒X階段3降溫25℃10秒1注：X代表熒光收集階段2）分析條件設(shè)置分析運(yùn)行結(jié)果，將基線的起始點(diǎn)設(shè)為第“10”個循環(huán)，終點(diǎn)設(shè)為第個循環(huán)，設(shè)置、SDC2、TCF4閾值0.05、ACTB閾值0.05（可視

2.4Applied7500儀上機(jī)1）PCR反應(yīng)板加載PCR預(yù)反應(yīng)液中不包含ROX或其它染料，PassiveReference設(shè)置必須

為“none”選取熒光通道，SDC2選取JOE熒光通道，選取Red熒光通道，ACTB通道，如表1所示設(shè)置反應(yīng)程

序。2）分析條件設(shè)置分析運(yùn)行結(jié)果，將基線的起始點(diǎn)設(shè)為第“10”個循環(huán)，終點(diǎn)設(shè)為第和SDC2閾值4000閾值10000ACTB70002.5RocheLightcycler480儀上機(jī)1）PCR反應(yīng)板加載—20—點(diǎn)擊設(shè)置，雙擊Detection添加熒光通道：Reprimo

（465-510nmSDC2540-580nmTCF4540-610nmACTB

（610-670nm1所示設(shè)置反應(yīng)程序。2）分析條件設(shè)置“AbsQuant/FitPoints”始點(diǎn)設(shè)為第個循環(huán)；Noiseband設(shè)為Auto模式；

Reprimo閾值為0.6SDC2TCF4閾值為0.5ACTB閾值為（可視具

2.6P值計算將PCR數(shù)據(jù)文件以txt或格式輸出，計算每個基因3個復(fù)孔平

均值導(dǎo)入到P值計算公式

（P=26.235-0.097*aveCt.Reprimo-0.154*aveCt.SDC2-0.332*aveCt.TCF4計算P值及判斷陰陽性。2.7質(zhì)量控制方法試劑盒能夠準(zhǔn)確進(jìn)行檢測相應(yīng)ACTBCt值參考范圍為≤35.0。

每次檢測同步對試劑盒內(nèi)的陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品進(jìn)行檢測，質(zhì)控

品滿足以下性能指標(biāo)時，證明整個試驗(yàn)流程有效。陰性質(zhì)控品：13次PCR的3次反應(yīng)無Ct或平均＞43.0，的3次反應(yīng)無或平

均＞43.0的3次PCR反應(yīng)無Ct或平均Ct＞43.0ACTB擴(kuò)

增曲線正常且平均Ct≤35.0，P值＜。陽性質(zhì)控品：13次PCR的平均Ct≤37.0，的平均Ct≤37.0，的平均Ct≤37.0，同時內(nèi)參

ACTB擴(kuò)增曲線正常且平均Ct≤35.0，P值?！娟栃耘袛嘀怠渴褂肦eprimo/SDC2/TCF4基因甲基化檢測試劑盒（PCR熒光探針法）

對臨床研究樣本進(jìn)行Reprimo、SDC2、TCF4基因檢測，使用本試劑盒P

值計算公式分析PP值均在0以上。

為了確定最佳臨界點(diǎn)，再用統(tǒng)計學(xué)上的約登指數(shù)（真陽性率與假陽性率之差）來確定最合適的靈敏度和特異性所對應(yīng)的值。使用ROC法進(jìn)

行計算，0.6時準(zhǔn)確性最優(yōu)。ACTBCt值參考范圍為

≤35.0。【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】對每個樣本進(jìn)行3次PCRReprimoSDC2TCF4和

ACTB基因3個復(fù)孔平均CtCt值定義為。若質(zhì)控品不滿足性能指標(biāo)，則試驗(yàn)失敗，本次結(jié)果無效。在質(zhì)控品滿足性能指標(biāo)時，根據(jù)樣本的檢測結(jié)果判斷陰陽性：—21—陽性結(jié)果：待測樣本ACTB的平均Ct值P≥0.6則判斷樣本為陽性。ACTB的平均Ct值P值＜0.6則判斷樣本為陰性。無效結(jié)果：如果的平均Ct值＞35.0，說明本次結(jié)果無效。對于無效結(jié)果建議復(fù)查?！緳z測方法的局限性】10.只能用于體外診斷。11.該產(chǎn)品的有效性僅針對于抗凝采血管。對于其它血樣的收集方式不適用。12.該產(chǎn)品的使用者應(yīng)該是接受過PCR反應(yīng)培訓(xùn)的專業(yè)技術(shù)人員。13.由于檢測依賴于樣品中腫瘤品儲存方式、病人個體因素（如年齡，其它疾?。┮约澳[瘤級別影響，外周血的采集、血漿的制備和存儲均應(yīng)按照要求進(jìn)行，否則將影響檢測結(jié)果，導(dǎo)致假陰性的檢測結(jié)果。14.由于血漿樣本中游離含量低、易降解，應(yīng)嚴(yán)格按照【樣本要求】的規(guī)定處理和保存樣本，否則影響檢測，造成假陰性結(jié)果。15.由于擴(kuò)增的初始靶測環(huán)境的污染，否則容易在擴(kuò)增循環(huán)末期產(chǎn)生假陽性信號。16.DNA150ng/ml紅

素（0.20mg/ml10mg/ml12mg/ml（血清白蛋白，120mg/ml0.4%v/v（20mg/ml5mg/ml0.235mg/ml10mg/ml對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。17.本試劑盒對于非典型性增生有部分陽性檢出，其中低級別上皮內(nèi)瘤變的特異性為66.67%，高級別上皮內(nèi)瘤變的特異性為40%。檢測其它胃

部疾病的特異性為：胃炎96.67%、胃息肉96.67%、胃潰瘍93.33%、

胃淋巴瘤95%。檢測其它類型腫瘤樣本的特異性為：宮頸癌86.67%、

食管癌83.33%、結(jié)直腸癌90.00%、肝癌90.00%、胰腺癌90.00%。當(dāng)

這類疾病檢測結(jié)果為陽性時，臨床醫(yī)生需要對上述疾病進(jìn)行綜合考慮。18.試劑盒臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示對食管癌/食管胃交界部癌有一定檢出率（21.28%14.29%陽性且通過胃鏡檢查顯示無病變的受檢者，建議通過其它臨床手段排查食管腫瘤、食管胃交界腫瘤及結(jié)直腸腫瘤?！井a(chǎn)品性能指標(biāo)】1.產(chǎn)品的性能指標(biāo)1.1外觀—22—無沉淀，無懸濁物。說明書清楚完整，品名、批號和有效期清楚。1.2準(zhǔn)確性檢測份陽性參考品，每份參考品進(jìn)行3次PCR平行測試，結(jié)果為

ACTB平均Ct≤35.0，P值≥0.6，符合陽性。檢測7份陰性參考品，每份參考品進(jìn)行3次PCR平行測試，結(jié)果為

ACTB平均Ct≤35.0，P值＜0.6，符合陰性。使用臨床真實(shí)樣本，包括不同分期的胃癌陽性樣本，不同含量和不同甲基化比例的陽性或陰性樣本，試劑盒檢測結(jié)果與患者臨床診斷結(jié)果相比較，靈敏度為85.00%，特異性為90.00%。1.3檢測限檢測33次PCRACTB平均Ct≤35.0，P值≥0.6，符合陽性。在0.05ng/μL0.02ng/μL和0.01ng/μL血漿游離濃度下，試劑盒

檢測P值為陽性的檢測限分別為0.06%、0.15%和0.29%的三基因甲基化，

約為個拷貝。1.4精密度檢測2ACTB

Ct≤35.0，P值≥0.6，符合陽性。同時計算所測得Reprimo、SDC2、和ACTB的Ct值的變異系數(shù)（CV5%。對產(chǎn)品的重復(fù)性及室內(nèi)、三個批次間、三個適用機(jī)型間及三個實(shí)驗(yàn)室間的精密度研究表明，試劑盒檢測陽性樣本，Reprimo、SDC2、和

ACTB基因平均Ct值的變異系數(shù)均低于5%ACTB基因平

均Ct值的變異系數(shù)低于5%。2.干擾研究DNA（150ng/ml膽紅素（0.20mg/ml10mg/ml12mg/ml120mg/ml0.4%v/v2（20mg/ml膽

5mg/ml0.235mg/ml10mg/ml影響。常見治療藥物，包括感冒藥、消炎藥、心腦血管疾病藥、糖尿病藥、胃病藥、維生素、高血壓藥、安定藥、鎮(zhèn)痛藥等在最大使用劑量范圍內(nèi)，對檢測結(jié)果無影響。3.交叉反應(yīng)本試劑盒對于非典型性增生的檢出情況為：低級別上皮內(nèi)瘤變的特異

性為，高級別上皮內(nèi)瘤變的特異性為。檢測其它胃部疾病的特

96.67%96.67%93.33%100%、

胃淋巴瘤95%86.67%癌83.33%、結(jié)直腸癌90.00%、肝癌90.00%、胰腺癌90.00%、神經(jīng)內(nèi)分泌—23—瘤100%。4.臨床試驗(yàn)結(jié)果在3家臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)完成臨床試驗(yàn)，臨床研究