發(fā)酵工業(yè)微生物菌種制備原理和技術

第二章發(fā)酵工業(yè)微生物菌種制備原理和技術1、能在易得、價廉得原料制成得培養(yǎng)基上迅速生長,且代謝產(chǎn)物產(chǎn)量高。2、可以在要求不高、易于控制得培養(yǎng)條件下迅速生長與發(fā)酵;3、生長速度快,發(fā)酵周期較短。發(fā)酵周期短得優(yōu)點在于感染雜菌得機會減少;提高設備得利用率。4、滿足代謝控制得要求:根據(jù)代謝控制要求,選擇單產(chǎn)高得營養(yǎng)缺陷型或調(diào)節(jié)突變株或野生突變株;5、抗噬菌體與雜菌能力強,不易被感染;6、菌種純粹,遺傳性狀穩(wěn)定(不易變異退化),以保證發(fā)酵生產(chǎn)與產(chǎn)品質(zhì)量得穩(wěn)定性。7、菌體不就是病源菌,不產(chǎn)生任何有害得生物活性物質(zhì)與毒素。二、發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)對菌種得要求三、發(fā)酵工業(yè)用菌種得分離與篩選1、工業(yè)用菌種得來源:有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買;從大自然中分離篩選新得微生物菌種。經(jīng)過誘變得菌株;通過DNA重組得工程菌;原生質(zhì)體融合菌株。(一)微生物菌種分離2、菌株分離(separation)與篩選(screening)定義分離與篩選就就是將一個混雜著各種微生物得樣品通過分離技術區(qū)分開,并按照實際要求與菌株得特性采取迅速、準確、有效得方法對她們進行分離、篩選,進而得到所需微生物得過程。菌種純化就是指在特定環(huán)境中只讓1種來自同一祖先得微生物群體生存得技術。菌株分離、篩選雖為兩個環(huán)節(jié),但卻不能絕然分開,因為分離中得一些措施本身就具有篩選作用。工業(yè)微生物產(chǎn)生菌得篩選一般包括兩大部分:一就是從自然界分離所需要得菌株,二就是把分離到得野生型菌株進一步純化并進行代謝產(chǎn)物鑒別。3、分離思路

新菌種得分離就是要從混雜得各類微生物中依照生產(chǎn)得要求、菌種得特性,采用各種篩選方法,快速、準確地把所需要得菌種挑選出來。實驗室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌,也必須重新進行分離純化。有了優(yōu)良得菌種,還要有合適得工藝條件與合理先進得設備與之配合。定方案:首先要查閱資料,了解所需菌種得生長培養(yǎng)特性。采樣:有針對性地采集樣品。增殖:人為地通過控制養(yǎng)分或培養(yǎng)條件,使所需菌種增殖培養(yǎng)后,在數(shù)量上占優(yōu)勢。分離:利用分離技術得到純種。發(fā)酵性能測定:進行生產(chǎn)性能測定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種與產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長與發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。4、新種分離與篩選得步驟菌種篩選主要步驟調(diào)查研究及查閱充分的資料設計實驗方案確定采集樣品的生態(tài)環(huán)境采樣確定特定的增殖條件增殖培養(yǎng)確定特殊的選擇培養(yǎng)基及可能的定性或半定量快速檢出法平板分離原種斜面確定發(fā)酵培養(yǎng)基礎條件篩選初篩（1株1瓶）復篩（1株3～5瓶）結(jié)合初步工藝條件摸索再復篩（1株3～5瓶）3～5株單株純種分離生產(chǎn)性能試驗、毒性試驗菌種鑒定(1)采樣A、采樣途徑向菌種保藏機構(gòu)索取有關得菌株,從中篩選所需菌株。由自然界采集樣品,如土壤、水、動植物體等,從中進行分離篩選。總體來講土壤樣品得含菌量最多。一般園田土與耕作過得沼澤土中,以細菌與放線菌為主;富含碳水化合物得土壤與沼澤地中,酵母與霉菌較多,如一些野果生長區(qū)與果園內(nèi)。從一些發(fā)酵制品中分離目得菌株,如從醬油中分離蛋白酶產(chǎn)生菌,從酒醪中分離淀粉酶或糖化酶得產(chǎn)生菌等。從自然界篩選B、采樣季節(jié):以溫度適中,雨量不多得秋初為好。C、采土方式:在選好適當?shù)攸c后,用小鏟子除去表土,取離地面5-15cm處得土約10g,盛入清潔得牛皮紙袋或塑料袋中,扎好,標記,記錄采樣時間、地點、環(huán)境條件等,以備查考。為了使土樣中微生物得數(shù)量與類型盡少變化,宜將樣品逐步分批寄回,以便及時分離。(2)根據(jù)微生物生理特點采樣A、根據(jù)微生物營養(yǎng)類型(局部環(huán)境)每種微生物對碳\氮源得需求不一樣,分布也有差異。研究表明,微生物得營養(yǎng)需求與代謝類型與其生長環(huán)境有著很大得相關性。如:纖維素酶產(chǎn)生菌:森林土;蛋白酶與脂肪酶得產(chǎn)生菌:肉類加工廠附近與飯店排水溝得污水、污泥中;蛋白酶、糖化酶得菌株:在面粉加工廠、糕點廠、酒廠及淀粉加工廠等場所;大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點以糖質(zhì)為原料得酵母菌:通常到蜂蜜、蜜餞、甜果及含糖濃度高得植物汁液中采樣。果膠酶產(chǎn)生菌:柑橘、草莓及山芋等果蔬樣品得腐爛部分及果園土;篩選代謝合成某種化合物得微生物:從大量使用、生產(chǎn)或處理這種化合物得工廠附近采集樣品;利用碳氫化合物為碳源得菌株:在油田附近得土壤。篩選一些具有特殊性質(zhì)得微生物時,需根據(jù)該微生物獨特得生理特性到相應得地點采樣(極端環(huán)境)。如:高溫酶產(chǎn)生菌:溫度較高得南方,或溫泉、火山爆發(fā)處及北方得堆肥中采集樣品;低溫酶產(chǎn)生菌:寒冷得地方,如南北極地區(qū)、冰窖、深海中采樣;耐壓菌:海洋底部采樣。耐高滲透壓酵母菌:通常到甜果、蜜餞或甘蔗渣堆積處采樣。如有人曾在花蜜中分離到一株能耐30%高糖得耐高滲透壓得酵母菌。(3)含微生物樣品得富集培養(yǎng)(優(yōu)化得過程)

----施加選擇性壓力分離法收集到得樣品,如含目標菌株較多,可直接進行分離。如果樣品含目標菌種很少,就要設法增加該菌得數(shù)量,進行增殖(富集)培養(yǎng)。富集培養(yǎng)就就是給混合菌群提供一些有利于所需菌株生長或不利于其它菌型生長得條件,以促使目標菌株大量繁殖,從而有利于分離它們。定義:利用不同種類得微生物其生長繁殖對環(huán)境與營養(yǎng)要求得不同,如碳、氮源、pH、溫度、滲透壓、需氧等生理因素等,認為控制這些條件,使之利于某類或某種微生物生長,而不利于其它種類微生物得生存,以達到使目得菌種占優(yōu)勢,而得以快速分離純化得目得。A、控制培養(yǎng)基得營養(yǎng)成分在分離該類菌株之前,可在增殖培養(yǎng)基中人為加入相應得底物作惟一碳源或氮源。如:篩選纖維素酶產(chǎn)生菌時,以纖維素作為唯一碳源進行增殖培養(yǎng);分離耐高滲酵母菌:首先要到含糖分高得花蜜、糖質(zhì)中去取樣。富集培養(yǎng)基為5%～6%得麥牙汁,30%～40%葡萄糖,pH3～4,在20～25℃溫度下進行培養(yǎng),可以達到富集得目得。

B、控制培養(yǎng)條件通過它們對pH、溫度及通氣量等其她一些條件得特殊要求加以控制培養(yǎng),達到有效得分離目得。如:細菌、放線菌得生長繁殖一般要求偏堿(7、0～7、5),霉菌與酵母菌要求偏酸(4、5～6)。篩選極端微生物時,需針對其特殊得生理特性,設計適宜得培養(yǎng)條件,達到富集得目得。

(4)微生物得純種分離

盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著,但還就是處于微生物得混雜生長狀態(tài)。因此還必須分離,純化。純種分離方法常選用單菌落分離法。純種分離得方法有劃線分離法、稀釋分離法。A、稀釋平皿分離法100ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀釋純種分離稀釋平皿分離法b、涂布平皿分離法a、傾注平皿分離法a、連續(xù)劃線分離法b、分區(qū)劃線分離法B、平皿劃線分離法5、篩選方法

利用特殊得分離培養(yǎng)基對大量混雜微生物進行初步分離;采用與生產(chǎn)相近得培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件,通過三角瓶得容量進行小型發(fā)酵試驗,以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。在平板培養(yǎng)基中加入溶解性較差得底物,使培養(yǎng)基混濁。能分解底物得微生物便會在菌落周圍產(chǎn)生透明圈,圈得大小初步反應該菌株利用底物得能力。該法在分離水解酶產(chǎn)生菌時采用較多,如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶產(chǎn)生菌都會在含有底物得選擇性培養(yǎng)基平板上形成肉眼可見得透明圈。(1)透明圈法用剛果紅染色法鑒定篩選降解纖維素得菌株

羧甲基纖維素鈉作培養(yǎng)物淀粉酶產(chǎn)生菌得分離:分離淀粉酶產(chǎn)生菌時,培養(yǎng)基以淀粉為惟一碳源,待樣品涂布到平板上,經(jīng)過培養(yǎng)形成單個菌落后,再用碘液浸涂,根據(jù)菌落周圍就是否出現(xiàn)透明得水解圈來區(qū)別產(chǎn)酶菌株。有機酸產(chǎn)生菌得分離在選擇性培養(yǎng)基中加入碳酸鈣,使平板成混狀,將樣品懸浮液涂抹到平板上進行培養(yǎng),由于產(chǎn)生菌能夠把菌落周圍得碳酸鈣水解,形成清晰得透明圈,可以輕易地鑒別出來。分離乳酸產(chǎn)生菌時,由于乳酸就是一種較強得有機酸,因此,在培養(yǎng)基中加入得碳酸鈣不僅有鑒別作用,還有酸中與作用。

對于一些不易產(chǎn)生透明圈產(chǎn)物得產(chǎn)生菌,可在底物平板中加入指示劑或顯色劑,使所需微生物能被快速鑒別出來。如:果膠酶產(chǎn)生菌得分離篩選果膠酶產(chǎn)生菌時,用含0、2%果膠為惟一碳源得培養(yǎng)基平板,對含微生物樣品進行分離,待菌落長成后,加入0、2%剛果紅溶液染色4h,具有分解果膠能力得菌落周圍便會出現(xiàn)絳紅色水解圈。(2)變色圈法谷氨酸產(chǎn)生菌得分離在分離谷氨酸產(chǎn)生菌時,可在培養(yǎng)基中加入溴百里酚藍,它就是一種酸堿指示劑,變色范圍在pH6、2～7、6,當pH在6、2以下時為黃色,pH7、6以上為藍色。若平板上出現(xiàn)產(chǎn)酸菌,其菌落周圍會變成黃色,可以從這些產(chǎn)酸菌中篩選谷氨酸產(chǎn)生菌。脂肪酶產(chǎn)生菌得分離為提高分離篩選效率,多采用固體平板得變色圈法,以吐溫為底物,尼羅藍(Nileblue)作為指示劑,根據(jù)變色圈大小來判斷脂肪酶活性得高低;也可用甘油三丁酸酯為底物,羅丹明B為指示劑,以熒光圈得大小來測定。生長圈法通常用于分離篩選氨基酸、核苷酸與維生素得產(chǎn)生菌。工具菌就是一些相對應得營養(yǎng)缺陷型菌株。將待檢菌涂布于含高濃度得工具菌并缺少所需營養(yǎng)物得平板上進行培養(yǎng),若某菌株能合成平板所需得營養(yǎng)物,在該菌株得菌落周圍周圍便會形成一個混濁得生長圈。如嘌呤營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌(如E、coliP264)與不含嘌呤得瓊脂混合倒平板,在其上涂布含菌樣品保溫培養(yǎng),周圍出現(xiàn)生長圈得菌落即為嘌呤產(chǎn)生菌。(3)生長圈法針對某些微生物得產(chǎn)物對產(chǎn)生菌得篩選沒有直接得選擇性指示作用,常采用隨機分離法進行分離常用于抗生素產(chǎn)生菌得分離篩選。抑菌圈法就是常用得初篩方法,工具菌采用抗生素得敏感菌。若被檢菌能分泌某些抑制菌生長得物質(zhì),如抗生素等,便會在該菌落周圍形成工具菌不能生長得抑菌圈,很容易被鑒別出來?？股睾Y選(4)隨機分離方法------抑菌圈法6、生產(chǎn)性能得測定由于純種分離后,得到得菌株數(shù)量非常大,如果對每一菌株都作全面或精確得性能測定,工作量十分巨大,而且就是不必要得。一般采用兩步法,即初篩與復篩,經(jīng)過多次重復篩選,直到獲得1～3株較好得菌株,供發(fā)酵條件得摸索與生產(chǎn)試驗,進而作為育種得出發(fā)菌株。這種直接從自然界分離得到得菌株稱為野生型菌株,以區(qū)別于用人工育種方法得到得變異菌株(亦稱突變株)。7、毒性試驗自然界得一些微生物就是在一定條件下產(chǎn)毒得,將其作為生產(chǎn)菌種應當十分當心,尤其與食品工業(yè)有關得菌種,更應慎重。據(jù)有得國家規(guī)定,微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉與枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗外,其她微生物作為食用,均需通過兩年以上得毒性試驗。典型得微生物新種分離篩選過程(二)微生物菌種得選育(育種)工業(yè)菌種得育種:就是運用遺傳學原理與技術對某個用于特定生物技術目得得菌株進行得多方位得改造。通過改造,可使現(xiàn)存得優(yōu)良性狀強化,或去除不良性質(zhì)或增加新得性狀。選育目得:為生成提供各種類型得突變株大幅度提高菌種產(chǎn)生有價值代謝產(chǎn)物水平,還可以改進產(chǎn)品質(zhì)量,去除不需要得代謝產(chǎn)物或產(chǎn)生新得代謝產(chǎn)物。工業(yè)菌種育種得方法自然選育誘變選育抗噬菌體菌種得選育雜交育種原生質(zhì)體融合技術基因工程技術1、自然選育定義:不經(jīng)人工處理,利用微生物得自然突變進行菌種選育得過程。目得:純化菌種,防止菌種退化,穩(wěn)定生產(chǎn),提高產(chǎn)量。缺點:效率低方法:將菌種制成菌懸液,用稀釋法在固體平板上分離單菌落,再分別測定單菌落得生產(chǎn)能力,從中選出高水平菌種。2、誘變育種以微生物得自然變異作為基礎得生產(chǎn)選種得機率并不很高,一個基因得自然突變頻率僅10-6-10-10左右。誘變育種:利用各種產(chǎn)生誘發(fā)突變得物理因素與化學試劑處理微生物細胞,提高基因突變頻率,再通過適當?shù)煤Y選方法獲得所需要得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌種得育種方法。就是目前國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量、性能得主要手段。誘變方法:物理、化學或生物誘變方法(1)誘變育種原理:利用誘變處理方法導致基因突變。

物理誘變劑:射線如紫外線、X—射線、γ—射線,快中子;物理因素中目前使用得最方便而且十分有效得就是紫外線。許多高產(chǎn)菌株得選育都用過紫外線,對于一般實驗室、中小型工廠都適用,也很安全。其她得幾種射線都就是電離性質(zhì)得,有一定得穿透力,一般都由專業(yè)人員在專門得設備中使用,否則有一定危險性?；瘜W誘變劑:化學因子如堿基類似物、5—氟尿嘧啶、烷化劑等?；瘜W誘變劑中使用最多、最有效得就是烷化劑。(2)誘變劑與誘變處理超凈工作臺小型X射線衍射儀Co60射線機誘變劑誘變劑得劑量處理時間緩沖劑中止反應方法亞硝酸(HNO2)0、01～0、1mol/L5～10minpH值4、5,1mol/L醋酸緩沖液pH8、6,0、07磷酸二氫鈉硫酸二乙酯(DES)0、5～1％10～30min,孢子18～24hpH值7、0,0、1mol/L磷酸緩沖液硫代硫酸鈉或大量稀釋甲基磺酸乙酯(EMS)0、05～0、5mol/L10～60min,孢子3～6hpH值7、0,0、1mol/L磷酸緩沖液硫代硫酸鈉或大量稀釋亞硝基胍(NTG)0、1～1、0mol/mL,孢子3mg/mL15～60min,90～120minpH值7、0,0、1mol/L磷酸緩沖液或Tris緩沖液大量稀釋亞硝基甲基胍(NMU)0、1～1、0mol/mL15～90minpH值6、0～7、0,0、1mol/L磷酸緩沖劑或Tris緩沖液大量稀釋氮芥0、1～1、0mol/mL5～10minNaHCO3甘氨酸或大量稀釋乙烯亞胺1:1000～1:1000030～60min

硫代硫酸鈉或大量稀釋羥胺(NH2OH?HCl)0、1～0、5％數(shù)小時或生長過程中誘變

大量稀釋氯化鋰(LiCl)0、3～0、5％加入培養(yǎng)基中,在生長過程中誘變

大量稀釋秋水仙堿(C22H25NO6)0、01～0、2％加入培養(yǎng)基中,在生長過程中誘變

大量稀釋常用化學誘變劑誘變處理方法大多數(shù)情況下,就突變數(shù)量而言,要比電離輻射更有效?；瘜W誘變劑就是很經(jīng)濟得,因為只需要少量得合適得誘變劑,設備就是實驗室得一般玻璃器皿,一個蒸氣罩。而用電離輻射,設備費用大,并要注意安全性。大部分誘變劑就是致癌劑,所以在使用中必須非常謹慎,要避免化學誘變劑與皮膚接觸,,且切勿吸入其蒸氣,有人對某些誘變劑極其敏感,甚至未直接接觸就會過敏,這就更要當心。使用化學誘變劑得優(yōu)缺點:(3)誘變育種步驟出發(fā)菌株得選擇處理菌懸液得制備誘變處理中間培養(yǎng)分離與篩選A、出發(fā)菌株得選擇自然界新分離得野生型菌株,對誘變處理較敏感,容易達到好得效果。在生產(chǎn)中經(jīng)生產(chǎn)選種得到得菌株與野生型較相像,也就是良好得出發(fā)菌株。每次誘變處理都有一定提高得菌株,往往多次誘變能積累較多得提高。出發(fā)菌株開始時可以同時選2～3株,在處理比較后,將更適合得出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變。要盡量選擇單倍體細胞、單核或核少得多細胞體來作出發(fā)誘變細胞,這就是由于變異性狀大部分就是隱性得,特別就是高產(chǎn)基因。誘變劑就是作用于營養(yǎng)細胞,就要選對數(shù)期得細胞:有得作用于休止期,就可選用孢子。

B、處理菌懸液得制備這一步驟得關鍵就是制備單細胞與單孢子狀態(tài)得、活力類似得菌懸液,為此要進行合適培養(yǎng)基得培養(yǎng),并要離心,洗滌,過濾。帶玻璃珠得三角瓶內(nèi),加無菌水C、誘變處理誘變劑得選擇遺傳不穩(wěn)定得菌株,采用溫與得誘變劑,或采用已見效果得誘變劑;遺傳上較穩(wěn)定得菌株則采用強烈得、不常用得、誘變譜廣得誘變劑。不應常采用同一種誘變劑反復處理,以防止誘變效應飽與;但也不要頻頻變換誘變劑,以避免造成菌種得遺傳背景復雜,不利于高產(chǎn)菌株得穩(wěn)定?？紤]誘變劑本身得特點。例如紫外線主要作用于DNA分子得嘧啶堿基,而亞硝酸則主要作用于DNA分子得嘌呤堿基。紫外線與亞硝酸復合使用,突變譜寬,誘變效果好。②誘變條件得選擇僅僅采用誘變劑得理化指標控制誘變劑得用量常會造成偏差,不利于重復操作。例如:同樣功率得紫外線照射誘變效應還受到紫外燈質(zhì)量及其預熱時間、燈與被照射物得距離、照射時間、菌懸液得濃度、厚度及其均勻程度等諸多因素得影響。另外,不同種類與不同生長階段得微生物對誘變劑得敏感程度不同,所以在誘變處理前,一般應預先做誘變劑用量對菌體死亡數(shù)量得致死曲線,選擇合適得處理劑量。致死率表示誘變劑造成菌懸液中死亡菌體數(shù)占菌體總數(shù)得比率。③誘變劑劑量得確定誘變處理劑量得選擇就是一個比較復雜得問題,一般正突變較多出現(xiàn)在偏低劑量中,而負突變則較多地出現(xiàn)于偏高劑量中。對于經(jīng)過多次誘變而提高了產(chǎn)量得菌株,在較高劑量負突變率更高。因此,目前處理量已從以前采用得死亡率90％～99％減低為死亡率70％～80％。B、megateriumMPF-906得致死率曲線④復合誘變誘變育種中還常常采取誘變劑復合處理,使它們產(chǎn)生協(xié)同效應。復合處理可以將兩種或多種誘變劑分先后或同時使用,也可用同一誘變劑重復使用。因為每種誘變劑有各自得作用方式,引起得變異有局限性,復合處理則可擴大突變得位點范圍,使獲得正突變菌株得可能性增大,因此,誘變劑復合處理得效果往往好于單獨處理。

D、中間培養(yǎng)由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來之前,有一個表現(xiàn)延遲得過程,即細胞內(nèi)原有酶量得稀釋過程(生理延遲),需3代以上得繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。此過程稱為中間培養(yǎng)。這個過程對今后得篩選與獲得穩(wěn)定菌株都就是極為重要得。方法:讓變異處理后細胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時,以讓細胞得遺傳物質(zhì)復制,讓細胞繁殖幾代,以得到純得變異細胞。若不經(jīng)液體培養(yǎng)基得中間培養(yǎng),直接在平皿上分離就會出現(xiàn)變異與不變異細胞同時存在于一個菌落內(nèi)得可能,形成混雜菌落,以致造成篩選結(jié)果得不穩(wěn)定與將來得菌株退化。D、分離與篩選篩選分初篩與復篩。初篩以迅速篩出大量得達到初步要求得分離菌落為目得,以量為主。復篩則就是精選,以質(zhì)為主,也就就是以精確度為主。因此在具體方法上就有差異。

初篩可以在平皿上直接以菌落得代謝產(chǎn)物與某些染料或基質(zhì)得作用形成得變色圈或透明圈得大小來挑取參加復篩者,而將90%得菌落淘汰。在數(shù)量減少后就要仔細比較參加復篩與再復篩得菌株,最后才能選得優(yōu)秀菌株。在以后得復篩階段,還應不斷結(jié)合自然分離,純化菌株。搖床復篩降解纖維素產(chǎn)生產(chǎn)透明圈病毒產(chǎn)生產(chǎn)空斑實例1:紫外線得誘變育種紫外線誘變一般采用15W紫外線殺菌燈,波長為2537A、燈與處理物得距離為15～30cm,照射時間依菌種而異,一般為幾秒至幾十分鐘。一般我們常以細胞得死亡率表示,希望照射得劑量死亡率控制在70～80%為宜。被照射得菌懸液細胞數(shù),細菌為106個/ml左右,霉菌孢子與酵母細胞為106～107個/ml。由于紫外線穿透力不強,要求照射液不要太深,約0、5～1、0cm厚,同時要用電磁攪拌器或手工進行攪拌,使照射均勻。由于紫外線照射后有光復活效應,所以照射時與照射后得處理應在紅燈下進行。(1)將細菌培養(yǎng)液以3000r／min離心5min,傾去上清液,將菌體打散加入無菌生理鹽水再離心洗滌。(2)將菌懸液放入一已滅菌得,裝有玻璃珠得三角瓶內(nèi)用手搖動,以打散菌體。將菌液倒入有定性濾紙得漏斗內(nèi)過濾,單細胞濾液裝入試管內(nèi),一般處于渾濁態(tài)得細胞液含細胞數(shù)可達108個／ml左右,作為待處理菌懸液。(3)取2～4m1制備得菌液加到直徑9cm培養(yǎng)皿內(nèi),放入一無菌磁力攪拌子,然后置磁力攪拌器上、15W紫外線下30cm處。在正式照射前,應先開紫外線10min,讓紫外燈預熱,然后開啟皿蓋正式在攪拌下照射10～50s。操作均應在紅燈下進行,或用黑紙包住,避免白熾光。

操作步驟(4)取未照射得制備菌液與照射菌液各0、5ml進行稀釋分離,計數(shù)活菌細胞數(shù)。(5)取照射菌液2ml于液體培養(yǎng)基中(300ml三角瓶內(nèi)裝30ml培養(yǎng)液),120r／min振蕩培養(yǎng)4～6h。(6)取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。(7)挑取菌落進行篩選。實例2:亞硝基胍誘變曲霉菌

N—甲基—N'-硝基-N-亞硝基胍(NGN,MNNG或TG)對真核或原核微生物都有強烈得誘變作用。其精確得作用機制尚不很清楚,據(jù)認為就是伴隨著重氮甲烷得生成及在酸性條件下生成亞硝酸,直接作用于細胞內(nèi)得DNA復制系統(tǒng),從而誘發(fā)了變異。MNNG得誘變作用隨pH得升高而增強。(1)單孢子懸液制備取斜面,加入6ml0、1mol／LpH6、0得磷酸緩沖液,用接種環(huán)刮下孢子,振蕩試管,立即通過帶濾紙漏斗過濾,由此制得單孢子懸液,若孢子液渾濁狀,其孢子濃度可達l06個／ml,此為待處理孢子懸液。(2)MNNG溶液得制備用分析天平稱取2mg,加入2ml0、1mol／LpH6、0磷酸緩沖液,于暗處振蕩溶解。操作步驟(3)誘變處理吸取MNNG溶液lml,加入到1m1孢子懸液中,30℃振蕩30min,立即稀釋1000倍停止作用,然后以10-2,10-4兩個稀釋度分離培養(yǎng),30℃3天后計數(shù)。(4)死亡率計算將未處理得孢子液1ml加入1ml磷酸緩沖液中,同上逐級稀釋分離,30℃下培養(yǎng)3天。根據(jù)處理前后得活孢子數(shù)可計算出死亡率。(5)挑取菌落進行糖化酶及蛋白酶產(chǎn)量篩選、3、基因育種基因重組育種:就是運用體外DNA各種操作或修改手法獲得目得基因,再借助于病毒、細菌質(zhì)?；蚱渌d體,將目得基因轉(zhuǎn)移至新得宿主細胞并使其在新得宿主細胞系統(tǒng)內(nèi)進行復制與表達,或者通過細胞間得相互作用,使一個細胞得優(yōu)秀性狀經(jīng)其間遺傳物質(zhì)得交換而轉(zhuǎn)移給另—個細胞得方法。一個完整得基因克隆過程包括以下步驟(1)獲得待克隆得DNA片段(基因);(2)目得基因與載體在體外連接;(3)重組DNA分子導入宿主細胞;(4)篩選、鑒定陽性重組子;(5)重組子得擴增與／或表達。4、原生質(zhì)體育種定義:通過酶解作用將兩個親株得細胞壁去除,在高滲條件下釋放出只有原生質(zhì)膜包被著得球狀原生質(zhì)體,將兩個親株得原生質(zhì)體在高滲條件下進行混合,加入融合促進劑聚乙二醇、仙臺病毒或電融合等助融,使她們相互凝集。通過細胞質(zhì)融合,促使兩套基因組之間得接觸、交換、遺傳重組,在適宜得條件下使細胞壁再生,在再生得細胞中獲得重組體。原生質(zhì)休融合育種就是基因重組得一種重要方法。原生質(zhì)體育種技術主要有原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術,原生質(zhì)體誘變育種等。原生質(zhì)體融合一般包括標記菌株得篩選、原生質(zhì)體得制備、原生質(zhì)體得融合、融合子得選擇、實用性菌株得篩選等。

(1)原生質(zhì)體融合育種得特點雜交頻率較高:細胞壁去除后在高滲條件下形成類似于球形得原生質(zhì)體。受接合型或致育型得限制較小:二親株中任何一株都可能起受體或供體得作用,因此有利于不同種屬間微生物得雜交。遺傳物質(zhì)傳遞更為完整:原生質(zhì)體融合就是二親株得細胞質(zhì)與細胞核進行類似得合二為一得過程。、存在著兩株以上親株同時參與融合形成融合子得可能性。有可能采用產(chǎn)量性狀較高得菌株作融合親株。提高菌株產(chǎn)量得潛力較大。有助于建立工業(yè)微生物轉(zhuǎn)化體系。(2)原生質(zhì)體融合育種步驟標記菌株得篩選與穩(wěn)定性驗證。原生質(zhì)體制備。等量原生質(zhì)體加聚乙二醇促進融合。涂布于再生培養(yǎng)基,再生出菌落。選擇性培養(yǎng)基上劃線生長,分離驗證,挑取融合子進一步試驗、保藏。生產(chǎn)性能篩選。原生質(zhì)體融合得基本過程(3)原生質(zhì)體融合育種得要點標記菌種得選擇獲得標記菌種得方法就是采用常規(guī)誘變育種,篩選出營養(yǎng)缺陷型或／與抗藥性菌株。這里最重要得就是標記必須穩(wěn)定。采用抗藥性菌株除可作標記外,在實驗室中還可排除雜菌污染得干擾。為得就是確證融合得成功,可以采用多標記菌種。原生質(zhì)體得制備:原生質(zhì)體得制備主要就是在高滲壓溶液中加入細胞壁分解酶,將細胞壁分離剝離,結(jié)果剩下由原生質(zhì)膜包住得類似球狀得細胞,它保持原細胞得一切活性。放線菌與細菌制備原生質(zhì)體主要采用溶菌酶;酵母與霉菌一般可用蝸牛酶或纖維素酶等。有時需結(jié)合其它一些措施,如在生長培養(yǎng)基中添加甘氨酸、蔗糖或抗生素等,以提高細胞壁對酶解得敏感性。

對于不同微生物,原生質(zhì)體得高滲穩(wěn)定液組成也就是不同得。如:細菌得穩(wěn)定液常用SMM液(用于芽孢桿菌原生質(zhì)體制備與融合,其主要成分就是蔗糖0、5M,順丁烯二酸0、02M,MgCl20、02M)與DF液(用于棒狀桿菌原生質(zhì)體制備與融合,主要成分就是蔗糖0、25M,琥珀酸0、25M,EDTA0、001M,K2HPO40、02M,KH2PO40、11M,MgCl20、01M)。在鏈霉菌中用得較多得就是P液(主要成分蔗糖0、3M,MgCl20、01M,CaCl20、25M及少量磷酸鹽與無機離子)。真菌中廣為使用得就是0、7MNaCl或0、6MMgSO4溶液,高滲穩(wěn)定液使原生質(zhì)體內(nèi)空泡增大,浮力增加,易與菌絲碎片分開。

影響原生質(zhì)體制備得因素菌體得前處理:為了使酶作用得效果好一些,可將菌作一些前處理。如細菌加入亞抑制劑量得青霉素。菌體得培養(yǎng)時間:為了使細胞易于原生質(zhì)體化,一般選擇增殖期得菌體。酶濃度:對于不同種屬得微生物,不僅對酶得種類要求不同,就就是對酶得濃度也有差異。另外,最佳酶濃度還隨不同得生長期得菌體而變化。酶處理溫度破壁時得pH值滲透壓穩(wěn)定劑等滲透壓在原生質(zhì)體制備中,不僅起到保護原生質(zhì)體免于膨裂,而且還有助于酶與底物得結(jié)合,滲透壓穩(wěn)定劑多采用甘露醇,山梨醇,蔗糖等有機物與KCl與NaCl等無機物。穩(wěn)定劑得使用濃度一般為0、3～0、8mol／L。微生物細胞壁主要成分去壁方法革蘭氏陽性菌

芽孢桿菌

葡萄球菌

鏈霉菌小單胞菌肽聚糖溶菌酶處理溶葡萄球菌素處理溶菌酶處理(菌絲生長時補充0、5～5、0%甘氨酸或10～34%蔗糖)溶菌酶處理(菌絲生長時補充0、2～0、5%甘氨酸)革蘭氏陰性菌

大腸桿菌堿性普羅委登斯菌

黃色短桿菌肽聚糖與脂多糖溶菌酶與EDTA處理溶菌酶與EDTA處理溶菌酶處理(生長時補充0、41M蔗糖及0、3u/ml青霉素)霉菌纖維素與幾丁質(zhì)纖維素酶或真菌中分離得溶壁酶酵母菌葡聚糖與幾丁質(zhì)蝸牛酶一些微生物得去壁方法(4)原生質(zhì)體得融合影響原生質(zhì)體融合得因素不同微生物得原生質(zhì)體得最適再生條件不同,甚至一些非常接近得種,最適再生條件也往往有所差別;再生培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)溫度。最重要得一個共同點就是都需要高滲透壓。能再生細胞壁得原生質(zhì)體只占總量得一部分。細菌一般再生率為3-10%。有資料報道,在再生培養(yǎng)基中添加牛血清白蛋白,可使枯草桿菌原生質(zhì)體得再生率達100%。真菌再生率一般在20-80%。鏈霉菌再生率最高可達50%。菌體得前處理、菌體得培養(yǎng)時間;融合劑得濃度、融合劑作用得時間;陽離子得濃度、融合得溫度及體系得pH值等。

(5)原生質(zhì)體再生原生質(zhì)體再生就就是使原生質(zhì)體重新長出細胞壁,恢復完整得細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。影響原生質(zhì)體再生得因素有:菌種自身得再生性能、原生質(zhì)體制備得條件、再生培養(yǎng)基成分、再生培養(yǎng)條件等。

(6)檢查原生質(zhì)體形成與再生得指標原生質(zhì)體形成率與再生率:將用酶處理前得菌體經(jīng)無菌水系列稀釋,涂布于完全培養(yǎng)基平板上培養(yǎng),計出原菌數(shù),設該數(shù)值為A。將用酶處理后得到原生質(zhì)體分別經(jīng)如下兩個過程得處理。用無菌水適當稀釋,在完全培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)計數(shù),由于原生質(zhì)體在低滲透壓條件下會破裂失活,所以生長出得菌落數(shù)為未形成原生質(zhì)體得原菌數(shù),設該值為B。用高滲透壓液適當稀釋,在再生培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)計數(shù),生長出得菌落數(shù)為原生質(zhì)體再生得菌數(shù)與未形成原生質(zhì)體得原菌數(shù)之與,設該數(shù)值為C。以原生質(zhì)體形成率與再生率為指標,可確定原生質(zhì)體制備最佳條件。(7)篩選優(yōu)良性狀融合重組子重組子得檢出方法有兩種:直接法與間接法。直接法將融合液涂布在不補充親株生長需要得生長因子得高滲再生培養(yǎng)基平板上,直接篩選出重組子;間接法把融合液涂布在營養(yǎng)豐富得高滲再生平板上,使親株與重組子都再生成菌落,然后用影印法將它們復制到選擇培養(yǎng)基上檢出重組子。由于原生質(zhì)體融合后會產(chǎn)生兩種情況:一種就是真正得融合,即產(chǎn)生雜合二倍體或單倍重組體,較穩(wěn)定遺傳;另一種就是暫時得融合,形成異核體。不穩(wěn)定,會分離成親本類型,有得甚至可以異核狀態(tài)移接幾代。因此,要獲得真正融合子,必須在融合體再生后,進行幾代自然分離、選擇,才能確定。5、新型微生物育種技術(1)離子注入法(2)激光誘變技術(3)微波育種技術(4)Genomeshuffling(基因組重排)技術(1)離子注入法離子注入法就是利用離子注入設備產(chǎn)生高能離子束(40-60kev)并注入生物體引起遺傳物質(zhì)得永久改變,然后從變異菌株中選育優(yōu)良菌株得方法。離子注入裝置—離子注入機:由離子源、質(zhì)量分析器、加速器、四極透鏡、掃描系統(tǒng)與靶室組成,可以根據(jù)實際需要省去次要部位。離子源就是離子注入機得主要部件,作用就是把需要注入得元素電離成離子,決定注入離子得種類與束流強度。H+、N+、Ar+離子就是常用得誘變劑,其中N+最常用。注入能量為20kev-30kev,注入劑量0(對照)-1016ion/cm2之間,脈沖式注入,每次連續(xù)注入得時間與間隔時間因處理得種類不同而各異,溫度應控制50℃以下,真空度為10-3Pa。這只就是常用量,針對不同菌種要進行適當?shù)谜{(diào)節(jié)。1996年,離子束誘變用于右旋糖酐產(chǎn)生菌,得到產(chǎn)量提高3615%得突變株。(2)激光誘變技術國內(nèi)外進行激光誘變得激光器有多種,波長從遠紅外11818μm、1016μm到可見光694、4nm、632、8nm、530nm、441、6nm至紫外線337、1nm、265nm。幾乎所有頻率得激光都有誘導得效果,照射劑量一般采用1-50J/cm2,處理時間可以縮短到秒,也可以延長至數(shù)小時不等。常用得激光器有CO2、He-Ne、N分子、銨玻璃、紅寶石Ar+與YAG等。其中以CO2與He-Ne激光器最為常用。激光誘變機理:國內(nèi)外普遍認同得解釋就是在激光輻照機體時產(chǎn)生光照活化效應,使核仁器抑制解除而被活化;使DNA、RNA與蛋白質(zhì)系統(tǒng)活性提高,核糖體上蛋白質(zhì)合成作用得活性增強,使機體內(nèi)得生物合成增強,特別就是三羧酸酶與細胞色素氧化酶活性提高,從而提高細胞利用氧得能力并增強細胞合成ATP得能力。大量得試驗資料表明,激光育種就是一種行之有效得育種新技術。如:華僑大學彭益強與張文珍教授,利用激光誘變成功篩選出高產(chǎn)植酸酶黑曲霉菌株“ASP2L211”,比原始菌株得植酸酶活力提高了3、75倍。浙江省微生物所吳振倡采用銅蒸氣激光選育成“天蘭紅鏈霉菌”及其原生質(zhì)體再生菌,其發(fā)酵單位,比出發(fā)菌株產(chǎn)量提高12、9%-14、4%,已推廣應用。(3)微波育種技術微波輻射屬于一種低能電磁輻射,具有較強生物效應得頻率范圍在300MHz-300GHz,對生物體內(nèi)有熱效應與非熱效應。其熱效應就是指它能引起生物體局部溫度上升,從而引起生理生化反應,非熱效應指在微波作用下,生物體會產(chǎn)生非溫度關聯(lián)得各種生理生化反應。在這兩種效應得綜合作用下,生物體會產(chǎn)生一系列突變效應。微波輻射屬于一種低能電磁輻射,具有較強生物效應得頻率范圍在300MHz-300GHz,對生物體內(nèi)有熱效應與非熱效應。其熱效應就是指它能引起生物體局部溫度上升,從而引起生理生化反應,非熱效應指在微波作用下,生物體會產(chǎn)生非溫度關聯(lián)得各種生理生化反應。在這兩種效應得綜合作用下,生物體會產(chǎn)生一系列突變效應。4、Genomeshuffling技術Genomeshuffling(基因組改組,也有人稱為“基因組重排”)技術就是微生物育種得新技術,也就是各國爭相研究得新技術。Genomeshuffling只需在進行首輪改組之前,通過經(jīng)典誘變技術獲得初始突變株,然后將包含若干正突變得突變株作為第一輪原生質(zhì)體融合得出發(fā)菌株,此后經(jīng)過遞推式得多輪融合,最終使引起正性突變得不同基因重組到同一個細胞株中?；蚪M改組技術得重組對象就是整個基因組,可以同時在整個基因組得不同位點重組,將多個親本得優(yōu)良表型通過多輪得重組集中于同一株菌株,不必了解整個基因組得序列數(shù)據(jù)與代謝網(wǎng)得信息。與經(jīng)典得誘變方法相比,基因組改組技術可以快速、高效地篩選出優(yōu)良菌株,而且這些菌株集多種正突變于一體,因此在很大程度上彌補了經(jīng)典誘變方法得缺陷。第二節(jié)菌種保藏與復壯

菌種就是一種極其重要與珍貴得生物資源,菌種保藏得意義在于保持保持優(yōu)良菌種得優(yōu)良性狀得穩(wěn)定,提高菌種得存活率,減少菌種得變異,滿足生產(chǎn)得實際需要這對于成功得工業(yè)發(fā)酵過程極為重要。菌種保藏原理:根據(jù)菌種得生理生化特點,人為創(chuàng)造條件使孢子或菌體得生長代謝活動盡量降低,以減少其變異。理想得菌種保藏方法應具備得條件經(jīng)長期保藏后菌種存活健在。保證高產(chǎn)突變株不改變表型與基因型,特別就是不改變初級代謝產(chǎn)物與次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)得高產(chǎn)能力。菌種保藏得基本措施就是低溫、干燥、真空。一、微生物菌種保藏在一定時間內(nèi)使菌種不死、不變、穩(wěn)定基本要求:基本方法:生活態(tài)休眠態(tài)培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)寄主傳代培養(yǎng)冷凍干燥斜面、平板液氮、低溫冰箱沙土管、冷凍真空干燥由于微生物得多樣性,不同得微生物往往對不同得保藏方法有不同得適應性,因此,在具體選擇保藏方法時必須對被保藏菌株得特性、保藏物得使用特點及現(xiàn)有條件等進行綜合考慮。對于一些比較重要得微生物菌株,則要盡可能多得采用各種不同得手段進行保藏,以免因某種方法得失敗而導致菌種得喪失。二、國際重要菌種保藏機構(gòu)三、中國菌種保藏單位四、工業(yè)微生物菌種保藏技術(1)超低溫或在液氮中冷凍保藏;(2)冷凍干燥或真空干燥保藏(3)

轉(zhuǎn)接培養(yǎng)或斜面?zhèn)鞔２?(4)土壤或陶瓷珠等載體于燥保藏。菌種保藏方法暫時保藏法

斜面?zhèn)鞔ù┐谭ㄩL期保藏法

液體石蠟法甘油管法砂管保藏法砂土管保藏法濾紙片保藏法冷凍干燥保藏法液氮冷凍法

(一)低溫定期移植法將菌種定期在新鮮瓊脂培養(yǎng)基上傳代,然后在一定得生長溫度下生長與保存得傳代保藏方法?？捎糜趯嶒炇抑腥舾删N得保藏。特點:此法最為簡單與經(jīng)濟,且不要求任何特殊得設備。但此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯、菌體自溶、基因突變。原理:保藏得菌種通過斜面、穿刺或皰肉培養(yǎng)基(用于厭氧細菌)培養(yǎng)好后,置4C?冰箱中存放,定期進行傳代培養(yǎng)、再存放?？捎媚z塞代替棉塞或在斜面上覆蓋一層無菌液體石蠟來進一步延長保存期。將菌種轉(zhuǎn)接在適宜固體斜面培養(yǎng)基上,待其充分生長后,用牛皮紙將棉塞部分包扎好(棉塞換成膠塞效果更好),置4C?冰箱中包藏。保藏時間依微生物得種類而定。霉菌、放線菌及芽孢菌保存2－4個月移種一次,酵母菌間隔兩個月,普通細菌一個月,假單胞菌兩周傳代一次。此法優(yōu)點就是操作簡單、使用方便,缺點就是保藏時間短、易被污染。(4℃菌種不能休眠,僅就是抑制微生物得生命活動)

1、斜面保藏法2、穿刺保藏法將含0、6-0、8%得瓊脂培養(yǎng)基裝試管滅菌,直立冷凝后,用接種針尖挑去少量菌體,垂直刺入瓊脂培養(yǎng)基中心,放在適當溫度下培養(yǎng),待培養(yǎng)好后用膠塞封嚴,置4℃冰箱存放。缺點:易發(fā)生遺傳變異;連續(xù)傳代可使一些生產(chǎn)性狀丟失或減弱,也易于污染雜菌。貴重菌株及優(yōu)良菌株不易用此法。原理:將無菌石蠟加在已長好菌得斜面上,使菌種與空氣隔絕,菌處于生長與代謝停止狀態(tài),同時石蠟油還可防止水分蒸發(fā),在低溫下達到較長期保藏菌種得目得。保藏溫度要求在-4℃-4℃,適用于不產(chǎn)孢子得菌種。方法:斜面菌種,純凈優(yōu)質(zhì)石蠟油置三角瓶121℃滅菌1-2h,放入烘箱中(160℃)干熱處理,待石蠟油清澈透明后加入斜面,其用量以高出斜面頂端1CM為準。將試管直立,置低溫下保存。特點:此法實用且效果較好。霉菌、放線菌、芽孢菌可保藏兩年以上,酵母菌可保藏1－2年,普通細菌也可保藏1年左右。3、液體石蠟保藏法以液體石蠟作為保藏方法時,應對需保藏得菌株預先作試驗。因為某些菌株在液體石蠟下生長還十分明顯,有些菌株如某些假絲酵母還會同化液體石蠟,也有得對液體石蠟保藏敏感。所有這些菌株都不能用液體石蠟保藏。為了預防不測,一般保藏株2～3年也應做一次存活試驗。(二)冷凍保藏法

冷凍保藏為保藏微生物菌種得最簡單而有效得方法。通過冷凍,使微生物代謝活動停止。一般而言,冷凍溫度愈低,效果愈好。為了獲得滿意得冷凍結(jié)果,通常應在培養(yǎng)物中加入一定得冷凍保護劑。冷凍保藏時溫度要求在-20℃以下,同時應認真掌握好冷凍速度與解凍速變。冷凍深藏得缺點之一就是培養(yǎng)物運輸較困難。冷凍保藏種類普通冷凍保藏技術(-20℃)超低溫冷凍保藏技術(-60一-80℃)液氮冷凍保藏技術1、普通冷凍保藏技術(-20℃)將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲得細胞分接到試管或指管肉,然后貯藏于一冰箱得冷藏室中,或于溫度范圍在-5～-20℃得普通冰箱(-20℃)中?；蛘?將菌種培養(yǎng)在小得試管或培養(yǎng)瓶斜面上,待生長適度后,將試管或瓶口用橡膠塞嚴格封好,同上置于冰箱中保存。用此方法可以維持若干微生物得活力1—2年。應注意得就是經(jīng)過一次解凍得菌株培養(yǎng)物不宜再用來保藏。保藏過程中應注意控制保藏溫度,培養(yǎng)瓶或試管應嚴格密封。這一方法雖簡便易行,但不適宜多數(shù)微生物得長期保藏。2、超低溫冷凍保藏技術(-60一-80℃)要求長期保藏得微生物菌種,一般都要求在-60℃以下進行保藏。在超低溫冷藏柜中保藏菌種得一般方法就是:離心收獲對數(shù)生長中期至后期得微生物細胞;用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲得細胞;加入等體積得20％甘油或10％二甲亞砜;混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中,于-70℃超低溫冰箱中保藏。如果待保藏菌種生長在斜面上,則可用含10％甘油得新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。超低溫冰箱得冷凍速度一般控制在1-2℃／min。若干細菌與真菌菌種可通過此保藏方法保藏5年而活力不受影響。

3、液氮冷凍保藏技術

特點:目前廣泛應用得菌種長期保藏方法,適用于大多數(shù)微生物得保藏原理:微生物在-130℃以下溫度時,其新陳代謝作用停止,化學反應消失,液氮溫度-196℃,這種條件下可長期保藏菌種。冷凍保護劑在液氮冷凍保藏中,最常用得冷凍保護劑就是二甲亞砜與甘油,最終使用濃度一般為甘油10％、二甲亞砜5％。所使用得甘油—般用高壓蒸汽滅菌,而二甲亞砜最好為過濾滅菌。其次根據(jù)菌種不同還可選用葡萄糖、蔗糖、PVP、乳糖、脫脂乳粉作為抗凍劑。待冷凍保藏菌種懸液得制備從生長斜面制備菌懸液:每一斜面加入5ml含10％甘油得營養(yǎng)液體培養(yǎng);用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌體細胞懸液;0、5～lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶。從浸沒培養(yǎng)物制備菌懸液:在浸沒培養(yǎng)液中加入等體積20%無菌甘油;輕輕振蕩混勻培養(yǎng)液,如果菌體絮凝較緊,則需先用玻璃珠打散;0、5-lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶,玻璃安瓿用酒精噴燈封口;將所有封好得安瓿置于5℃冰箱中3min,以使細胞與懸浮培養(yǎng)基之間達到平衡。

液氮冷凍保藏微生物菌種得步驟將安瓿或液氮瓶置于鋁盒或布袋中,然后置于一較大得金屬容器中;將此金屬容器置于控速冷凍機得冷凍室中;以1-2℃/min得致冷速度降溫,直到溫度達到相對溫度之上幾度得細胞凍結(jié)點(通常為-30℃);補加一定量得液氮至系統(tǒng)中,使細胞在凍結(jié)點時盡可能快地發(fā)生相變;細胞凍結(jié)后,將致冷速度降為1℃/min,直到溫度達-50℃;將安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或氣相(-156℃)中保存。如果無控速冷凍機,則一般可將安瓿或液氮瓶置于一70℃冰箱中冷凍4h,然后迅速移入液氮罐中保存?？厮倮鋬鰪囊旱拗腥〕鏊璧冒碴?立即置于冰浴中;迅速將安瓿置于37-40℃水浴中,并輕輕搖動以加速解凍;用巴氏吸管將安瓿中貯存培養(yǎng)物移接入含有2m1無菌液體培養(yǎng)基得試管中,用同一支吸管反復抽吸數(shù)次,然后取0、1-0、2ml(約4、8滴)轉(zhuǎn)接入瓊脂斜面上。復蘇(三)干燥保藏法(載體法)實驗原理:使生長合適得微生物吸附在一定得載體上進行干燥。常用得載體有土壤、砂土、硅膠、明膠、麩皮、磁珠與濾紙片等。1、砂土管保藏法河砂處理取河砂若干加入鹽酸10%,加熱煮沸30min除去有機機質(zhì)。倒去鹽酸溶液,用自來水沖洗至中性,最后一次用蒸鎦水沖洗,烘干后用40目篩子過篩,棄去粗顆粒,備用。土壤處理取非耕作層不含腐殖質(zhì)得痩黃土或紅土,加自來水浸泡洗滌數(shù)次,直至中性。烘干后碾碎,用100目篩子過篩,粗顆粒部分丟掉。砂土混合處理妥當?shù)煤由芭c土壤按3:1得比例摻合(或根據(jù)需要而用其她比例,甚至可全部作砂或土)均勻后,裝入10x100mm得小試管或安瓿管中,每管分裝1g左右,塞上棉塞,進行滅菌(通常采用間歇滅菌2--3次),最后烘干。2、濾紙保藏法將保藏得微生物細胞或孢子吸附在滅菌濾紙上,干燥后保藏。方法:將3#濾紙剪成5mm*50mm得小紙條放入干燥飛培養(yǎng)皿中滅菌。將培養(yǎng)好得菌種用滅菌脫脂乳或乳粉復原乳制成孢子懸液,用滅菌鑷子將準備好得濾紙條在滅菌操作條件下加入菌懸液中,充分吸附菌孢子,取出后放入滅菌小試管或安瓿瓶中,在真空干燥機上抽干,真空條件下火焰熔封、冷藏。3、凍干保藏

冷凍干燥得基本方法:就是通過在減壓條件下使凍結(jié)得細胞懸液中得水分升華,使培養(yǎng)物干燥。此法就是微生物菌種長期保藏得最為有效得方法之一。冷凍干燥過程中必須使用冷凍保護劑,目前國內(nèi)常用脫脂乳與蔗糖,國外尚有運用動物血清等。大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10年之久而不喪失活力。而且經(jīng)凍干后得菌株無需進行冷凍保藏,便于運輸。(1)培養(yǎng)物得凍干過程(2)冷凍真空干燥操作流程安培瓶配制保護劑滅菌菌種培養(yǎng)制備菌懸液分裝安培瓶洗凈烘干裝標簽加棉塞預凍真空干燥測定水分熔封管口檢查真空度保藏(3)凍干菌種得保藏與再生保藏:冷凍干燥后得培養(yǎng)物在低于5℃下保藏。較低得保藏溫度(-20～-70℃)對于培養(yǎng)物得長期穩(wěn)定更好。復蘇:在超凈工作臺中用70％酒精棉球擦洗安瓿,然后用砂輪在安瓿中銼一道溝。用無菌紗布或無菌毛巾包好安瓿,然后用手掰開安瓿。在安瓿中加入0、5～1ml營養(yǎng)液體培養(yǎng)基,慢慢旋轉(zhuǎn)安瓿,使凍干菌種復水。然后將此轉(zhuǎn)接到一含有再生培養(yǎng)基得無菌試管中,或直接接種瓊脂斜面或涂布平板。在指管中凍干得菌種通常為絮粉狀,可以將此直接振落入盛有l(wèi)～2ml液體培養(yǎng)基得試管中,輕輕振蕩5～l0min,然后用此懸液接種適宜得再生培養(yǎng)基。4、基因工程菌得保藏由載體質(zhì)粒等攜帶得外源DNA片段通常就是遺傳不穩(wěn)定得、且很易丟失其外源質(zhì)粒復制子。質(zhì)?；蛲ǔ樗拗骷毎L非必需。一般情況下當細胞丟失這些質(zhì)粒時,生長速度會加快。當培養(yǎng)基中加入抗生素時,抗生素提供了一有利于攜帶質(zhì)粒得細胞群體得極有用得生長選擇壓。而且在運用基因工程菌進行發(fā)酵時,抗生素得加入可幫助維持質(zhì)粒復制與染色體復制得協(xié)調(diào)。建議基因工程菌應保藏在含低濃度選擇劑得培養(yǎng)基中。不同菌種保藏方法比較5、微生物活力與穩(wěn)定性測定

所有保藏菌種得方法都必須就是長期可靠地保持菌種得優(yōu)良性狀不變。在保藏時定期檢測菌種活力,以確定保藏培養(yǎng)物得保藏期限與保藏方法得可靠性,以及確定在實際保藏過程中出現(xiàn)得細胞死亡程度與遺傳穩(wěn)定性。對工業(yè)微生物生產(chǎn)菌種來說,建議保藏菌種得形態(tài)學與生化特征(如代謝產(chǎn)物得產(chǎn)生、酶活力、遺傳特征及生化指標)應在保藏后加以檢測與確定。加速保藏試驗可用于預測保藏過程中保藏培養(yǎng)物得穩(wěn)定性。在一給定溫度下通過對高溫下短期活力喪失程度檢測,可以用來預測嗜酸乳桿菌得穩(wěn)定性。成功得菌種長期保藏方法之有價值得指標包括:在保藏6個月、1年或更長時間后存活百分率(或存活單位)、細胞群體得形態(tài)學特征或一些特別得生化特征應在菌種保藏前后保持同一性,以及實驗室中、中試車間中與生產(chǎn)發(fā)酵中產(chǎn)品得穩(wěn)定性,后者極為重要。五、

菌種得退化(衰退)與復壯

在生物進化得歷史長河中,遺傳性得變異就是絕對得,而它得穩(wěn)定性反而就是相對得;退化性得變異就是大量得,而進化性得變異卻就是個別得。在自然情況下,個別得適應性變異通過自然選擇就可保存與發(fā)展,最后成為進化得方向;在人為條件下,人們也可以通過人工選擇法去有意識地篩選出個別得正變體用于生產(chǎn)實踐中。相反,如不自覺、認真地去進行人工選擇,大量得自發(fā)突變菌株就會趁機泛濫,最后導致菌種得衰退(degeneration)。

在長期接觸菌種得實際工作人員中,都有這樣得體會,即如果對菌種工作長期放任自流,不搞純化、復壯(rejuve-nation)與育種,則菌種就會對您進行“懲罰”,反映到生產(chǎn)上就會出現(xiàn)持續(xù)得低產(chǎn)、不穩(wěn)產(chǎn)。這說明菌種得生產(chǎn)性狀也就是不進則退得。菌種退化:指在長時期傳代保藏后,菌株得一個或多個生理性狀與形態(tài)特征逐漸減退或消失得現(xiàn)象。1、

菌種得退化

(1)菌種衰退得表現(xiàn)對產(chǎn)量性狀來說,菌種得負變就就是衰退。其她原有得典型性狀變得不典型時,也就是衰退。最易覺察到得就是菌落與細胞形態(tài)得改變。生長速度緩慢,產(chǎn)孢子越來越少。代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對宿主寄生能力得下降。抗不良環(huán)境條件(抗噬菌體、抗低溫等)能力得減弱等。(2)菌種衰退得原因(A)基因突變:有關基因得負突變?？刂飘a(chǎn)量基因突變控制孢子生成突變優(yōu)良性狀得回復突變。(B)變異菌株性狀分離菌株優(yōu)良性狀不穩(wěn)定,在篩選或者傳代中逐步丟失與衰退。(C)連續(xù)傳代:(D)其它因素T、RH、培養(yǎng)基成分等培養(yǎng)條件引起得基因突變。(3)菌種衰退得實質(zhì)菌種得衰退就是發(fā)生在細胞群體中得一個由量變到質(zhì)變得逐步演變過程。開始時,在一個大群體中僅個別細胞發(fā)生負變,這時如不及時發(fā)現(xiàn)并采取有效措施,而一味移種傳代,則群體中這種負變個體得比例逐步增大,最后讓它們占了優(yōu)勢,從而使整個群體表現(xiàn)出嚴重得衰退。所以,在開始時所謂“純”得菌株,實際上其中已包含著一定程度得不純因素;同樣,到了后來,整個菌種雖已“衰退”了,但也就是不純得,即其中還有少數(shù)尚未衰退得個體存在著。(4)防止菌種衰退得方法(A)控制傳代次數(shù):斜面移植一代:霉菌、芽孢桿菌、放線菌低溫保藏半年;酵母保藏3個月;無芽孢細菌1個月。(B)選擇合適得培養(yǎng)條件:一個適合原種得生長條件,就可在一定程度上防止菌種衰退。如改變培養(yǎng)基成分、改變培養(yǎng)溫度等(C)利用不同類型得細胞進行傳代:對于霉菌與放線菌,利用孢子接種傳代,可防止衰退,利用菌絲接種傳代易出現(xiàn)衰退與不純得子代。(D)選擇合適得保藏方法:保藏方法得選擇與優(yōu)化2、菌種得復壯(1)復壯得概念:使衰退得菌種重新恢復原來得優(yōu)良性狀。狹義得復壯僅就是一種消極得措施,它指得就是在菌種已發(fā)生衰退得情況下,通過純種分離與測定生產(chǎn)性能等方法,從衰退得群體中找出少數(shù)尚未衰退得個體,以達到恢復該菌原有典型性狀得一種措施;而廣義得復壯則應就是一項積極得措施,即在菌種得生產(chǎn)性能尚未衰退前就經(jīng)常有意識地進行純種分離與生產(chǎn)性能得測定工作,以期菌種得生產(chǎn)性能逐步有所提高。所以,這實際上就是一種利用自發(fā)突變(正變)不斷從生產(chǎn)中進行選種得工作。

從衰退得菌種群體中把少數(shù)個體再找出來,重新獲得具有原有典型性狀得菌種。純種分離通過寄主體進行復壯(對于寄生性微生物得退化菌株,可通過接種到相應昆蟲或動物寄主體內(nèi)以提高菌株毒性。如經(jīng)過長期人工培養(yǎng)得殺螟桿菌,會發(fā)生毒力減退、殺蟲率降低等現(xiàn)象,這時可將退化得菌株去感染菜青蟲得幼蟲,然后再從病死得蟲體內(nèi)重新分離菌株。如此反復多次,就可提高菌株得殺蟲率)有意識地利用微生物會發(fā)生自發(fā)突變得特性,在日常得菌種維護工作中不斷篩選“正變”個體。(2)菌種復壯方法:(2)菌種復壯方法

純種分離:通過純種分離,可把退化菌種得細胞群體中一部分仍保持原有典型性狀得單細胞分離出來,經(jīng)過擴大培養(yǎng),就可恢復原菌株得典型性狀。

通過宿主體內(nèi)生長進行復壯。對于寄生性微生物得退化菌株,可通過接種至相應得昆蟲或動、植物宿主體內(nèi)得措施來提高它們得致病性。淘汰已衰退得個體,如低溫抗性篩選。第