化學(xué)品 用虹鱒肝S9亞細(xì)胞組分測定體外固有清除率試驗_第1頁
化學(xué)品 用虹鱒肝S9亞細(xì)胞組分測定體外固有清除率試驗_第2頁
化學(xué)品 用虹鱒肝S9亞細(xì)胞組分測定體外固有清除率試驗_第3頁
化學(xué)品 用虹鱒肝S9亞細(xì)胞組分測定體外固有清除率試驗_第4頁
化學(xué)品 用虹鱒肝S9亞細(xì)胞組分測定體外固有清除率試驗_第5頁
已閱讀5頁,還剩39頁未讀 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

5GB/TXXXXX—XXXX化學(xué)品用虹鱒肝S9亞細(xì)胞組分測定體外固有清除率試驗本文件規(guī)定了化學(xué)品用虹鱒肝S9亞細(xì)胞組分測定體外固有清除率試驗的試驗原理、受試物信息、參比物、試驗準(zhǔn)備、試驗程序、數(shù)據(jù)處理、質(zhì)量保證與質(zhì)量控制和結(jié)果報告。本文件適用于化學(xué)品體外固有清除率的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T21801化學(xué)品快速生物降解性呼吸計量法試驗GB/T21802化學(xué)品快速生物降解性改進(jìn)的MITI試驗(I)GB/T21803化學(xué)品快速生物降解性DOC消減試驗GB/T21831化學(xué)品快速生物降解性密閉瓶法試驗GB/T21845化學(xué)品水溶解度試驗GB/T21852化學(xué)品分配系數(shù)(正辛醇-水)高效液相色譜法試驗GB/T21853化學(xué)品分配系數(shù)(正辛醇-水)搖瓶法試驗GB/T21855化學(xué)品與pH有關(guān)的水解作用試驗GB/T21856化學(xué)品快速生物降解性二氧化碳產(chǎn)生試驗GB/T21857化學(xué)品快速生物降解性改進(jìn)的OECD篩選試驗GB/T22052用液體蒸氣壓力計測定液體的蒸氣壓力溫度關(guān)系和初始分解溫度的方法GB/T22228工業(yè)用化學(xué)品固體及液體的蒸氣壓在10-1Pa至105Pa范圍內(nèi)的測定靜態(tài)法GB/T22229工業(yè)用化學(xué)品固體及液體的蒸氣壓在10-3Pa至1Pa范圍內(nèi)的測定蒸氣壓平衡法GB/T27850化學(xué)品快速生物降解性通則GB/T27861化學(xué)品魚類急性毒性試驗GB/T29763化學(xué)品稀有鮈鯽急性毒性試驗OECD化學(xué)品測試導(dǎo)則No.104蒸氣壓(Vapourpressure)OECD化學(xué)品測試導(dǎo)則No.112水中解離常數(shù)(DissociationConstantsinWater)OECD化學(xué)品測試導(dǎo)則No.310快速生物降解—密閉瓶二氧化碳法(ReadyBiodegradability-CO2inSealedVessels)OECD化學(xué)品測試導(dǎo)則No.316化學(xué)品在水中的光轉(zhuǎn)化—直接光解試驗(PhototransformationofChemicalsinWater–DirectPhotolysis)3術(shù)語、定義、符號和縮略語3.1術(shù)語和定義6GB/TXXXXX—XXXX下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1.1生物富集系數(shù)bioconcentrationfactor;BCF試驗吸收階段的任何時間,試驗生物體(或特定組織)內(nèi)某種受試物濃度與試驗介質(zhì)中該物質(zhì)濃度的3.1.2一級清除動力學(xué)first-orderdepletionkinetics底物分子清除的速率與其濃度成正比的化學(xué)反應(yīng)。3.1.3性腺指數(shù)gonadosomaticindex;GSI將性腺重量除以生物體重計算得到受試生物的性腺指數(shù)。注:GSI=(100×性腺質(zhì)量)/生物體重。虹鱒魚的性成熟度可以通過GSI來判斷,GSI<03.1.4S9亞細(xì)胞組分S9sub-cellularfraction來源于器官(通常是肝臟)表面的一部分組織,含有細(xì)胞溶質(zhì)和微粒體。注:在合適的介質(zhì)中勻漿,通常在9000g條件下離心20min,如果從魚中提取,離心速度為13000g。3.2符號和縮略語下列符號和縮略語適用于本文件。CLINVITRO,INT:體外固有清除率(invitrointrinsicclearance)CYP:細(xì)胞色素P450(cytochromeP450)DTT:DL-二硫蘇糖醇(DL-Dithiothreitol,CAS:3483-12-3)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid,CAS:60-00-4)EROD:乙氧基異吩噁唑-O-脫乙基酶(ethoxyresorufin-O-deethylase)GC:氣相色譜(gaschromatography)GST:谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathionetransferase)HBSS:Hanks平衡鹽溶液(Hanks'BalancedSaltSolution)HEPES:2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicacid,CAS:7365-45-9)HPLC:高效液相色譜(highperformanceliquidchromatography)IVIVEmodel:體外-體內(nèi)外推模型(Invitrotoinvivoextrapolationmodel)ke:清除速率常數(shù)Kow:正辛醇-水分配系數(shù)KM:米氏常數(shù)LOQ:定量限(limitofquantification)MS-222:3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸鹽(tricainemethanesulfonate,CAS:886-86-2)。7GB/TXXXXX—XXXXNADPH:β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸2′-磷酸,還原型四鈉鹽(nicotinamideadeninedinucleotide2'-phosphate,CAS:2646-71-1)PAPS:腺苷3′-磷酸鹽5′-磷酸硫酸鹽(adenosine3'-phosphate5'-phosphosulfate,CAS:109434-21-1)pKa:酸解離常數(shù)RT-S9:虹鱒魚肝S9亞細(xì)胞組分(rainbowtroutliverS9subcellularfraction)SULT:磺基轉(zhuǎn)移酶(sulfotransferase)UDPGA:尿苷5′-二磷酸葡萄糖醛酸三鈉鹽(uridine5'-diphosphoglucuronicacid,CAS:63700-19-6)UGT:尿苷5′-二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(uridine5'-diphospho-glucuronosyltransferase)UVCBs:未知或可變成分、復(fù)雜反應(yīng)產(chǎn)物或生物材料(unknownorvariablecomposition,complexreactionproductsorofbiologicalmaterials)Vmax:受試物濃度達(dá)到飽和條件下的最大酶促速率4試驗原理4.1制備和使用虹鱒魚肝S9亞細(xì)胞組分較為容易,在冷凍狀態(tài)(-80℃)下,組分樣本可以運(yùn)送到不同地點,存儲至少兩年。同一批次的RT-S9可用于在不同時間開展多個試驗。RT-S9所含的酶負(fù)責(zé)催化I期(如CYP)和Ⅱ期(如SULT、UGT、GST)的生物轉(zhuǎn)化。4.2用底物清除法測定受試物的CLINVITRO,INT,孵育體系由RT-S9、磷酸鉀緩沖液、酶輔因子和丙甲甘肽組成,作用于I期和Ⅱ期的生物轉(zhuǎn)化,通過添加受試物啟動反應(yīng)。為了在不同的時間點收集樣品,將等份的懸浮液轉(zhuǎn)移至終止溶液中從而終止反應(yīng)。使用經(jīng)過驗證的分析方法測定體系中受試物濃度隨著時間下降的變化趨勢,計算獲得CLINVITRO,INT。使用酶促失活的RT-S9為陰性對照,以區(qū)分酶促生物轉(zhuǎn)化和非生物下降。5受試物信息在試驗前,應(yīng)掌握受試物的下列信息:a)水溶性;b)在有機(jī)溶劑中的溶解度(如需制備受試物貯備液);c)正辛醇-水分配系數(shù)或關(guān)于分配行為的其他信息;d)在試驗用水/介質(zhì)中的穩(wěn)定性;e)蒸氣壓;f)關(guān)于生物或非生物的降解性信息,如快速生物降解性;g)酸解離常數(shù),用于可能電離的受試物;h)應(yīng)提供已知準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度的分析方法,用于定量分析混合培養(yǎng)體系中的受試物濃度,并提供詳細(xì)的樣品制備和儲存方法。應(yīng)明確培養(yǎng)體系中受試物的定量限。6參比物采用適當(dāng)?shù)膮⒈任镒鳛殛栃詫φ战⑾嚓P(guān)試驗系統(tǒng)并檢驗其有效性,宜采用芘作為參比物。7試驗準(zhǔn)備8GB/TXXXXX—XXXX7.1儀器設(shè)備a)4℃冰箱;b)-20℃冰箱;c)-80℃冰箱;d)使用分析天平稱量試劑、輔因子和受試物;e)pH計;f)旋渦混合器;g)在孵育/終止反應(yīng)階段,用于微量離心管或其他試驗管的冷凍離心機(jī);h)培養(yǎng)設(shè)備,如振蕩低溫水浴振蕩器、具有加熱和制冷功能的振蕩培養(yǎng)箱、具有震蕩功能的熱混合器;i)用于配制溶液、試劑的玻璃器皿;j)用于培養(yǎng)的玻璃瓶(如7mL閃爍管);k)1.5mL微量離心管;l)用于HPLC/GC或其他分析儀器的玻璃樣品瓶;m)移液器或滴管。7.2輔因子和化學(xué)試劑7.2.1以下應(yīng)為分析純或同等級別:a)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸2'-磷酸四鈉鹽;b)尿苷5′-二磷酸葡萄糖醛酸三鈉鹽;c)L-還原型谷胱甘肽;d)腺苷3'-磷酸5′-磷酸硫酸鋰鹽化合物;e)丙甲甘肽;f)磷酸氫二鉀(K2HPO4g)磷酸二氫鉀(KH2PO4)。7.2.2分析受試物所用試劑應(yīng)滿足以下要求:a)能溶解受試物的溶劑應(yīng)為分析純或同等級別(如甲醇、乙腈和丙酮所用溶劑應(yīng)與磷酸鉀反應(yīng)體系中使用的水溶介質(zhì)相混溶;b)終止和萃取溶劑應(yīng)為分析純或同等級別(如甲醇、乙腈、二氯甲烷、甲基叔丁基醚)。7.3RT-S97.3.1RT-S9可來自商售,或按照附錄A中的示例進(jìn)行制備。7.3.2應(yīng)測定每批次RT-S9的蛋白濃度(見附錄B),同時應(yīng)評估每批次RT-S9酶催化Ⅰ期和Ⅱ期的生物轉(zhuǎn)化能力,酶活力的測定方法見附錄B。在試驗開始時或RT-S9首次使用前,應(yīng)利用上述特征分析或者已知參比物來檢驗新批次RT-S9的有效活性。保存期間,應(yīng)隨時監(jiān)測RT-S9的活性。7.3.3試驗應(yīng)包含酶促失活(如加熱失活)的陰性對照組,通過陰性對照區(qū)分酶活性轉(zhuǎn)化和非生物性下降(緣于孵育瓶吸附、揮發(fā)以及非生物降解)。酶加熱失活的操作方法見附錄C。8試驗程序8.1試驗條件8.1.1首先開展預(yù)試驗,確定底物濃度、蛋白質(zhì)濃度和孵育時間等參數(shù),建立的孵育條件應(yīng)滿足準(zhǔn)確9GB/TXXXXX—XXXX測定肝固有體外清除率和建立一級清除動力學(xué)的要求(見附錄D)。8.1.2足量的取樣點有助于構(gòu)建高質(zhì)量的濃度對數(shù)轉(zhuǎn)換回歸方程,至少設(shè)置6個采樣點。8.1.3包括7個時間點的單瓶法測試示例見圖E.1,該方法宜用于濃度易分析的受試物(如無揮發(fā)性、不吸附在容器壁上、在培養(yǎng)系統(tǒng)中可迅速分布其結(jié)果變異性較小,且操作簡單。對于揮發(fā)性、疏水性強(qiáng)的受試物,宜采用多瓶法(見圖E.2)。8.1.4每個試驗應(yīng)至少包括兩次完整的試驗操作以確定CLINVITRO,INT,如果每次操作能滿足以下條件,則兩次操作可在不同日期也可在同一天進(jìn)行:a)單獨(dú)配制新的貯備液和試驗溶液;b)使用單獨(dú)解凍的RT-S9,RT-S9可源于同一批次。如果2次操作中活性RT-S9的回歸分析具有顯著性差異(如對斜率開展t-檢驗,p<0.05應(yīng)進(jìn)行第3次操作,以獲得2次有效結(jié)果。8.1.5在每次操作中,一瓶活性RT-S9和一瓶酶促失活的RT-S9需添加受試物,另一瓶活性RT-S9添加參比物。在不同的時間點采樣(如2min、10min、20min、30min、60min、90min、120min)。有時需要增加試驗瓶數(shù)量(如每瓶3個平行)以保證精確分析受試物濃度。對于酶促失活的對照組,可根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果減少采樣次數(shù)(見附錄E)。8.2受試物、緩沖液、輔因子和終止溶液的配制8.2.1試驗溶液用磷酸鉀緩沖液(見附錄F)或提前測試過的溶劑配制受試物貯備液。常見溶劑如丙酮、乙腈和甲醇。若貯備液不是新鮮配制,應(yīng)在試驗前評估受試物貯備液的穩(wěn)定性。在試驗當(dāng)天,根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果,用磷酸鉀緩沖液(見附錄F)或有機(jī)溶劑稀釋受試物貯備液制備所需濃度的試驗溶液。如使用有機(jī)溶劑,其在混合孵育體系中的含量應(yīng)盡可能低,不應(yīng)超過1%,以免抑制酶活性。丙甲甘肽溶液中已含有一定量有機(jī)溶劑,可在一定程度上影響反應(yīng)體系中有機(jī)溶劑的終濃度(如0.25%)。通常受試物試驗濃度應(yīng)比分析方法的LOQ高約10倍,能產(chǎn)生預(yù)試驗中確定的一級動力學(xué)即可。緩沖溶液、輔因子和丙甲甘肽的配制見附錄F。貯備液可提前配制,如試驗開始前1天,但稀釋溶液應(yīng)在試驗當(dāng)天配制。8.2.2終止溶液終止溶液包括甲醇、乙腈、二氯甲烷、甲基叔丁醚等有機(jī)溶劑,可能還包含內(nèi)標(biāo)。通??深A(yù)先添加終止溶液到1.5mL微量離心管中并保存于冰上,如添加400μL終止溶液,再加入100μL樣品終止反應(yīng)。對于揮發(fā)性溶劑(如二氯甲烷,甲基叔丁醚應(yīng)將管蓋蓋緊并冷藏,或在取樣時間點之前直接添加溶劑。對于與塑料相互作用的溶劑,應(yīng)采用玻璃管。8.3RT-S9稀釋液和混合孵育體系8.3.1解凍一定體積的活性RT-S9和酶促失活的RT-S9,用磷酸鉀緩沖液(見附錄F)稀釋。如果混合孵育體系中蛋白終濃度為1mg/mL,則可稀釋至10×蛋白濃度(如10mg/mL),計算方法見附錄F?;钚訰T-S9應(yīng)在冰水浴中解凍。宜額外增加25%~30%體積的活性/酶促失活的RT-S9,以提供適度過量的生物材料。例如,如果活性和非活性RT-S9各需300μLRT-S9稀釋液,可分別制備400μL。8.3.2如圖E.1中所示的單瓶法,使用2個裝有活性RT-S9的小瓶和1個裝有酶促失活RT-S9的小瓶,同時考慮設(shè)置的取樣時間點數(shù)。過量的活性RT-S9不應(yīng)重新冷凍后用次使用,但可用于制備非活性RT-S9,過量的非活性RT-S9可以重新冷凍備用。8.3.3添加400μL磷酸鉀緩沖液(pH7.8,見附錄F)到3個孵育瓶中,再將活性或酶促失活的RT-S9稀釋液各100μL加入相應(yīng)瓶中,加入100μL丙甲甘肽工作溶液(250μg/mL)到每個孵育瓶中,并GB/TXXXXX—XXXX將孵育瓶置于冰上預(yù)孵育15min。8.3.4如附件F所述制備輔因子混合液,主要包含NADPH、UDPGA、GSH和PAPS,將其充分混合并置于冰上,盡可能縮短放置時間。將400μL輔因子混合液加入到每個預(yù)培養(yǎng)瓶中(置于冰上)。將每個小瓶輕輕旋轉(zhuǎn)直至充分混合,混合液成分見圖F.1。注:因PAPS易迅速降解,應(yīng)在預(yù)孵育期間配制輔因子混合液,并且緊隨著8.3.5將孵育瓶置于振蕩水浴或培養(yǎng)箱中,在11℃±1℃下輕搖,預(yù)孵育10min。8.4啟動反應(yīng)和終止反應(yīng)8.4.1將受試物溶液(通常為5μL,取決于受試物貯備液的濃度)直接加入每瓶孵育混合體系(通常為1mL)中以啟動反應(yīng)。將孵育瓶旋轉(zhuǎn)以使受試物均勻分散并松散地蓋上蓋子。8.4.2在指定時間點取樣,將孵育瓶從水浴或培養(yǎng)箱中取出,輕輕旋轉(zhuǎn)或搖動,用移液器取出等分試樣(如100μL)并直接轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的含有預(yù)冷終止液的1.5mL微型離心管中(置于冰上)。宜將移液器在終止液中上下吸取三次,以確保樣品的全部轉(zhuǎn)移。8.4.3將微量離心管置于冰上,直至收集到所有時間點的樣品。若使用與水混溶的溶劑作為終止溶液,離心前將樣品冷藏過夜將有助于促進(jìn)蛋白質(zhì)的完全沉淀。如果使用揮發(fā)性溶劑如二氯甲烷和甲基叔丁醚,樣品應(yīng)經(jīng)過提取,宜在停止反應(yīng)后立即提取。應(yīng)通過開展預(yù)試驗來確定終止反應(yīng)后蛋白質(zhì)是否完全沉淀。8.4.4取樣完成后(針對揮發(fā)性溶劑,應(yīng)在每個采樣點后對微量離心管進(jìn)行混勻(如1500r/min~2000r/min,渦旋3min),離心(如20000g,4℃條件下離心5min)。如果預(yù)試驗表明受試物回收率較差,可延長渦旋時間(如10min)。某些受試物需冷藏過夜,以確保最大限度地提取。將上層清液轉(zhuǎn)移至HPLC/GC樣品瓶中,在-20℃±1℃條件下保存至分析。8.5濃度分析使用經(jīng)驗證的分析方法測定樣品中受試物的濃度。由于試驗質(zhì)量主要取決于化學(xué)分析的準(zhǔn)確性、精密度和靈敏度,因此應(yīng)提前驗證受試物分析方法的準(zhǔn)確性、精密度和重現(xiàn)性,及其在混合孵育體系中的回收率(80%~120%)。9數(shù)據(jù)處理以經(jīng)log10轉(zhuǎn)換的底物濃度對時間作圖,應(yīng)呈現(xiàn)對數(shù)線性下降(R2>0.85)。如果曲線圖上顯示明顯的離群值,可使用統(tǒng)計上有效的離群檢驗去除虛假數(shù)據(jù)點,并記錄去除理由。有時可在試驗開始或結(jié)束時觀察到非線性現(xiàn)象,可能與受試物降解或酶活性喪失/抑制有關(guān)。清除速率應(yīng)在曲線的線性范圍內(nèi)確定,至少包括6個數(shù)據(jù)點。如果在失活RT-S9的陰性對照中觀察到受試物發(fā)生非生物損失,即使優(yōu)化試驗條件該損失仍無法避免(即非生物下降>20%),可從活性RT-S9試驗組測得的消耗速率中扣除該損失速率,以得到校正的體外固有清除率,但此時應(yīng)驗證非生物損失過程遵循一級動力學(xué)。一級清除速率常數(shù),ke(h-1),由-2.3乘以對數(shù)-線性曲線的斜率計算得到。用ke除以反應(yīng)體系中RT-S9蛋白濃度即可得到CLINVITRO,INT。CLINVITRO,INT= 式中:CLINVITRO,INT——體外固有清除率,單位為mL/h/mg蛋白;CRT-S9——培養(yǎng)體系中RT-S9蛋白濃度,單位為mg/mL;GB/TXXXXX—XXXXke——一級清除速率常數(shù),為-2.3乘以對數(shù)下降曲線的斜率。10質(zhì)量保證與質(zhì)量控制如滿足以下條件,試驗結(jié)果有效:a)應(yīng)對每批次RT-S9進(jìn)行評估,應(yīng)滿足附錄B中所述的催化I期和Ⅱ期代謝酶生物轉(zhuǎn)化能力的要求;b)應(yīng)確定每批次RT-S9蛋白濃度(見附錄B),并且應(yīng)在預(yù)試驗中提前確定測試底物(受試物)和蛋白濃度,以符合一級動力學(xué)要求?;旌戏跤w系的蛋白濃度可在0.25mg/mL~2mg/mL范圍內(nèi),常用濃度為1mg/mL。c)在培養(yǎng)期間,陰性對照組(酶促失活RT-S9)中受試物母體無顯著損失(如<活性RT-S9試驗組中測得降低量的20%),且無明顯增加(如>20%)。d)至少通過6個時間點確定CLINVITRO,INT,計算回歸方程和斜率,R2值應(yīng)≥0.85。對于代謝較慢的受試物(如斜率較小),R2可能<0.85,此時應(yīng)仔細(xì)考慮在進(jìn)行試驗與不進(jìn)行試驗的情況下,所得斜率與0是否存在顯著性差異。e)應(yīng)至少進(jìn)行兩次獨(dú)立的試驗操作,如果RT-S9活性組的2次回歸計算結(jié)果有顯著性差異(如斜率t檢驗的p<0.05),則應(yīng)進(jìn)行第3次試驗以獲得2次可靠的結(jié)果。11結(jié)果報告試驗報告應(yīng)包括以下內(nèi)容:a)受試物:——單組分物質(zhì):物理性狀、水溶解性及相關(guān)的物理化學(xué)性質(zhì);化學(xué)標(biāo)識,如IUPAC名稱或CAS名稱、CAS號、SMILES碼或InChI碼、結(jié)構(gòu)式、純度等信息,在適當(dāng)情況下還應(yīng)提供雜質(zhì)的化學(xué)鑒別信息(必要時包括有機(jī)碳含量);——多組分物質(zhì)、不明復(fù)雜物質(zhì)(UVCBs組分未知或者可變的物質(zhì)、復(fù)雜反應(yīng)產(chǎn)物或者生物材料)和混合物:盡可能提供各組分的化學(xué)鑒別信息(如上)、含量和相關(guān)的物理-化學(xué)特性;——受試物的定量分析方法。b)RT-S9:——如源于購買,應(yīng)提供以下內(nèi)容:商業(yè)來源;虹鱒魚供應(yīng)商;虹鱒魚種系;馴養(yǎng)環(huán)境溫度;虹鱒魚體重;肝臟重量;性腺指數(shù)(用以確定性成熟程度)?!缭从谥苽洌姳鞟.2中模板?!卣髅枋觯ㄒ姼戒汢)。c)試驗條件:——受試物和參比物的濃度;——受試物和參比物溶液配制方法【名稱、助溶劑濃度(如有)】;GB/TXXXXX—XXXX——試劑的配制及組成;——混合孵育體系的配制及組成;——孵育溫度;——混合孵育體系的蛋白含量;——試驗方法:孵育方法(單瓶或多瓶);——平行數(shù)量(如果每次操作多于1個平行);——獨(dú)立試驗操作的次數(shù);——取樣時間點;——預(yù)試驗的描述。d)分析方法:——完整描述所使用的受試物濃度分析的過程,以及分析方法的檢出限、定量限、變異系數(shù)和回收率,標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)的配制方法等。e)統(tǒng)計方法:——用于排除異常采樣點和/或試驗操作的描述和統(tǒng)計方法。f)結(jié)果:——預(yù)試驗結(jié)果;——單瓶法的數(shù)據(jù),每個獨(dú)立試驗操作(包括各濃度試驗組、陽性對照組、陰性對照組)的采樣時間點;——生成的代謝產(chǎn)物(如有),包括代謝產(chǎn)物和代謝途徑的鑒別;——每個操作中,分別計算受試物和參比物的活性和非活性RT-S9的CLINVITRO,INT;——無顯著性差異的各試驗操作的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差,以及平均CLINVITRO,INT的t檢驗結(jié)果;——被排除的采樣點或試驗操作;——試驗中的異常情況,對本文件的所有偏離及相關(guān)信息。GB/TXXXXX—XXXXA(資料性)虹鱒魚肝S9亞細(xì)胞組分制備方法A.1虹鱒魚的相關(guān)要求a)RT-S9應(yīng)從性腺發(fā)育不成熟的虹鱒魚中獲取。已有研究表明,性發(fā)育不成熟的虹鱒魚的代謝能力與其性別無關(guān),因此收集RT-S9時無需考慮魚的性別。b)如魚來源于購買,應(yīng)在使用前在實驗室至少馴養(yǎng)兩周。魚類在馴養(yǎng)期內(nèi)不應(yīng)接受疾病治療,如有可能,應(yīng)完全避免由供應(yīng)商進(jìn)行任何疾病治療。不應(yīng)采用已有臨床癥狀的魚。c)虹鱒魚的養(yǎng)殖溫度通常為10℃~15℃,實驗室馴養(yǎng)時應(yīng)接近這一溫度并維持在±2℃變化范圍內(nèi)。應(yīng)采取較低的飼養(yǎng)密度,以確保最佳的生長條件和動物福利。d)定期測定水質(zhì)參數(shù)并記錄下來,包括:pH值、總堿度(mg/LCaCO3)、溶解氧(mg/L,轉(zhuǎn)換為飽和度百分比)和氨氮(mg/L)(見表A.2)。e)記錄魚的馴養(yǎng)條件,包括:光周期、飼養(yǎng)方式、飼料類型、水溫、馴養(yǎng)密度(如kg魚/L)和每缸魚數(shù)量(尾/缸見表A.2)。應(yīng)報告上述具體信息,以便在后續(xù)應(yīng)用(如BCF預(yù)測模型)中使用特定參數(shù)。A.2制備過程a)宜使用新鮮肝臟組織制備S9,冷凍和解凍魚的肝臟組織會降低CYP酶活性。b)通常從多條(3至6條)魚中收集RT-S9,這有利于減少單尾魚的影響,更好地代表一個種群。c)人道處死魚后,用不含Ca2+/Mg2+的清洗緩沖液(見表A.1)經(jīng)肝門靜脈插管灌注,清除肝臟血d)切除魚肝臟,用勻漿緩沖液(見表A.1)進(jìn)行勻漿后,在4℃下離心(13000g~15000g)20min。e)將離心后的上清液等量分裝轉(zhuǎn)移至微量離心管或冷凍管中,并置于-80℃±1℃中保存。A.3設(shè)備和材料A.3.1儀器a)用于麻醉魚的容器;b)電子天平(1g~2000gc)鑷子,鋒利的外科手術(shù)剪刀,單刃刀片;d)冷凍離心機(jī)(如可用于50mL離心管);e)錐形離心管(如50mL);f)23-G×3/4安全翼式輸液器(蝴蝶導(dǎo)管);g)30mL一次性塑料注射器;h)蠕動泵;GB/TXXXXX—XXXXj)6cm預(yù)冷玻璃培養(yǎng)皿;k)玻璃燒杯;l)30mLWheatonPotter-Elvehjem組織研磨器和特氟龍研磨棒;m)多速臺式鉆床;n)吸管;o)吸管帽;p)血清移液管輔助器;q)血清移液管;r)1.8mL工作容積低溫儲存管;s)微量離心管。A.3.2化學(xué)試劑a)3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸鹽;b)碳酸氫鈉(NaHCO3c)無Ca2+、Mg2+Hanks平衡鹽溶液;d)4-(2-羥乙基)1-哌嗪乙烷磺酸;e)1mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖液,pH7.8;f)1mol/L氯化鉀(KCl);g)0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA-Na2)緩沖液;h)100mmol/L二硫代蘇糖醇;i)蛋白酶抑制劑混合物(可選);j)蔗糖;k)1mol/L氫氧化鈉(NaOH);l)1mol/L氫氧化鉀(KOH);m)RT-S9蛋白含量測定試劑盒。A.4化學(xué)試劑和溶液的配制A.4.1麻醉劑的配制配制MS-222溶液(CAS:886-86-2,150mg/L):所用的水應(yīng)與馴養(yǎng)魚的水一致。如:配制8L,向水中加入1.2gMS-222,攪拌至溶解。使用預(yù)先確定的NaHCO3量維持水的pH值,針對低堿度的水,NaHCO3所需的用量大約是MS-222的3倍。A.4.2緩沖液的配制A.4.2.1按照表A.1配制清洗緩沖液和勻漿緩沖液,配制量應(yīng)大約滿足15條魚的灌注。A.4.2.2配制清洗緩沖液時,將EDTA(終濃度2.3mmol/L)和HEPES(終濃度10mmol/L)加入到HBSS平衡鹽溶液(含4.2mmol/L即0.35g/LNaHCO3,不含Ca2+和Mg2+)中。例如配制1L清洗緩沖溶液,應(yīng)將4.6mL0.5mol/LEDTA和10mL1mol/LHEPES加入到985.4mLHBSS中,用1MNaOH將清洗緩沖液pH調(diào)節(jié)至7.8,并于4℃下貯存。緩沖液應(yīng)當(dāng)月配制,如發(fā)現(xiàn)明顯污染(如出現(xiàn)漂浮顆粒或渾濁)應(yīng)棄除。A.4.2.3配制勻漿緩沖液時,50mL1mol/LTris-HCl與950mL超純水混合,取800mL50mmol/LTris-HCl與150mL1mol/LKCl,4mL0.5mol/LEDTA,10mL100mmol/LDTT和85.55g蔗糖于1L容量瓶中混合,用1mol/LKOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.8,用50mmol/LTris-HCl溶液定容至刻度。勻漿緩GB/TXXXXX—XXXX沖液于4℃條件下貯存。緩沖液應(yīng)當(dāng)月配制,如發(fā)現(xiàn)明顯污染(如漂浮顆?;驕啙幔?yīng)丟棄。如果使用了蛋白酶抑制劑,最后一步應(yīng)該添加蛋白酶抑制劑。表A.1清洗緩沖液和勻漿緩沖液所需的試劑及濃度—a蛋白酶抑制劑可加入勻漿緩沖液中。A.5虹鱒魚的準(zhǔn)備和解剖a)在處死魚之前應(yīng)對魚進(jìn)行24h禁食。b)由于RT-S9蛋白質(zhì)在室溫下會快速降解,應(yīng)盡量使用預(yù)冷的緩沖液、儀器和玻璃器皿進(jìn)行相關(guān)試驗操作。c)將魚捕獲后置于一個裝有8L麻醉劑(MS-222)的水缸或水桶中。魚應(yīng)完全浸沒在麻醉劑中至少1min,當(dāng)魚鰓蓋停止運(yùn)動,并完全失去平衡和肌肉張力,且對刺激無反應(yīng)(通過用力擠壓魚尾底部來判斷)時,表明魚已完全麻醉。隨后,對魚的頭部進(jìn)行猛烈打擊,以人道主義的方式將魚處死。d)稱量并記錄魚的體重。e)魚腹部朝上,采用以下方式進(jìn)行解剖(見圖A.1):f)用解剖刀從魚的肛門到咽峽部形成一個中間切口,注意解剖刀不應(yīng)插入太深;g)從中間切口的末端近魚尾處延伸至背部表面一半位置處橫切一個小口;h)同樣從中間切口末端近鰓蓋處開一個類似的橫切小口。i)切除翻開的皮瓣組織,暴露體腔,肝臟是暗紅色的。找到肝門靜脈的腹側(cè)分支(從腸到肝門小心清除遮擋的結(jié)締組織(見圖A.2)。j)在安全翼式輸液器(23-G×3/4-in)插入肝門靜脈之前,可以選擇先在靜脈下方用絲質(zhì)縫合線(4/0)松散地進(jìn)行纏繞,輸液器連接一個30mL注射器,里面裝有預(yù)冷的清洗緩沖液(見表A.1)。插入后用4/0縫合絲線緊緊地纏繞固定住注射器的針頭,以防止清洗緩沖液從插入部位泄漏。切斷從肝臟通往心臟的肝靜脈,以便進(jìn)行組織引流。A.6肝臟灌注GB/TXXXXX—XXXXa)用20mL~30mL預(yù)冷的清洗緩沖液對肝臟進(jìn)行灌注(約10mL/min~15mL/min),直到肝臟的顏色變?yōu)榘咨珵橹梗ㄇ宄闻K中的血液,如圖A.3)。灌注時對肝臟進(jìn)行輕輕地按壓有助于血液流動,尤其是血流集中的部位。清除血液是為了確保RT-S9中不含血源代謝酶,如血漿蛋白酶。b)清除血液之后,將肝臟切除放置在冰冷的培養(yǎng)皿中,注意不要切破膽囊(一個薄壁囊,通常包含暗綠色或棕色的膽汁)。用剪刀剪斷膽囊和肝臟的連接部分,小心移除膽囊。手持一個30mL注射器用5mL~10mL預(yù)冷的清洗緩沖液對肝臟進(jìn)行沖洗,由于膽囊汁會污染肝臟RT-S9且使其代謝酶失活或變性,故通過沖洗步驟以避免肝臟與少量膽汁的接觸。一旦肝臟接觸了大量膽汁,應(yīng)停止后續(xù)處理。c)用紙巾將肝臟表面多余液體去除之后,對肝臟稱重,精確到0.01g。記錄下肝臟的重量(見表A.2)。將肝臟置于一個250mL燒杯中,里面裝有150mL預(yù)冷的勻漿緩沖液,保持冰冷環(huán)境直至同一批次的魚全部完成肝臟收集。d)將性腺(卵巢或睪丸)整體取出并稱重,精確到0.01g。供試動物的性腺指數(shù)(GSI)等于性腺重量除以動物體重。記錄下性腺重量和GSI(見表A.2)。性腺(睪丸或卵巢)表現(xiàn)為沿著腎腹側(cè)腹膜腔縱向延伸的兩種組織??赏ㄟ^測量GSI判斷虹鱒魚的性成熟。一般,雄魚GSI<0.05,雌魚GSI<0.5則認(rèn)為性不成熟,也可通過組織學(xué)判斷魚的性成熟。e)上述操作應(yīng)快速進(jìn)行,從捕魚開始至將肝臟置于勻漿緩沖液中單尾魚總時長不超過15min。A.7RT-S9的制備a)對肝臟進(jìn)行取樣和稱重后,按如下方式進(jìn)行:用剪刀或單邊刀片將肝臟切成小片0.5cm2)。b)將切碎的肝臟組織連同勻漿液一起轉(zhuǎn)移至Potter-Elvehjem組織研磨器(預(yù)冷并保持在冰上用額外等量(與肝臟重量相同)的勻漿緩沖液沖洗燒杯,將沖洗液全部倒入研磨器中。使用特氟龍研磨棒(通常間隙為0.1mm~0.15mm)將組織勻漿,該研杵連接在低速(如500r/min)的臺式鉆床上。操作時使研杵緩慢到達(dá)研磨器底部(每次沖程10s~15s重復(fù)4~5次。其他的均質(zhì)方式可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性,需避免采用。c)將肝臟勻漿灌入一個50mL圓底離心管(預(yù)冷并保持在冰上)中。假定魚體重范圍400g~600g,取樣數(shù)量為4~5條,原始肝臟勻漿的預(yù)期體積約為50mL~70mL。d)肝臟勻漿在13000g,4℃條件下,離心20min。將離心管輕輕地從離心機(jī)中取出。上清液表面可能形成的一層黃色脂質(zhì)層,這與所采集肝臟的脂肪含量有關(guān),用吸管將黃色脂質(zhì)層吸出并棄除。將剩余的上清液(即混合的RT-S9)倒入或用血清吸管吸出轉(zhuǎn)入150mL預(yù)冷的燒杯中,轉(zhuǎn)移時注意不要倒出底部的肝臟組織。離心管底部的沉淀顆粒組織相對較硬且呈棕色,其表面可能形成一層淺色物質(zhì)。e)合并的RT-S9用玻棒或者其他類似的混勻,將等份(如0.5mL)的溶液轉(zhuǎn)移至已標(biāo)記的1.8mL的預(yù)冷儲存管或微型離心管中,用液氮快速冷凍或者其他等同條件中。注意:RT-S9應(yīng)一直放置在冰上。推薦大小的4~5條魚將會產(chǎn)生出35mL~45mLRT-S9,假設(shè)將這些分成0.5mL等份儲存,需要70~90個預(yù)先標(biāo)記好的已預(yù)冷的儲存管。儲存管在加入樣品前應(yīng)提前置于-20℃冰箱中進(jìn)行預(yù)冷,使用前預(yù)冷不超過24h。f)將含有RT-S9的儲存管收集起來并轉(zhuǎn)移至液氮或-80℃±1℃冰箱中儲存,可貯存至少2年。g)記錄一次取樣中獲得的RT-S9總體積。該值用于計算每克肝臟組織中RT-S9蛋白濃度。A.8RT-S9蛋白質(zhì)含量的測定GB/TXXXXX—XXXX取3個RT-S9樣品管放在冰水浴中解凍(如用微型離心管支架置于盛有冰水的燒杯中一旦冰晶體融化就加入冰塊。測定同源均一的RT-S9樣品中蛋白含量,可使用標(biāo)準(zhǔn)測定方法如考馬斯亮藍(lán)法(Bradfordassay)或商品化的蛋白含量測定試劑盒,遵照相關(guān)說明書進(jìn)行操作(如96孔平底板和微孔板讀取器,生物分析儀,比色皿和分光光度計或其他儀器和方法,可以準(zhǔn)確地測定蛋白濃度)。對RT-S9可適當(dāng)稀釋,以使測定值落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi),以避免蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果偏低或偏高。給定批次RT-S9的蛋白含量為所測樣品的平均值。表A.2魚類信息、馴養(yǎng)條件和觀察記錄):水溫(℃):):水的流速(L/min):):1234GB/TXXXXX—XXXX圖A.1魚安樂死后需要通過切口暴露的魚內(nèi)部器官圖A.2輸液器插入魚的肝門靜脈清除肝臟中的血液GB/TXXXXX—XXXX注:圖中魚已達(dá)到性成熟,僅用于展示說明,應(yīng)使用性未成熟的圖A.3成功清除血液后變白的肝臟外觀GB/TXXXXX—XXXX(資料性)虹鱒魚肝亞細(xì)胞組分的表征評估每批次RT-S9催化I期和Ⅱ期的生物轉(zhuǎn)化能力,這些表征測定可在新制備或解凍的RT-S9上進(jìn)行。表B.1中列出催化I期和Ⅱ期生物轉(zhuǎn)化活性測定的建議,簡要描述了常用的方法和底物,測定的結(jié)果應(yīng)包括在測試報告中可使用已知的受試物評估RT-S9的活性。通常,將RT-S9稀釋至試驗所需的蛋白濃度,將結(jié)果轉(zhuǎn)換化為蛋白含量。如果已知受試物可能的生物轉(zhuǎn)化途徑,則可預(yù)先評估該途徑,前提是有標(biāo)準(zhǔn)化的測定方法??墒褂脺y定的方法如評估30分鐘時的酶活性或測定動力學(xué)活性。如果將結(jié)果與其他實驗室進(jìn)行比較,則應(yīng)考慮確定的條件如底物濃度、蛋白濃度、孵育時間、評價終點或采樣時間點。表B.1常用于表征RT-S9酶活性測定的底物酶階段Ⅰ7-乙氧基試鹵靈O-脫烷基化7-甲氧基異酚噁唑O-脫烷基7-羥基吩噁嗪酮二戊醚O-脫階段ⅡGB/TXXXXX—XXXX(資料性)酶促失活的虹鱒魚肝S9亞細(xì)胞組分的制備宜提前制備大量酶促失活的RT-S9,并將其等分試樣(如0.5mL),冷凍保存。以酶促失活的RT-S9為底物清除測定的陰性對照材料。通常,將RT-S9置于一個加蓋的小瓶中并于100℃沸水中加熱滅活,如果加熱滅活獲得的材料中存在過度凝集的樣品,可使用手持式均質(zhì)器處理所得的酶促失活材料,以方便吸取。對照。相關(guān)的儀器a)加熱板;b)燒杯(水?。籧)用于在水浴中煮沸RT-S9的帶蓋容器;d)手持式組織勻漿器(如15mL可選e)1.5mL微量離心管。材料:已知蛋白濃度的RT-S9。記錄懸浮液的體積,并將懸浮液轉(zhuǎn)移至受熱安全的容器中(優(yōu)選玻璃)。燒杯加水后置于加熱板上加熱至沸騰,將帶有RT-S9懸浮液的加蓋容器放入沸水浴中,使懸浮液緩慢沸騰15min。待RT-S9冷卻后,將其轉(zhuǎn)移至量筒,用100mmol/L磷酸鉀緩沖液調(diào)節(jié)體積以維持所需的濃度。如果觀察到過量凝集,將其轉(zhuǎn)移至手持式均質(zhì)器,均化樣品直至溶液均勻(可選)。在用于測試之前,用100mmol/L磷酸鉀緩沖液稀釋RT-S9至所需濃度(如10mg/mL)。將酶促失活的RT-S9等分試樣(如0.5mL)轉(zhuǎn)移至1.5mL微量離心管中,并在-20℃±1℃下儲存直至使用。GB/TXXXXX—XXXX(資料性)建立初步試驗的反應(yīng)條件初步試驗的主要目標(biāo)是確定獲得一級清除動力學(xué)的反應(yīng)條件,建立取樣時間表以獲取受試物清除情況(與陰性對照有顯著性差異),同時確定在終點時受試物在體系中保留的濃度即可定量的濃度。用于初步實驗的RT-S9需已知I期和Ⅱ期酶活性結(jié)果(見附錄B)。建立具有已知準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度的適當(dāng)分析方法,用于測定試驗介質(zhì)中受試物濃度,提供受試物制備和儲存的詳細(xì)資料,應(yīng)獲得試驗介質(zhì)中受試物的LOQ。為獲得受試物清除速率以用于體外-體內(nèi)外推模型中,通常希望在測定過程中實現(xiàn)清除20%~90%的受試物為佳,為達(dá)到此目標(biāo)涉及的變量包括:蛋白濃度、起始受試物濃度和總孵育時間。除了上述條件,為實現(xiàn)精確測定底物的清除還需考慮以下因素:分析方法的靈敏度,選擇內(nèi)標(biāo)物,選擇能夠溶解受試物,引入體系和終止反應(yīng)的溶劑,采用陽性對照(參比物)和陰性對照(附錄C)。底物清除試驗包括初步試驗,通常設(shè)置蛋白濃度范圍為0.25mg/mL~2mg/mL,最常用濃度為1mg/mL。受試物的起始濃度是由獲得一級動力學(xué)的需要以及分析方法的靈敏度共同決定的,應(yīng)考慮到可能需要測定的濃度遠(yuǎn)低于起始濃度值的情況(如在隨后的時間點)。分析方法的靈敏度應(yīng)能準(zhǔn)確測定所有時間點的受試物濃度或受試物初始濃度的10%。理論表明,一級動力學(xué)可能隨著起始濃度降低至米氏常數(shù)(michaels–menten,KM)以下而增加(KM是指當(dāng)反應(yīng)速率達(dá)到1/2Vmax的底物濃度,Vmax指體系中底物達(dá)到最大飽和濃度時的反應(yīng)速率)。實際上,由于受試物分析方法的局限性,不可能總能達(dá)到這些濃度,實踐表明起始濃度低至微摩爾/納摩爾范圍(如≤1.0μmol/L)時通常產(chǎn)生令人滿意的結(jié)果,因此選擇最低合理的受試物濃度進(jìn)行清除實驗即可。為了選擇合適的起始受試物濃度,可對三種濃度進(jìn)行評價:a)1.0μmol/L或基于已有信息的其他濃度(如有);b)假設(shè)實現(xiàn)50%受試物清除,可被定量的最低濃度??墒褂脹Q策樹對受試物的起始濃度作最終選擇。GB/TGB/TXXXXX—XXXX圖D.1選擇清除試驗起始受物濃度初步試驗一般在有限的時間點(如6min、30min和60min)進(jìn)行。在正式試驗中,通常首選獲得最快速清除速率的受試物起始濃度,若幾個測試受試物濃度產(chǎn)生相似的清除率,較高的濃度是首選,因為降低了對分析方法檢出限的要求。根據(jù)需要,取樣時間方案可能<10min,最長可達(dá)2h,對于生物轉(zhuǎn)化較慢的受試物,最長可達(dá)4h,通常包含6個或更多的取樣時間點。不能期望獲得的一級清除速率常數(shù)與蛋白濃度或測試受試物濃度成正比。不建議將蛋白濃度提高至2mg/mL以上,以免酶飽和。如果受試物的起始濃度使負(fù)責(zé)清除的酶活性達(dá)到飽和,可預(yù)期偏離一級動力學(xué)。對于呈現(xiàn)經(jīng)典米氏動力學(xué)的反應(yīng)路徑,這種飽和將導(dǎo)致零級清除,零級動力學(xué)的出現(xiàn)表明需降低受試物起始濃度。此外,對數(shù)轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)可能產(chǎn)生一個雙指數(shù)動力學(xué)模式,包含著一個“快”的初始階段和緊隨的一個“慢”的結(jié)束階段,該模式由產(chǎn)物抑制引起,其中包括產(chǎn)物形成后的酶活性、輔因子的限制,酶飽和等,嘗試降低受試物起始濃度和蛋白濃度以解決該問題。GB/TXXXXX—XXXX(資料性)試驗方法的建立E.1單瓶法推薦使用單瓶法測定容易分析的受試物(如無揮發(fā)性、不粘附在容器壁上、在孵育體系中能迅速分布)。它通常產(chǎn)生最少的變量結(jié)果,執(zhí)行最簡單。包含1mL懸浮液體系的單瓶中進(jìn)行孵育試驗,根據(jù)規(guī)定的時間點從單瓶中取樣品(如100μL)至裝有終止溶液的微量離心管中。至少需6個時間點確定CLINVITRO,INT,因此,試驗設(shè)置需包括≥6個時間點(如2min、10min、20min、30min、60min、90min、120min)。圖E.1單瓶法的運(yùn)行GB/TXXXXX—XXXXE.2多瓶法該方法設(shè)計為獨(dú)立小瓶中孵育,宜用于揮發(fā)性或疏水性強(qiáng)的受試物。可使用密閉GC瓶測定揮發(fā)性受試物,如添加200μLRT-S9孵育混合物至GC瓶,預(yù)孵育后蓋上帶隔墊的蓋子,使用注射器分別加入受試物和終止溶液,或添加受試物后直接蓋緊小瓶,待反應(yīng)后添加終止溶液前打開小瓶。赫施曼瓶(Hirschmannglass)可用于測定疏水性強(qiáng)的受試物。每個獨(dú)立小瓶至少包含2次獨(dú)立運(yùn)行用于測定CLINVITRO,INT,每個獨(dú)立運(yùn)行在不同天或者當(dāng)天運(yùn)行,為每次運(yùn)行提供如下內(nèi)容:a)每次獨(dú)立運(yùn)行時新鮮配制的受試物試驗溶液;b)采用獨(dú)立解凍的RT-S9,每次運(yùn)行時,根據(jù)預(yù)先確定的瓶數(shù)準(zhǔn)備活化的RT

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論