(高清版)GBT 18090-2023 豬繁殖與呼吸綜合征診斷方法

豬繁殖與呼吸綜合征診斷方法2023-03-17發(fā)布I 2規(guī)范性引用文件 l3術語和定義 14縮略語 15生物安全措施 26臨床診斷 26.1易感動物 26.2臨床癥狀 26.3病理變化 26.4結果判定 27實驗室檢測樣本采集與保存 37.1采樣器材 37.2樣本采集 37.3樣本保存 38病毒的分離與鑒定 38.1主要器材、試劑與細胞 38.2樣本制備 48.3試驗方法 48.4結果判定 59反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR) 59.1主要器材 59.2主要試劑 59.3樣本制備 69.4試驗方法 69.5結果判定 810實時反轉錄-聚合酶鏈反應(實時RT-PCR) 810.1主要器材 810.2主要試劑 810.3樣本制備 810.4試驗方法 810.5結果判定 911免疫過氧化物酶單層試驗(IPMA) 9Ⅱ11.1主要器材 11.2主要試劑 11.3試驗方法 11.4結果判定 12間接免疫熒光試驗(IFA) 12.1主要器材 12.2主要試劑 12.3試驗方法 12.4結果判定 13間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(間接ELISA) 13.1主要器材 13.2主要試劑 13.3試驗方法 13.4結果判定 14綜合判定 附錄A(規(guī)范性)豬肺泡巨噬細胞(PAMs)制備、鑒定、保存 附錄B(規(guī)范性)試劑的配制 附錄C(資料性)RT-PCR、定量RT-PCR引物探針和特異性擴增片段序列 Ⅲ本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件代替GB/T18090—2008《豬繁殖與呼吸綜合征診斷方法》,與GB/T18090—2008相比，除結構調整和編輯性改動外，主要技術變化如下：——更改了臨床診斷(見第6章，2008年版的第4章);——增加了實時反轉錄聚合酶鏈反應(見第10章)。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。本文件由全國動物衛(wèi)生標準化技術委員會(SAC/TC181)歸口。本文件起草單位：中華人民共和國大連海關、中國農(nóng)業(yè)大學、中華人民共和國鄭州海關。本文件及其所代替文件的歷次版本發(fā)布情況為：——2000年首次發(fā)布為GB/T18090—2000,2008年第一次修訂；——本次為第二次修訂。1豬繁殖與呼吸綜合征診斷方法1范圍本文件描述了豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)的臨床診斷和實驗室診斷的方法。本文件適用于豬繁殖與呼吸綜合征的診斷和監(jiān)測。臨床診斷方法適用于PRRS臨床疑似病例的診斷，病毒分離與鑒定、反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)和實時反轉錄-聚合酶鏈反應(Real-timeRT-PCR)適用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的檢測，免疫過氧化物酶單層試驗(IPMA)、間接免疫熒光試驗(IFA)和間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)適用于PRRSV抗體的檢測以及感染狀況的監(jiān)測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣本采集、保存與運輸技術規(guī)范3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。下列縮略語適用于本文件。AEC:氨乙基咔唑(3-amino-9-ethyl-carbazole)bp:堿基對(basepair)CPE:致細胞病變作用(cytopathiceffect)DEPC:焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)dNTP:脫氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)ELISA:酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linkedimmunosorbentassay)FITC:異硫氫酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate)HRP:辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase)IFA:間接免疫熒光試驗(indirectimmunofluorescentassay)IPMA:免疫過氧化物酶單層試驗(immunoperoxidasemonolayerassay)OD:光密度(opticaldensity)PBS:磷酸鹽緩沖鹽水(phosphatebufferedsaline)2PRRS:豬繁殖與呼吸綜合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome)PRRSV:豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus)RealtimeRT-PCR:實時反轉錄聚合酶鏈反應(RealtimereversetranscriptionRT-PCR:反轉錄聚合酶鏈反應(reversetranscription-polymerasechainreaction)SDS:十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecylsulfate)TMB:四甲基聯(lián)苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)5生物安全措施PRRSV的分離與鑒定應在生物安全二級(BSL-2)實驗室進行，按照GB19489執(zhí)行。6臨床診斷6.1易感動物家豬是PRRSV的易感動物，各種年齡和品種的豬均易感，主要危害妊娠母豬和仔豬。PRRSV也可感染野豬。6.2臨床癥狀6.2.1急性型：妊娠母豬以繁殖障礙為主，表現(xiàn)為晚期流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎和弱仔，死亡率一般為1%～4%。哺乳仔豬表現(xiàn)為體溫升高、精神萎靡、食欲廢絕、嗜睡、扎堆、消瘦、呼吸困難和結膜水腫等，斷奶前的死亡率可達60%。保育豬、生長育肥豬食欲下降、精神沉郁、耳發(fā)紺、呼吸困難、咳嗽、被毛粗亂、平均日增重降低，死亡率可達12%～20%。如果繼發(fā)或并發(fā)其他疾病，可致死亡率升高。公豬6.2.2慢性型：妊娠母豬散發(fā)性流產(chǎn)、胎兒異常、不規(guī)律返情、空懷等，產(chǎn)活仔率下降。仔豬和生長育肥豬有不同程度的呼吸系統(tǒng)癥狀，豬只生長遲緩，如有細菌性繼發(fā)感染，生長豬的死淘率可達5%～20%。持續(xù)性感染和亞臨床感染豬無明顯臨床表現(xiàn)。6.2.3非典型：以高熱、高發(fā)病率和死亡率為特征。妊娠母豬的流產(chǎn)率為40%～100%,死亡率可達10%以上，哺乳仔豬的死亡率可高達100%,保育豬的死亡率可達50%以上。6.3病理變化6.3.1剖檢病理變化：感染豬肺臟輕度或中度水腫，呈橡膠樣，大部分淋巴結腫大。高致病性PRRSV毒株感染豬的皮膚出血，肺臟嚴重水腫和實變。繼發(fā)細菌感染的病例可出現(xiàn)胸膜炎、心包炎、腹膜炎、關節(jié)炎等。6.3.2組織病理學變化：肺臟呈典型的間質性肺炎，肺泡間隔增厚、單核細胞與淋巴細胞浸潤以及Ⅱ型肺泡上皮細胞增生，具有診斷意義。淋巴結生發(fā)中心變大、增生、壞死，淋巴竇內有多核巨細胞浸潤。6.4.1出現(xiàn)上述臨床癥狀和病理變化，可初步判定為疑似PRRS。6.4.2確診應按照NY/T541規(guī)定的要求采集豬的全血、血清及肺臟、脾臟、淋巴結等組織樣本，進行實驗室檢測。37實驗室檢測樣本采集與保存7.1采樣器材7.2樣本采集用注射器無菌采集發(fā)病豬或感染豬血液，凝固后分離血清，或采集抗凝血，經(jīng)離心分離出血漿。血清、抗凝血或血漿可用于PRRSV的分離與鑒定、RT-PCR和RealtimeRT-PCR檢測。血清可用于PRRSV抗體檢測，豬群PRRSV抗體的監(jiān)測應采集至少30頭豬的血清樣本。無菌采集病死豬或撲殺豬的肺臟、脾臟、淋巴結、扁桃體等組織，用于PRRSV的分離與鑒定、RT-PCR和RealtimeRT-PCR檢測。公豬的精液可用于PRRSV的RT-PCR和RealtimeRT-PCR檢測。將綿繩懸掛于豬欄，讓豬咬綿繩，擠壓綿繩收集口腔液，可用于PRRSV的RT-PCR和RealtimeRT-PCR檢測以及抗體檢測。7.3樣本保存采集的樣本應保存于4℃,用于病毒分離的樣本應在24h～48h內運送至實驗室。不能立即進行檢測的樣本應保存于一20℃冰箱，長期保存應置于—70℃冰箱。8病毒的分離與鑒定8.1.1.3倒置生物顯微鏡。8.1.1.5離心機及離心管(規(guī)格10mL)。8.1.1.696孔微量細胞培養(yǎng)板。8.1.1.9微孔濾器(濾膜孔徑0.22μm)。48.1.2.1細胞生長液與維持液，按照附錄A中A.1.1配制。8.1.2.2PRRSV陽性血清或單克隆抗體。豬原代肺泡巨噬細胞(PAMs)或MARC-145細胞。PAMs按照附錄A進行制備、保存與復蘇。應首選PAMs進行PRRSV分離。8.2樣本制備血清、全血或血漿樣本可直接用于病毒分離。組織樣本經(jīng)剪碎后經(jīng)組織研磨器研磨，按照1:9的比例加入RPMI1640培養(yǎng)基制成10%的組織懸液，經(jīng)3000r/min離心15min后，吸取上清液，加入青霉素(500IU/mL)、鏈霉素(500μg/mL)、慶大霉素(500μg/mL)和兩性霉素B(200μg/mL)。有細菌污染的樣本應用微孔濾器進行過濾處理。8.3試驗方法8.3.1單層細胞制備用RPMI1640細胞生長液稀釋復蘇的PAMs,細胞終濃度為每毫升1×10?個/mL細胞，或用DMEM細胞生長液稀釋MARC-145細胞，細胞終濃度為每毫升5×10?個細胞。然后，將稀釋的細胞加入96孔細胞培養(yǎng)板中，100μL/孔，置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)長成單層。在空白的96孔細胞培養(yǎng)板中加入細胞培養(yǎng)液RPMI1640,90μL/孔，在A排和E排各孔內分別加孔(樣本1:10稀釋，重復2孔),搖動培養(yǎng)板后，從A排和E排孔各取10μL分別移入B排和F排孔內(樣本1:100稀釋)。搖動培養(yǎng)板后，再從B排和F排孔各取10μL分別移入C排和G排孔內(樣本1:1000稀釋)。同樣，再從從C排和G排孔各取10μL分別移入D排和H排孔內(樣本1:10000稀釋)。每個培養(yǎng)板應設置不接種樣本的細胞空白對照。一般而言，對用于PRRSV分離的樣本進行1:10和1:100稀釋即可。吸取按8.3.2方法稀釋的樣本50μL接種于8.3.1中對應的細胞孔(第1代)中，吸附1h后，加入細%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細胞病變，連續(xù)觀察2d～5d。樣本初次接種細胞培養(yǎng)2d后，不論有無CPE,應將每孔內細胞液取25μL,移入按照8.3.1制備的新細胞板對應的孔內(第2代),置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d～5d,每天觀察CPE。樣本的細胞培養(yǎng)物應盲傳2代～3代。用PRRSV陽性血清或單克隆抗體，采用本文件的免疫過氧化物酶單層試驗(IPMA)或間接免疫熒光試驗(IFA),對出現(xiàn)細胞病變的培養(yǎng)物進行PRRSV的鑒定。5傳后均出現(xiàn)CPE,或盲傳后出現(xiàn)CPE,并經(jīng)IPMA或IFA檢測為陽性，判定為PRRSV分離陽性。8.4.2初次接種樣本和盲傳后均無CPE,或出現(xiàn)CPE但經(jīng)IPMA或IFA檢測為陰性，判為PRRSV分9反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)9.1.2高速臺式冷凍離心機(4℃,離心速度12000r/min以上)。9.1.3穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和水平電泳槽。9.1.6冰箱(2℃~8℃、-20℃和-70℃)。濾芯吸頭。9.1.8組織研磨器。試劑均用無RNase污染的容器分裝。9.2.3商品化的RNA提取裂解液。9.2.4三氯甲烷。9.2.6DEPC水：在100mL三蒸水中加入100μLDEPC,18℃~22℃室溫下過夜，121℃滅菌15min。也可用商品化的產(chǎn)品。9.2.775%乙醇：75mL無水乙醇加25mLDEPC水，配制成759.2.16引物，檢測PRRSV的引物對序列見附錄C,加DEPC水配制成100μmol/L的儲存濃度和69.2.19電泳上樣緩沖液：100mL溶液中含0.25g溴酚藍及40g蔗糖。9.3樣本制備取待檢組織樣本2.0g于滅菌的組織研磨器中充分研磨，加10mLPBS混勻，4℃3000r/min離心15min,取上清液轉入無菌的1.5mL離心管中，對樣本進行編號。取精液0.5mL,經(jīng)凍融2次或進行超聲波裂解，10000r/min離心10min,取上清液。直接使用。9.4試驗方法9.4.1.1取滅菌的1.5mL離心管，基于樣本數(shù)量進行編號。每管加入600μL細胞裂解液，然后分別加入被檢樣本、陰性對照、陽性對照、空白對照(無核酸酶水)各200μL,每加一份樣本換用一個吸頭，再各加入200μL三氯甲烷，在混勻器上振蕩混勻5s。于4℃經(jīng)12000r/min離心15min。9.4.1.2取與9.4.1.1相同數(shù)量滅菌的1.5mL離心管，加入500μL異丙醇。吸取9.4.1.1各管中的上清液(至少500μL)轉移至相應的管中，并顛倒混勻。9.4.1.3于4℃經(jīng)12000r/min離心15min,小心倒去上清液，倒置于吸水紙上吸干液體，然后加入600μl75%乙醇進行洗滌。9.4.1.4于4℃、12000r/min離心10min,小心倒去上清液，倒置于吸水紙上吸干液體。9.4.1.54000r/min離心10s,將管壁上的殘余液體甩至管底部，用微量移液器吸干液體，室溫干燥9.4.1.6加入11μLDEPC水，輕輕混勻，以溶解管壁上的RNA,2000r/min離心5s,置于冰上備用。提取的RNA應在2h內進行RT-PCR擴增，否則應置于一70℃冰箱保存。反應液總量20μL。依次在RT反應管中加入RNA模板和試劑：a)RNA模板：提取樣本的總RNA,5μL;b)下游引物P2,1μL;g)DEPC水，6μL。經(jīng)4000r/min離心20s后進行反轉錄。RT的反應條件：50℃,30min。用于檢測PRRSV的通用引物序列見附錄C,PCR反應體系見表1。7表1PCR反應體系(總體積為50μL)加樣次序試劑成分體積/pL反轉錄產(chǎn)物210×PCR緩沖液345上游引物P1(20μmol/L)6下游引物P2(20μmol/L)7Tag酶(5U/μL)8將表1中的試劑充分混勻，4000r/min離心30s。PCR的反應條件：94℃預變性5min;94℃變性30s,55℃退火40s,72℃延伸50s,35個循環(huán)；72℃終延伸10min。擴增反應結束后，進行擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳。若采用一步法RT-PCR,則省略9.4.2,用提取的RNA直接進行反應。一步法RT-PCR反應體系見表2,用于檢測PRRSV的通用引物序列見附錄C。加樣次序試劑成分體積/μL1210×PCR緩沖液345上游引物P1(20μmol/L)6下游引物P2(20μmol/L)7反轉錄酶8Taq酶(5U/μL)9一步法RT-PCR的反應條件：50℃反轉錄30min;94℃預變性5min;94℃變性30s,55℃退火40s,72℃延伸50s,35個循環(huán)；72℃終延伸10min。用TBE電泳緩沖液配制1.5%的瓊脂糖(含0.5μg/mLEB)凝膠。將凝膠放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好淹沒膠面，將6μLPCR擴增產(chǎn)物和2μL電泳上樣緩沖液混勻后加入樣本孔。電泳時應設立DNAMarker對照。按5V/cm進行電泳20min～30min。電泳結束后，將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察結果。89.5結果判定9.5.1試驗成立條件：PRRSV-1(歐洲型)陽性對照有大小為398bp的特異性擴增條帶；PRRSV-2(美洲型)陽性對照有大小為433bp的特異性擴增條帶；陰性對照和空白對照無任何擴增條帶。9.5.2被檢樣本有大小為398bp的特異性擴增條帶，且與陽性對照條帶大小相符，則判為PRRSV-1核酸陽性。9.5.3被檢樣本有大小為433bp的特異性擴增條帶，且與陽性對照條帶大小相符，則判為PRRSV-2核酸陽性。9.5.4被檢樣本同時有大小為398bp和433bp的特異性擴增條帶，且與陽性對照條帶大小相符，則判為PRRSV-1和PRRSV-2核酸陽性。9.5.5被檢樣本無大小為398bp或433bp特異性的擴增條帶，則樣本判為PRRSV核酸陰性。必要時，可取RT-PCR擴增產(chǎn)物進行序列測定，并與已公開發(fā)表的PRRSV特異性片段序列進行同源性比對分析，以確證檢測結果。10實時反轉錄-聚合酶鏈反應(實時RT-PCR)10.1.2高速臺式冷凍離心機(4℃,離心速度12000r/min以上)。10.1.4冰箱(2℃~8℃和-20℃)。帶濾芯吸頭。10.2主要試劑10.2.1商品化的RNA提取裂解液。10.2.475%乙醇。10.2.7dNTPs:含dATP、dTTP、dCTP、dGTP各10mmol/L。10.2.8引物和探針：序列見附錄C,加DEPC水配制成100μmol/L的儲存濃度和10μmol/L工作濃度。同9.3。同9.4.1。9分別使用C.4和C.5中的引物和探針，檢測PRRSV-1和PRRSV-2。實時RT-PCR反應體系見表3。各種試劑充分混勻，2000r/min離心2min。將15μL實時RT-PCR反應混合液加入PCR反應管，然后加入10μL樣本RNA模板，密封反應管，500r/min離心30s。將所有檢測樣本的PCR管放入熒光PCR儀中。每次進行實時RT-PCR檢測均應設陽性對照、陰性對照及空白對照。試劑成分儲存液濃度終濃度體積/μl.RT-PCR緩沖液5MgCl?25mmol/L2.5mmol/LdNTPs0.2mmol/L上游引物下游引物探針0.255U/μL0.1U/μL5U/μL0.1U/μl4.75反轉錄，42℃(AMV)或50℃(M-MLV)30min;預變性，92℃3min;預擴增，92℃變性10s,45℃退火30s,72℃延伸1min,5個循環(huán)；擴增，92℃變性10s,60℃退火延伸30s,40個循環(huán)。在擴增階段每次循環(huán)的60℃退火延伸時收集熒光信號。10.5結果判定10.5.1試驗成立條件：陽性對照的Ct值應<28且出現(xiàn)特異性擴增曲線，陰性對照應無Ct值或Ct值≥40且無特異性擴增曲線，試驗結果有效；否則，應重新進行試驗。10.5.2被檢樣本Ct值≤30且出現(xiàn)特異性擴增曲線，判為陽性；當無Ct值或Ct值≥40,判為陰性；當30<Ct值<40且出現(xiàn)特異性擴增曲線，判為疑似。對疑似樣本，應進行重復檢測，Ct值<40且出現(xiàn)特異性擴增曲線即判為陽性，否則判為陰性。11免疫過氧化物酶單層試驗(IPMA)11.1主要器材11.1.2倒置生物顯微鏡。11.2主要試劑11.2.2PRRSV陽性血清、陰性血清和HRP-兔抗豬IgG結合物。使用前用血清稀釋液稀釋至工作濃度。11.3試驗方法11.3.1稀釋血清樣本：在空板的A排和E排各孔分別加入180μL的血清稀釋液，其余各孔加120μL。將20μL被檢血清和對照血清分別加入A排和E排各孔(1:10稀釋),搖動混勻；從A排和E排各孔內取40μL分別加入B排和F排孔，依次做1:40、1:160、1:640稀釋。11.3.2取上述板中稀釋血清樣本各50μL加入IPMA診斷板的相應孔內，封板后37℃孵育1h,棄去液體，用0.15mol/mLNaCl(含0.5%吐溫-80)洗板3次。11.3.3用0.15mol/LNaCl(含0.5%吐溫-80)稀釋HRP-兔抗豬IgG結合物為工作濃度，加入50μL結合物稀釋液于板的孔中，封板后37℃孵育1h,洗滌3次。11.3.4在各孔中加入顯色劑/底物溶液(AEC-H?O?)(按照B.5.1配制)50μL,在18℃~22℃室溫下作用至少30min,棄去液體，加入50μL0.05mol/L醋酸鈉溶液。診斷板置于倒置生物顯微鏡下觀察。陽性血清對照孔細胞質呈現(xiàn)深紅色的特異性染色，陰性血清對照孔細胞質不被染色。11.4.2被檢血清樣本孔30%～50%的細胞質呈現(xiàn)深紅色，判定為免疫過氧化物酶單層試驗陽性(IPMA+);細胞質未被染色，判定為免疫過氧化物酶單層試驗陰性(IPMA一)。與陽性血清對照相比，若整孔細胞被染色，則視為血清樣本的非特異性反應。血清滴度以50%以上的孔染色的最高稀釋度的倒數(shù)表示。血清樣本的滴度<10判定為陰性；血清樣本的滴度為10或40判定為弱陽性，非特異性染色常在此范圍內；血清樣本的滴度≥160判定為陽性。12間接免疫熒光試驗(IFA)12.1主要器材12.1.2倒置熒光顯微鏡。12.2主要試劑12.2.2PRRSV陽性血清、陰性血清和FITC-兔抗豬IgG結合物。12.3試驗方法12.3.1在96孔板中每孔加入PBS液190μL,再分別加入待檢血清、陽性血清、陰性血清10μL(1:20稀釋)。12.3.2取出IFA診斷板。加入150μLPBS,室溫浸潤5min,棄去板中液體，在吸水紙上輕輕拍干。12.3.3在IFA診斷板的感染和非感染細胞孔內分別加入50μL11.3.1中稀釋的血清，封板，置濕盒中37℃作用30min。12.3.4棄去板中血清，在吸水紙上輕輕拍干。每孔加入PBS液200μL,棄去孔內液體，重復洗板6次。12.3.5每孔加入工作濃度的FITC-兔抗豬IgG結合物50μL,置濕盒中37℃作用30min。12.3.6棄去板中結合物，用PBS洗滌4次后，最后在吸水紙上輕輕拍干。12.3.7將IFA診斷板置于倒置熒光顯微鏡下觀察。12.3.8血清滴度的測定：將血清樣本進行4倍倍比稀釋(1:20、1:80、1:160、1:320等),按上述方法進行IFA檢測。12.4結果判定12.4.1試驗成立條件：陽性血清對照中感染細胞孔細胞質出現(xiàn)典型的黃綠色特異性熒光，而未感染細胞孔無熒光；陰性血清對照中感染細胞孔和未感染細胞孔細胞質均不出現(xiàn)熒光。12.4.2被檢血清的感染細胞孔細胞質出現(xiàn)特異性黃綠色熒光，而未感染細胞孔不出現(xiàn)熒光，判定為陽性；被檢血清的未感染細胞和感染細胞孔細胞質均無特異性黃綠色熒光，判定為陰性。若血清樣本在1:20稀釋時出現(xiàn)可疑結果，應重新檢測，或2周～3周后重新采樣進行檢測，重復檢測仍為可疑，應綜合考慮其他檢測方法結果進行判定。血清樣本感染細胞孔呈現(xiàn)特異性熒光的最高稀釋度的倒數(shù)表示為血清效價。13間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(間接ELISA)13.1主要器材13.1.196孔平底聚苯乙烯酶標反應板。13.1.3酶聯(lián)免疫測定儀。13.2主要試劑13.2.1PRRSV抗原：提純的PRRSV重組N蛋白抗原(PRRSV-1或PRRSV-2,或其混合抗原)。13.2.2PRRSV陽性血清、陰性血清、HRP-兔抗豬IgG結合物。使用前用稀釋液稀釋至工作濃度。也可使用商品化的檢測PRRSVN蛋白抗體的試劑盒。13.3試驗方法13.3.1用抗原稀釋液將PRRSV抗原稀釋成工作濃度，加入96孔反應板中，每孔100μL,封板后置濕盒內37℃恒溫箱中感作60min,然后置4℃冰箱內過夜。13.3.2棄去板中稀釋液，加洗滌液洗板，300μL/孔，洗滌3次，每次1min。在吸水紙上輕輕拍干?？?，封板后置濕盒內37℃恒溫箱中反應60min。13.3.4同13.3.2進行洗滌。若使用商品化的ELISA試劑盒，無上述操作步驟。血清稀釋液，進行1:40稀釋。在PRRSV抗原包被反應板中加入稀釋的被檢血清、陽性血清對照和陰性血清對照，每孔100μL。陽性血清對照和陰性血清對照各加入相鄰的2個孔，每份血清樣本加1孔。封板后置濕盒內于37℃恒溫箱中反應30min。13.3.6同13.3.2進行洗滌。13.3.7加入工作濃度的HRP-兔抗豬IgG結合物，100μL/孔，封板后置濕盒內于37℃恒溫箱中反應30min。13.3.8同13.3.2洗滌。13.3.9加入新配制的顯色/底物溶液(TMB-H?O?),100μL/孔，封板后在37℃恒溫箱中避光反應13.3.10加入反應終止液(1mol/L氫氟酸溶液或10%SDS溶液),100μL/孔，終止反應。13.3.11光密度(OD)值測定：在酶聯(lián)免疫測定儀上讀取反應板各孔波長450nm(氫氟酸終止)或650nm(SDS終止)的OD值。PPNN圖1酶標反應板對照和樣本分布圖13.4結果判定13.4.1試驗成立條件：陽性血清對照平均OD值與陰性血清對照平均OD值的差值≥0.15時，試驗成立。否則，應重新進行試驗。13.4.2計算血清樣本的S/P比值。若被檢血清樣本的S/P比值≥0.4,判定為PRRSV抗體陽性。被檢血清樣本的S/P比值<0.3,判定為PRRSV抗體陰性。0.3≤被檢血清樣本的S/P比值<0.4,判定為可疑；對可疑樣本重復檢測一次，若仍為可疑，則可判定為陽性。血清樣本S/P比值的計算公式：S/P=(樣本OD值一陰性血清對照平均OD值)/(陽性血清對照平均OD值一陰性血清對照平均OD值)。14綜合判定14.1PRRS的診斷方法有多種，當在臨床上懷疑PRRS或PRRSV感染時，可根據(jù)實際情況選用上述方法中的一種或兩種進行確診。對于未接種過PRRS活疫苗的豬，當病毒分離與鑒定試驗為陽性時，可判定為PRRSV感染陽性；對于接種過PRRS活疫苗的豬，當病毒分離與鑒定試驗為陽性時，如果豬有臨床癥狀，可判定為PRRSV感染；如果豬無臨床癥狀，應進一步采用RT-PCR檢測并對擴增片段進行序列測定，以區(qū)分疫苗毒株或野毒株感染。RT-PCR和實時RT-PCR方法適用于PRRSV感染的快速診斷，當檢測結果用于PRRS新疫區(qū)的確定時，應對樣本進行病毒分離與鑒定。IPMA、IFA和間接ELISA適用于發(fā)病豬的群體診斷，但不能區(qū)分疫苗免疫豬和野毒感染豬。14.2依據(jù)臨床癥狀和病理變化可做出初步診斷，符合6.2、6.3的任何一項，可判為疑似PRRS。14.3符合6.2、6.3的任何一項，并且第8章～第13章的六種診斷方法中任何一項為陽性，可診斷為PRRS。14.4對于未接種過PRRS疫苗的豬，第8章～第13章的六種診斷方法中任何一項為陽性，均可判定為PRRSV感染；對于接種過PRRS滅活疫苗的豬，第8章～第10章的三種診斷方法中任何一項為陽性，均可判定為PRRSV感染。(規(guī)范性)A.1.1細胞生長液與維持液細胞生長液：加入10%犢牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基(含1%谷氨酰胺、青霉素100IU/mL、鏈霉素100μg/mL、慶大霉素50μg/mL、兩性霉素B10μg/mL,pH7.2)。細胞維持液：加入5%犢牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基(含1%谷氨酰胺、青霉素100IU/mL、鏈霉素100μg/mL、慶大霉素50μg/mL、兩性霉素B10μg/mL,pH7.2)。A.1.2細胞凍存液細胞生長液與二甲基亞砜(DMSO)按照8:2的比例混勻。取6周齡～8周齡的SPF豬或被證實無PRRSV感染的健康豬，動脈放血致死，立即無菌操作取肺臟，切勿劃破被膜。約200mLPBS液從氣管灌入肺臟，擠壓灌洗3次～4次，收集灌洗液，1000r/min離心10min,棄上清液，沉淀物用50mLPBS液再懸浮和離心洗滌2次～3次。最后的細胞泥用50mL細胞生長液懸浮，進行細胞計數(shù)。所得新鮮巨噬細胞應立即使用或分裝后凍存。A.3PAMs的凍存取細胞濃度為6×107/1.5mL的細胞懸液，加入等量細胞凍存液，緩慢滴加，邊加邊振搖。用細胞凍存管分裝，每管1.5mL,放一70℃過夜，轉入液氮中保存。液氮保存不同批次的巨噬細胞，不可混用。A.4PAMs的復蘇從液氮中取出冷凍細胞管，立即投入溫水(37℃左右)中迅速解凍。將細胞移入10倍量的RP-MI1640液(pH7.2)中，1000r/min離心10min,棄上清液，沉淀的細胞用細胞生長液懸浮，計數(shù)，稀釋至要求的細胞濃度后，即可使用。A.5PAMs的批次試驗每批巨噬細胞應檢驗合格后再使用。在96孔細胞培養(yǎng)板上用已知滴度的標準病毒感染巨噬細胞，并用標準的陽性血清和陰性血清進行IPMA或IFA測定。只有能支持特定滴度(TCIDso)的標準病毒良好生長的巨噬細胞，方可用于試驗。A.6IPMA診斷板的制備IPMA診斷板的制備步驟如下。a)將長滿單層的PAMs用消化液消化后，用RPMI1640細胞生長液懸浮細胞，使細胞濃度達1×10?個/mL,在96孔細胞培養(yǎng)板中每孔分別加入100μL,將細胞培養(yǎng)板放入37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18h～24h。b)用細胞營養(yǎng)液稀釋PRRSV為1×10?TCIDso/mL,每孔50μL,剩余2孔不加PRRSV作為對照孔。放入37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18h～24h;c)棄去培養(yǎng)液，用生理鹽水洗滌細胞培養(yǎng)板，棄去液體，在吸水紙上輕輕拍干，37℃干燥45min,密封后儲存于一20℃?zhèn)溆谩＜尤肜涞?%多聚甲醛PBS,室溫固定10min?；蛴帽涞臒o水乙醇4℃固定45min,或冰冷的80%丙酮固定45min。棄去上述固定液，用生理鹽水洗滌一次。A.7IFA診斷板的制備液消化MARC-145,用含8%FBS的MEM液稀釋成10?個/mL,加入上述96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔150μL;37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至單層細胞備用；無血清的MEM培養(yǎng)基稀釋PRRS標準毒，終濃度為10?TCID??/mL,分別加到上述96孔細胞培養(yǎng)板的1、3、5、7、9、11列各孔內，每孔50μL。置37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h～72h。棄去培養(yǎng)液，用PBS洗一次細胞，棄去PBS后，每孔加入丙酮150μL,置4℃作用30min,(規(guī)范性)試劑的配制配制pH7.2PBS液所需試劑如下：——8g氯化鈉(NaCl);——0.2g氯化鉀(KCl);——1.15g碳酸氫鈉(NaHCO?);——0.2g磷酸二氫鉀(KH?PO?)。試劑加三蒸水至1000mL,調節(jié)pH至7.2,高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩.25×TBE電泳緩沖液配制5×TBE電泳緩沖液所需試劑如下：——54.0gTris;——27.5g硼酸；試劑加三蒸水至1000mL,用5mol/L的鹽酸(HCl)調節(jié)pH至pH8.0。使用前用三蒸水5倍稀釋成工作濃度的TBE電泳緩沖液。B.3洗滌液(0.01mol/LPBS-0.05配制洗滌液(0.01mol/LPBS-0.05%吐溫-20,pH7.4)所需試劑如下：——0.2g磷酸二氫鉀(KH?PO?);——2.9g磷酸氫二鈉(Na?HPO?·12H?O);——8.0g氯化鈉(NaCl);——0.2g氯化鉀(KCl);——0.5mL吐溫-20。試劑加三蒸水至1000mL,現(xiàn)用現(xiàn)配。B.4血清稀釋液吐溫-80,用滅菌水定容到100mL,調節(jié)pH至7.2,4℃保存?zhèn)溆谩Ｓ糜贗PMA。B.4.2含1%犢牛血清白蛋白或10%馬血清的PBS液，4℃保存?zhèn)溆谩Ｓ糜陂g接ELISA。B.5顯色/底物溶液B.5.1AEC-H?O?B.5.1.1AEC貯存液。配制AEC貯存液所需試劑如下：——4mg氨乙基咔唑(3-amino-9-ethyl-carbazole,AEC);——4mL二甲基甲酰胺(N,N-dimethy-formamide)。充分溶解后置4℃避光保存?zhèn)溆?。B.5.1.20.05MpH5.0乙酸鈉緩沖液：稱取4.15g乙酸鈉(CH?COONa),加三蒸水至1000mL,充分B.5.1.3乙酸鹽緩沖液：量取14.8mL冰乙酸(CH?COOH),加入35.2mL、0.05mol/L、pH5.0乙酸鈉緩沖液，加三蒸水至50mL,用冰乙酸調節(jié)至pH5.0。B.5.2.20.1mol/