高效液相色譜分析法HPLC

關(guān)于高效液相色譜分析法HPLC§8.1概述Chromatography~利用當(dāng)流動相帶著混合組分在固定相間流動時，由于各組分在兩相中有不同的吸附能力、溶解度或滲透性等特性，因而當(dāng)兩相作相對運動時，組分會在兩相間進(jìn)行反復(fù)多次分配，使原來微小的分配差異變大，移動速度不同，從而使混合組分得到分離Temporalcourse淋洗液慢中等快第2頁,共78頁，星期六，2024年，5月1.發(fā)展歷史1906RussianbotanistTsweet經(jīng)典液相色譜法toseparatethevariousplantspigments1941,MartinandSyngeLiquid-liquidpartitionchromatography1952，MartinandJamesGaschromatography60年代采用高壓輸液泵的高效液相色譜法70年代采用電導(dǎo)檢測器的離子交換色譜法80年代末毛細(xì)管電泳分離法石油醚(mobilephase)CaCO3顆粒(stationaryphase)第3頁,共78頁，星期六，2024年，5月

Baseduponthephysicalstatusofthemobilephase

流動相

Gaschromatography（氣相色譜法）:Gas-solidchromatography(氣-固色譜法)~固定相為固體吸附劑

Gas-liquidchromatography(氣-液色譜法)~固定相為涂在固體擔(dān)體或毛細(xì)管內(nèi)壁上的液體

Liquidchromatography（液相色譜法）:Liquid-solidchromatography(液-固色譜法)~固定相為固體吸附劑Liquid-liquidchromatography(液-液色譜法)~固定相為涂在固體擔(dān)體上的液體Superficial-fluidchromatography(超臨界流體色譜法)Mobilephaseisasubstanceattemperatureandpressureaboveitscriticalpoint2.ClassificationofChromatographicmethods第4頁,共78頁，星期六，2024年，5月液相色譜法分類類型主要分離機(jī)理主要分析對象或應(yīng)用領(lǐng)域吸附色譜吸附能，氫鍵異構(gòu)體分離、族分離，制備分配色譜疏水分配作用各種有機(jī)化合物的分離、分析與制備凝膠色譜溶質(zhì)分子大小高分子分離，分子量及其分布的測定離子交換色譜庫侖力無機(jī)離子、有機(jī)離子分析離子排斥色譜Donnan膜平衡有機(jī)酸、氨基酸、醇、醛分析離子對色譜疏水分配作用離子性物質(zhì)分析疏水作用色譜疏水分配作用蛋白質(zhì)分離與純化手性色譜立體效應(yīng)手性異構(gòu)體分離，藥物純化親和色譜生化特異親和力蛋白、酶、抗體分離，生物和醫(yī)藥分析第5頁,共78頁，星期六，2024年，5月3.高效液相色譜法的特點特點：分離效能高、選擇性高、檢測靈敏度高、分析速度快應(yīng)用：高沸點、大分子量、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析第6頁,共78頁，星期六，2024年，5月高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法比較

高效液相色譜法比起經(jīng)典液相色譜法的最大優(yōu)點在于：高速、高效、高靈敏度、高自動化第7頁,共78頁，星期六，2024年，5月高效液相色譜法與氣相色譜法比較

分析對象GC：只限于分析氣體和沸點較低的化合物（占有機(jī)物總數(shù)的20％）HPLC：可分析高沸點、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)（占有機(jī)物總數(shù)近80％）流動相GC：流動相是惰性氣體，它對組分沒有親和力，即不產(chǎn)生相互作用力，僅起運載作用HPLC：流動相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對組分可產(chǎn)生一定親和力，并參與固定相對組分作用的劇烈競爭。因此流動相對分離起很大作用操作溫度GC：一般都在較高溫度下進(jìn)行HPLC：通常在室溫條件下工作第8頁,共78頁，星期六，2024年，5月4.高效液相色譜法的應(yīng)用適于高沸點、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)的分析在工業(yè)、科學(xué)研究，尤其是在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等方面應(yīng)用極為廣泛。如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸、烴、碳水化合物、藥品、多糖、高聚物、農(nóng)藥、抗生素、膽固醇、金屬有機(jī)物等分析右圖是各種HPLC方法的應(yīng)用范圍及對象分子量第9頁,共78頁，星期六，2024年，5月HPLC的局限性使用多種溶劑做流動相，成本高，污染大當(dāng)使用梯度洗脫時，操作比GC的程序升溫復(fù)雜缺少通用型的檢測器不能替代毛細(xì)管GC去完成柱效高達(dá)10萬塊塔板以上的復(fù)雜體系的分離（如多沸程的石油產(chǎn)品）不能替代中、低壓色譜，在200kPa~1MPa下去完成在高壓下易分解、變形的具有生物活性的生化樣品的分離第10頁,共78頁，星期六，2024年，5月§8.2

高效液相色譜儀HPLC儀器包括：高壓輸液裝置(Deliverysystem)

進(jìn)樣系統(tǒng)(Injectionsystem)

分離系統(tǒng)(Separationsystem)

檢測系統(tǒng)(Detectionsystem)(梯度淋洗、自動進(jìn)樣和數(shù)據(jù)處理裝置)第11頁,共78頁，星期六，2024年，5月液相色譜儀WatersHPLC第12頁,共78頁，星期六，2024年，5月1.流動相貯存與脫氣貯液罐一般由玻璃、不銹鋼或氟塑料制成，容量為1到2L，用來貯存足夠數(shù)量、符合要求的流動相流動相輸出端配0.45m膜過濾器，防止顆粒物進(jìn)入泵內(nèi)流動相脫氣作用：防止在洗脫過程中，當(dāng)流動相由色譜柱流入檢測器時因壓力降低而產(chǎn)生氣泡消除溶解在流動相中的氧的影響氧會造成熒光猝滅還會使樣品組分氧化或使固定相分解而導(dǎo)致柱分離性能改變第13頁,共78頁，星期六，2024年，5月脫氣方法：真空泵抽濾脫氣：單一溶劑低溶性惰性氣體導(dǎo)入替換:氦氣超聲脫氣在線真空脫氣（On-linedegasser）實現(xiàn)流動相在進(jìn)入高壓泵前的連續(xù)在線脫氣和過濾第14頁,共78頁，星期六，2024年，5月2.高壓泵和梯度洗脫裝置(1)高壓輸液泵壓力：150～350×105

Pa作用：將流動相以穩(wěn)定的流速或壓力輸送到色譜系統(tǒng)對輸液泵的基本要求能在高壓下連續(xù)工作流量準(zhǔn)確可調(diào)0.1-10mL/min輸出流量穩(wěn)定耐腐蝕（耐酸不銹鋼、PEEK聚醚醚酮）泵的死體積?。ㄐ∮?.5mL）第15頁,共78頁，星期六，2024年，5月輸液泵種類：恒壓泵：可迅速獲得高壓，適于柱的勻漿填充。但輸出流量隨色譜系統(tǒng)阻力變化而變化，現(xiàn)已較少使用恒流型：溶劑流量恒定，與柱填充情況無關(guān)機(jī)械注射式恒流泵機(jī)械往復(fù)式恒流泵：每分鐘往復(fù)25~100次，脈動小第16頁,共78頁，星期六，2024年，5月(2)梯度洗脫裝置梯度洗脫(GradientElutionorSolventProgramming):在樣品分離過程中，按一定程序連續(xù)改變流動相中的兩種或兩種以上溶劑的比例，以改變流動相的極性、離子強度和pH等，從而改變被測組分的相對保留值，提高分離效率，加快分離速度適用于組分分配比k相差很大的體系第17頁,共78頁，星期六，2024年，5月梯度洗脫類型:線性梯度：在某一段時間內(nèi)連續(xù)而均勻增加流動相強度階梯梯度：直接從某一低強度流動相改變?yōu)榱硪惠^高強度流動相根據(jù)溶液混合的方式可以將梯度洗脫分為高壓梯度（內(nèi)梯度）:利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱可獲得任意形式的梯度，易于實現(xiàn)自動化溶劑的可壓縮性和溶劑混合時熱力學(xué)體積變化可能影響流動相的組成低壓梯度（外梯度）:一臺高壓泵，通過比例調(diào)節(jié)閥，將兩種或多種不同極性的溶劑按一定比例抽入混合器中混合，然后由高壓泵輸送至色譜柱中消除由于溶劑混合引起的熱力學(xué)體積變化的影響可減小溶劑可壓縮性的影響第18頁,共78頁，星期六，2024年，5月3.進(jìn)樣裝置進(jìn)樣要求：將樣品定量的、瞬間注入到色譜柱頭填料中心，形成集中的一個點（柱塞式進(jìn)樣）進(jìn)樣裝置:1）隔膜注射進(jìn)樣：使用微量注射器進(jìn)樣裝置簡單、死體積小。但進(jìn)樣量小且重現(xiàn)性差2）高壓進(jìn)樣閥：目前最常用的為六通閥由于進(jìn)樣量可由樣品管控制，因此進(jìn)樣準(zhǔn)確，重復(fù)性好3)自動進(jìn)樣器裝入樣品出口進(jìn)樣采樣環(huán)泵入溶劑進(jìn)色譜柱第19頁,共78頁，星期六，2024年，5月4.色譜柱對色譜柱的要求：內(nèi)壁光滑的直型不銹鋼柱，柱接頭的死體積盡可能小柱長多為10~30cm，內(nèi)徑為4~5mm尺寸排阻色譜柱常大于5mm，制備色譜柱內(nèi)徑更大發(fā)展趨勢是減小填料粒度以提高柱效柱外效應(yīng)引起的峰形擴(kuò)展不可忽視渦流擴(kuò)散項He縱向擴(kuò)散項Hd固定相傳質(zhì)阻力項Hs流動相遷移傳質(zhì)阻力項Hm流動相滯流傳質(zhì)阻力項Hsm第20頁,共78頁，星期六，2024年，5月柱的填充（Packing）：干法：粒度>20μm濕法（勻漿法）：粒度<20μm平衡密度法：使溶劑密度和填充顆粒密度相近，此時顆粒沉降速度趨于0常用的勻漿試劑有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等填充方法：用流動相充滿色譜柱及其延長管中，然后將勻漿液倒入勻漿填充器，在較高壓力下迅速將其注入色譜柱內(nèi)要求填充速度快(防凝聚、沉降或結(jié)塊)、且無空氣進(jìn)入(影響填充均勻性)第21頁,共78頁，星期六，2024年，5月5.液相色譜檢測器溶質(zhì)性檢測器(SolutePropertyDetectors

)：只檢測色譜柱后流出液中組分的物理、化學(xué)性質(zhì)的變化紫外檢測器

(UVAbsorbanceDetector

)熒光檢測器

(FluorescenceDetector

)總體檢測器

(BulkPropertyDetector

)：檢測從色譜柱流出的流動相和組分總體物理性質(zhì)的變化示差折光檢測器

(DifferentialRefractometricDetector

)電導(dǎo)檢測器

(ConductivityDetector

)第22頁,共78頁，星期六，2024年，5月5.液相色譜檢測器

a.紫外檢測器

檢測原理：和UV-Vis方法一樣應(yīng)用最廣：HPLC分析中，約80%的物質(zhì)可以在254或280nm處產(chǎn)生紫外吸收采用微量吸收池，通常其光程為2-10mm,體積約為1-10

L特點：

靈敏度高線形范圍大波長可選，易于操作對流動相的流速和溫度變化不敏感可用于梯度洗脫

石英窗接色譜柱UV光電倍增管廢液第23頁,共78頁，星期六，2024年，5月光電二極管陣列檢測器紫外檢測器的重要進(jìn)展光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，可分別同時檢測特定波長(180-600nm)10ms內(nèi)完成一次檢測計算機(jī)快速處理三維立體譜圖第24頁,共78頁，星期六，2024年，5月快速掃描—光電二極管陣列（PDA）檢測所獲得的三維色譜-光譜圖波長可的松氟美松皮質(zhì)酮第25頁,共78頁，星期六，2024年，5月b.示差折光檢測器（differentialrefractiveindexdetector）原理：通過連續(xù)測定參比池和測量池中溶液的折射率之差，來測定樣品的濃度特點：通用型檢測器（除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器）對溫度敏感、不能用于梯度洗脫靈敏度低（10-7g/mL）偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種干涉式折光指數(shù)檢測器造價高用的較少第26頁,共78頁，星期六，2024年，5月偏轉(zhuǎn)式：利用兩束相同角度的光照射溶劑相和樣品+溶劑相，利用二者對光的折射率不同，其中一束（通常是通過樣品+溶劑相）光因為發(fā)生偏轉(zhuǎn)造成兩束光的強度差發(fā)生變化，將此差示信號放大并記錄，該信號代表與樣品的濃度呈正比流通池體積大（10

L）可用于各種溶劑折射率的測定反射式折光指數(shù)檢測器通過測定經(jīng)流動相折射后反射光的強度變化，來測定組分的含量流通池體積?。?

L）用于不同溶劑折射率的測定時需更換流通池1.31-1.44和1.40-1.60第27頁,共78頁，星期六，2024年，5月c.熒光檢測器（Fluorescencedetector）原理：許多有機(jī)化合物，特別是芳香族化合物、生化物質(zhì)，被一定強度和波長的紫外光照射后，發(fā)射出較激發(fā)光波長要長的熒光特點：高靈敏度、高選擇性所需樣品量很小應(yīng)用：多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等對部分不產(chǎn)生熒光的物質(zhì)，可先衍生化在測定第28頁,共78頁，星期六，2024年，5月d）電導(dǎo)檢測器原理：基于待測物在一些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生的電導(dǎo)（電阻的倒數(shù)）變化來測量電離物質(zhì)的含量電導(dǎo)檢測器的構(gòu)成：

由電導(dǎo)池、測量電導(dǎo)率所需的電子線路、變換靈敏度的裝置和數(shù)字顯示儀等幾部分組成，電導(dǎo)池是其核心。響應(yīng)受溫度影響較大，因此需要將電導(dǎo)池置于恒溫箱中不能用于梯度洗脫當(dāng)pH>7時，該檢測器不夠靈敏電導(dǎo)檢測器主要用于離子色譜的檢測溶液至檢測池電極

檢測池第29頁,共78頁，星期六，2024年，5月e)蒸發(fā)激光散射檢測器

（Evaporativelaserscatteringdetector,ELSD）原理：基于溶質(zhì)的光散射性質(zhì)屬通用型和質(zhì)量型檢測器消除了溶劑干擾和溫度變化引起的基線飄移可用于梯度洗脫適合于無紫外吸收、無電活性和不發(fā)熒光的樣品的檢測第30頁,共78頁，星期六，2024年，5月接參比電極和對電極接色譜柱Teflon塑料塊1cm工作電極(Pt,Au,碳糊)f）安培檢測器

由恒電位儀和一薄層反應(yīng)池（體積為1~5

L）組成原理：利用待測物流入反應(yīng)池時在工作電極表面發(fā)生氧化或還原反應(yīng)，兩電極間就有電流通過，此電流大小與待測物濃度成正比采用安培檢測器時，流動相必須含有電解質(zhì)，且呈化學(xué)隋性最適于與反相色譜匹配。但此檢測器只能檢測有電活性的物質(zhì)第31頁,共78頁，星期六，2024年，5月§8.3主要分離類型與原理8.3.1液-固吸附色譜liquid-solidadsorptionchromatograph8.3.2液-液分配色譜liquid-liquidpartitionchromatograph8.3.3離子交換色譜ion-exchangechromatograph8.3.4離子色譜ionchromatograph8.3.5離子對色譜ion-pairchromatograph8.3.6排阻色譜size-exclusionchromatograph8.3.7親和色譜(AC)Affinitychromatograph第32頁,共78頁，星期六，2024年，5月8.3.1

液-固吸附色譜

liquid-solidadsorption

chromatography固定相：固體吸附劑，如硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型粒度：5～10μm流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸應(yīng)用:

適用于分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性缺點：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾第33頁,共78頁，星期六，2024年，5月

應(yīng)用：環(huán)境中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量分析

固定相：薄殼型硅膠(37～50m)流動相：正己烷流速：1.5mL/min色譜柱：50cm2.5mm(內(nèi)徑)檢測器：差示折光檢測器可對水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留量進(jìn)行分析。第34頁,共78頁，星期六，2024年，5月8.3.2

液-液分配色譜

Liquid-liquidpartition

chromatography固定相與流動相均為液體（互不相溶）基本原理：根據(jù)各待測物在互不相溶的兩溶液中的溶解度不同，因而具有不同的分配系數(shù)流動相：為防止固定相的流失，流動相與固定液應(yīng)盡量不互溶，或者說二者的極性相差越大越好正相分配色譜：流動相極性小于固定相極性，極性小的先流出，適于極性組分分離）反相分配色譜：流動相極性大于固定相極性，極性大的先流出，適于非極性組分分離）固定相：機(jī)械涂漬固定相化學(xué)鍵合固定相第35頁,共78頁，星期六，2024年，5月機(jī)械涂漬固定相：將固定液通過機(jī)械混合的方法涂漬到表面多孔型(0.5-1.5%涂布量)或全多孔型載體(5-10%涂布量)上形成的液液色譜固定相全多孔型擔(dān)體:

由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體早期采用100μm的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見現(xiàn)采用10μm以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料

表面多孔型擔(dān)體（薄殼型微珠擔(dān)體）:

30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠表面積小，柱容量底不足：固定液易流失分離穩(wěn)定性及重現(xiàn)性差不適合梯度淋洗第36頁,共78頁，星期六，2024年，5月化學(xué)鍵合固定相通過化學(xué)反應(yīng)將不同的有機(jī)官能團(tuán)鍵合在載體表面Si-O-R：對熱不穩(wěn)定、遇水、乙醇等強極性會水解，使酯鏈斷裂，因此只適于以不含水或醇的流動相Si-R(或Si-N)：不水解，熱穩(wěn)定性比硅酸脂好。但所用的格氏反應(yīng)不方便。使用水溶液作流動相時，其pH應(yīng)在4-8之間Si-O-Si-R：不水解，熱穩(wěn)定性好，在pH2-8范圍內(nèi)對水穩(wěn)定Octadecylsilane(ODS):十八烷基硅烷化鍵合相第37頁,共78頁，星期六，2024年，5月化學(xué)鍵合固定相的特點：傳質(zhì)快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快壽命長，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊；耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，穩(wěn)定選擇性好，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性有利于梯度洗脫分離機(jī)理：雙重分離機(jī)制，鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定分離機(jī)理高覆蓋率：分配為主低覆蓋率：吸附為主

第38頁,共78頁，星期六，2024年，5月例：稠環(huán)芳烴的分析

稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)

固定相：十八烷基硅烷化鍵合相流動相：20%甲醇-水～100%甲醇線性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱溫：50oC柱壓：70104Pa

檢測器：紫外檢測器第39頁,共78頁，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)的分析第40頁,共78頁，星期六，2024年，5月8.3.3

離子交換色譜

ion-exchange

chromatography

固定相：陰離子交換樹脂或陽離子交換樹脂離子交換樹脂：苯乙烯和二乙烯苯交聯(lián)聚合而成固定離子基團(tuán)＋可交換離子基團(tuán)陽離子～：可交換離子基團(tuán)帶正電荷陰離子～：可交換離子基團(tuán)帶負(fù)電荷

流動相：陰離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液第41頁,共78頁，星期六，2024年，5月基本原理：基于離子交換樹脂上的可交換離子與流動相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子之間發(fā)生可逆交換，利用不同待測離子對固定相的親和能力（或離子交換能力）的差別來分離陽離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-應(yīng)用：

分離無機(jī)離子和有機(jī)酸、有機(jī)堿等可離解的物質(zhì)

生物物質(zhì)的分離（如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等）第42頁,共78頁，星期六，2024年，5月離子交換分離機(jī)理ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Ｃｌ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Ｃｌ－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＣＯ３２－ＳＯ４２－ＨＣＯ３－Ｃｌ－ＳＯ４２－Ｃｌ－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－TemporalcourseＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＨＣＯ３－ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Ｃｌ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋第43頁,共78頁，星期六，2024年，5月微孔型大孔型微孔微孔薄膜型表面多孔型離子交換層惰性核惰性核離子交換劑硅膠層涂覆1）多孔型（包括微孔型和大孔型）：聚苯乙烯+二乙烯苯交聯(lián)交換基團(tuán)多——交換容量大，穩(wěn)定。但易溶脹，傳質(zhì)慢、柱效低、分析速度慢2）表面多孔型：薄膜型=惰性核+樹脂薄層(1-2

m)

多孔型=惰性核+硅膠微球+樹脂薄層克服了多孔型離子交換樹脂的不足，但交換容量低，柱子易超負(fù)荷1.離子交換色譜固定相3）離子交換鍵合相：利用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團(tuán)鍵合到惰性載體表面載體可以是薄殼玻珠，也可以是多孔硅膠微粒。使用后者為載體，可得到性能穩(wěn)定、耐壓、高柱效的柱子第44頁,共78頁，星期六，2024年，5月2.流動相：離子交換色譜流動相為鹽類緩沖溶液(有一定pH和離子強度)，通過改變以下條件來控制分配比k，改變交換劑的選擇性，進(jìn)而影響樣品的分離。pH值：影響酸或堿的離解平衡，控制組分離子形式所占的分?jǐn)?shù)。常用的有檸檬酸鹽、磷酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽和氨水等。離子強度I：對保留值的影響比pH更大。組分保留值受流動相中鹽類總濃度控制。增加外加陰或陽離子將增加它們對—R+或—R-的競爭能力，使組分保留值減小。通過加入不同種類的鹽，可影響柱的選擇性，因為不同物質(zhì)對交換劑的親和能力不同。有機(jī)溶劑：外加有機(jī)溶劑通常減小組分的保留值。其極性越小，保留值越小。常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙醇、乙腈和二氧雜環(huán)已烷等。配離子L：當(dāng)大量L、組分X隨流動相進(jìn)入柱后，發(fā)生配位劑交換：

RM-L+X

RM-X+L該法用于分離各種氨基酸或堿類第45頁,共78頁，星期六，2024年，5月例：分離陰離子Column：IonPac

AG12A/AS12A

Eluent：2.7mMNa2CO3

0.3mMNaHCO3

Flowrate：1.2mL/minDetection：Conductivity

(ASRSRecyclemode)

0246810121416Retentiontime(min)08mSF-NO3-SO42-Cl-NO2-Br-HPO42-第46頁,共78頁，星期六，2024年，5月Column: IonPacCS12A,CG12AEluent: 20mMMethanesulfonicacidFlowrate: 1.0mL/minDetection: Conductivity

（CSRSRecyclemode)

例：分離陽離子02468101214Retentiontime(min)01234Na+NH4+K+Mg2+Ca2+μS第47頁,共78頁，星期六，2024年，5月8.3.4離子色譜Ionchromatography

1975由H.Small

等首次提出,用于測定氯離子和硫酸根分離原理：與離子交換色譜原理一樣與離子交換色譜的區(qū)別：采用特制的、具有極低交換容量的離子交換樹脂為柱填料采用抑制柱來消除淋洗液的高本底電導(dǎo)采用電導(dǎo)檢測器離子色譜具有以下優(yōu)點分析速度快

分離能力高分離混合陰離子的最有效方法耐腐蝕，儀器流路采用全塑件，玻璃柱第48頁,共78頁，星期六，2024年，5月1.離子色譜裝置類型抑制型：抑制柱型、連續(xù)抑制型分離柱中離子交換樹脂的交換容量通常在0.01～0.05毫摩爾/克干樹脂非抑制型:當(dāng)進(jìn)一步降低分離柱中樹脂的交換容量(0.007～0.07毫摩爾/克干樹脂),使用低濃度、低電離度的有機(jī)弱酸及弱酸鹽作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸鹽等。檢測器可直接與分離柱相連，不需抑制柱第49頁,共78頁，星期六，2024年，5月廢液BackGround：Na2CO3/NaHCO3

(700μS)NaF,NaCl,NaNO3Na2HPO4,Na2SO4～～RetentiontimeConductivityNaFNaClNaNO3Na2HPO4Na2SO4BackGround：Na2CO3/NaHCO3

(700μS)～～RetentiontimeConductivityHFHClHNO3H3PO4H2SO4RetentiontimeBackGround：H2CO3(15μS)Conductivity抑制器的作用:提高待測離子的電導(dǎo)率Na+,Cl-

H+,Cl-降低背景電導(dǎo)(淋洗液)Na+,HCO3-

H2CO3Na+,OH-

H2O第50頁,共78頁，星期六，2024年，5月極限摩爾電導(dǎo)值

Cation

＋－Anion

Ｈ＋Ｌｉ＋Ｎａ＋Ｋ＋ＮＨ４＋Ｍｇ２＋Ｃａ２＋３５０３９

５０７４７３５３６０ＯＨ－Ｆ－Ｃｌ－Ｂｒ－ＮＯ３－ＰＯ４３－ＳＯ４２－１９８５５７６７８７１８０８０Totalconductivity＝（）＋（）＋－（unit：μS/mequivalent）第51頁,共78頁，星期六，2024年，5月2.抑制器類型樹脂填充的抑制柱：填充了帶相反電荷離子交換樹脂交換容量高、制備容易不能連續(xù)工作，抑制柱中的樹脂需定期停機(jī)再生微膜抑制器自動再生連續(xù)抑制器

抑制柱上的交換反應(yīng)第52頁,共78頁，星期六，2024年，5月微膜抑制器結(jié)構(gòu)電極－電極＋離子交換膜離子交換膜流動相屏再生液屏再生液屏柱流出物至檢測池廢液

再生液第53頁,共78頁，星期六，2024年，5月

抑制器的工作原理(陰離子)Y+Na+X-:

樣品中的陰離子Y+:

樣品中的陽離子H2OH2OOH-Na+Y+H2ONa+Y+

X-

Na+CO32-(樣品,淋洗液)H+H++CO32-H++X-

至檢測器H2CO3H+X-H+

+O2H2OH2

+OH-H2ONa+OH-,H2H2O,O2廢液廢液電極（－）電極（＋）純水或來自檢測器的流體

H+H+H+H+陽離子交換膜陽離子交換膜第54頁,共78頁，星期六，2024年，5月

抑制器的工作原理(陽離子)H2OH2OH+

+O2H2OH2

+OH-H2O廢液/氣體廢液H2OSO42-Y+

X-H+MSA-(樣品e,淋洗液）OH-OH-MSA-SO42-X-OH-MSA-SO42-X-H+MSA-,O2H2O,H2H++OH-Y++OH-

H+

至檢測器H2OY+OH-X-:

樣品中的陰離子Y+:

樣品中的陽離子電極（＋）電極（－）陰離子交換膜陰離子交換膜純水或來自檢測器的液體

第55頁,共78頁，星期六，2024年，5月微膜抑制器的優(yōu)缺點優(yōu)點：可以連續(xù)再生交換容量高死體積小（50

L以下）缺點：基體物質(zhì)和溶劑對膜可能帶來損害工作曲線線性范圍受離子交換膜的影響第56頁,共78頁，星期六，2024年，5月新型連續(xù)自動再生柱抑制器

三根高容量、長壽命和易操作的微填充抑制柱。一根在流路工作一根用硫酸再生一根用水沖洗第57頁,共78頁，星期六，2024年，5月離子色譜的應(yīng)用

例:陰離子分析雙柱；薄殼型陰離子交換樹脂分離柱(3×250mm),流動相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1Na2CO3，流量138mL/hr七種陰離子在20分鐘內(nèi)基本上得到完全分離，各組分含量在3～50ppm第58頁,共78頁，星期六，2024年，5月第59頁,共78頁，星期六，2024年，5月第60頁,共78頁，星期六，2024年，5月8.3.5

離子對色譜ionpairchromatography

原理：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對離子或反離子）加到流動相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對化合物，使其能夠在兩相之間進(jìn)行分配陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對離子陽離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子反相離子對色譜：非極性的疏水固定相(C-18柱)，含有對離子Y+的甲醇-水或乙腈-水作為流動相，試樣離子X-進(jìn)入流動相后，生成疏水性離子對Y+

X-后,在兩相間分配主要用于分離分子量大的陰、陽離子脂肪酸、陰離子和陽離子表面化活性劑、烷基和芳香磺酸鹽等第61頁,共78頁，星期六，2024年，5月反相離子對分離機(jī)理Mobilephase

TBAOH／ACN／H2OSampleY+X-

Ｈ２Ｏ

Ｈ２Ｏ固定相

TBA+OH-

Y+X-

Y+X-

(TBA+X-)

(TBA+X-)

(TBA+X-)

(TBA+X-)

TBA+OH-

ACN

ACN

ACN

ACN

ACN

ACN

ACN

TBA+OH-

TBA+OH-

疏水相

親水相

Y+

OH-第62頁,共78頁，星期六，2024年，5月

Column: IonPacNS1、NG1Eluent: 2mMTBAOH, 24%～48%CANgradient in10minFlowrate: 1.0mL/min Detection: Conductivity(suppressortype)

（ASRSMPICMode）

Regenerator:10mNH2SO4

1.Methanesulfonicacid5.0μg/mL(ppm)

2.1-Propanesulfonicacid8.6

3.1-Butanesulfonicacid

8.7

4.1-Hexanesulfonicacid8.8

5.1-Heptanesulfonicacid8.9

6.1-Octanesulfonicacid8.9

7.1-Decanesulfonicacid9.10Retentiontime(min)12168μS0.0416234578.0反相離子對分離測定第63頁,共78頁，星期六，2024年，5月第64頁,共78頁，星期六，2024年，5月8.3.6體積排阻色譜

size-exclusionchromatography

固定相：凝膠,具有一定大小孔隙分布軟質(zhì)凝膠:葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)水為流動相。適用于常壓排阻分離半硬質(zhì)凝膠:苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機(jī)凝膠非極性有機(jī)溶劑為流動相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑硬質(zhì)凝膠:多孔硅膠、多孔玻珠等化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強度大，流動相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用原理：按分子尺寸大小分離可對相對分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離第65頁,共78頁，星期六，2024年，5月凝膠色譜柱的總體積VA為：VA＝Vg＋

Vi＋V0Vg：填料骨架的體積Vi：填料孔體積V0：填料顆粒之間的體積A:排阻極限B:滲透極限凝膠色譜法的局限性：洗脫體積總是位于V0到Vi＋V0之間，因此凝膠色譜峰容量有限不能完全分離復(fù)雜的、多組分體系不能用于分子大小相似或分子量相差10％以內(nèi)的組分的分離V0Vi第66頁,共78頁，星期六，2024年，5月凝膠色譜法在聚合物研究中的應(yīng)用色譜柱：KF-80M(I.d.2cm,L60cm)流動相：四氫呋喃1ml/min柱前壓：1.5Mpa常溫檢測器：UVD254nm第67頁,共78頁，星期六，2024年，5月8.3.7親和色譜

Affinitychromatograph原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離固定相：將具有生物活性的配位體以共價鍵結(jié)合到不溶性固體基質(zhì)上制得生物活性配位體：常用的有酶（如底物及其類似物）、輔酶（如類固醇）、抗體（植物激素）、激素（如糖和多糖）、抗生素（核苷酸）等基質(zhì)天然有機(jī)高聚物制成的凝膠，如瓊脂糖、葡聚糖等合成有機(jī)聚合物形成的凝膠，如聚丙烯酰胺及其衍生物應(yīng)用：主要用于蛋白質(zhì)和生物活性物質(zhì)的分離與制備Lockandkeystructuralcomplex“鎖匙結(jié)構(gòu)絡(luò)合物”第68頁,共78