腫瘤干細(xì)胞的分離與鑒定

【腫瘤干細(xì)胞的分離與鑒定

】專(zhuān)業(yè)010203目錄1腫瘤干細(xì)胞的特性腫瘤干細(xì)胞分離腫瘤干細(xì)胞鑒定04幾種常見(jiàn)腫瘤干細(xì)胞的分離與鑒定010203目錄2腫瘤干細(xì)胞的特性腫瘤干細(xì)胞的分離腫瘤干細(xì)胞的鑒定04幾種常見(jiàn)腫瘤干細(xì)胞的分離與鑒定01腫瘤干細(xì)胞特性3具有無(wú)限增殖和分化潛能12

345678比例小具有高端粒酶活性抗凋亡家族蛋白過(guò)表達(dá)DNA修復(fù)能力顯著增強(qiáng)長(zhǎng)時(shí)間處于G0期處于低氧環(huán)境中表達(dá)干細(xì)胞特異標(biāo)志物01腫瘤干細(xì)胞特性（1）具有無(wú)限增殖和分化潛能4腫瘤的發(fā)生是一個(gè)長(zhǎng)期的突變積累過(guò)程，在皮膚及腸黏膜上皮等腫瘤的高發(fā)部位，衰老細(xì)胞不斷地死去并脫離機(jī)體，只有干細(xì)胞是唯一可以長(zhǎng)期存在的細(xì)胞，有可能積累多次突變而生成腫瘤干細(xì)胞，進(jìn)而最終形成腫瘤[PMID:20420952]。01腫瘤干細(xì)胞特性（2）比例小5腫瘤干細(xì)胞主要通過(guò)兩種方式分裂：一種是對(duì)稱(chēng)分裂，即形成兩個(gè)相同的腫瘤干細(xì)胞或兩個(gè)相同的分化腫瘤細(xì)胞；另一種是非對(duì)稱(chēng)分裂，即腫瘤干細(xì)胞分裂后形成的兩個(gè)細(xì)胞中有一個(gè)細(xì)胞不可逆地走向分化的終端成為功能專(zhuān)一的分化腫瘤細(xì)胞，而另一個(gè)保持親代的特征，仍作為腫瘤干細(xì)胞保留下來(lái)。由于這種類(lèi)似于干細(xì)胞的分裂方式，低密度的腫瘤干細(xì)胞能在維持自身數(shù)量的同時(shí)產(chǎn)生出分化的腫瘤細(xì)胞[PMID：19194462]。01腫瘤干細(xì)胞特性（3）具有高端粒酶活性6高活性的端粒酶可抑制細(xì)胞增殖過(guò)程中端粒長(zhǎng)度的縮短，延長(zhǎng)腫瘤干細(xì)胞的增殖壽命，這為腫瘤干細(xì)胞的不斷增殖和分化提供了基礎(chǔ)條件[PMID:20420952]。01腫瘤干細(xì)胞特性（4）抗凋亡家族蛋白過(guò)表達(dá)7研究發(fā)現(xiàn)，大部分腫瘤干細(xì)胞中抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)量顯著增加，從而啟動(dòng)腫瘤干細(xì)胞內(nèi)抗凋亡程序，阻斷Bid和Bad等促凋亡蛋白引起的線(xiàn)粒體凋亡途徑，并進(jìn)一步阻斷胱天蛋白酶凋亡途徑，防止腫瘤干細(xì)胞發(fā)生凋亡[PMID:20394737]。01腫瘤干細(xì)胞特性（5）DNA修復(fù)能力顯著增強(qiáng)8研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞內(nèi)與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶和DNA連接酶等酶蛋白的合成增加、活性增強(qiáng)，增強(qiáng)了腫瘤干細(xì)胞的抗DNA損傷能力，使得腫瘤干細(xì)胞可逃避以DNA損傷為主的腫瘤治療手段[PMID:11751422]。01腫瘤干細(xì)胞特性（6）長(zhǎng)時(shí)間處于G0期9臨床上普遍使用的化療藥物主要是針對(duì)增殖旺盛的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷，處在G0期的大多數(shù)腫瘤干細(xì)胞能逃避傳統(tǒng)腫瘤治療方法的殺傷，一旦時(shí)機(jī)成熟或停止用藥，它們便成為復(fù)發(fā)的根源[PMID:23358473]。01腫瘤干細(xì)胞特性（7）處于低氧環(huán)境中10腫瘤干細(xì)胞通常位于由發(fā)育良好的三維細(xì)胞外基質(zhì)包裹的低氧環(huán)境中，這些細(xì)胞外基質(zhì)起到很好的屏障作用，盡可能避免了腫瘤干細(xì)胞接觸到抗腫瘤藥物。同時(shí)由于射線(xiàn)引起的DNA損傷需要氧氣，所以腫瘤干細(xì)胞所處的低氧環(huán)境使得放療對(duì)腫瘤干細(xì)胞的殺傷作用也非常局限舊。[PMID:15170446]01腫瘤干細(xì)胞特性（8）表達(dá)干細(xì)胞特異標(biāo)志物11這些特異性蛋白或標(biāo)志物在腫瘤干細(xì)胞的增殖、腫瘤干細(xì)胞分化成腫瘤組織周?chē)仨毜难艿冉M織、腫瘤干細(xì)胞的遷移等過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。利用這些特異性的表面標(biāo)志物達(dá)到腫瘤干細(xì)胞分離或鑒定的目的。02腫瘤干細(xì)胞分離1212345免疫磁珠分選（MACS）流式細(xì)胞分選（FACS）根據(jù)生物學(xué)特性分離旁群細(xì)胞分選法(SP)無(wú)血清培養(yǎng)基分選法(SFM)02腫瘤干細(xì)胞分離（1）免疫磁珠分選（MACS）13MACS是基于腫瘤干細(xì)胞表面特異性抗原能與連接有磁珠的特異性單克隆抗體相結(jié)合，之后在外部磁場(chǎng)的作用下，連接有單克隆抗體磁珠的腫瘤干細(xì)胞停留在磁場(chǎng)中，而無(wú)特異性表面抗原的腫瘤細(xì)胞則不能與免疫磁珠結(jié)合，因而不能在磁場(chǎng)中停留，從而得以分離出腫瘤干細(xì)胞。[PMID：30009677]。02腫瘤干細(xì)胞分離（2）流式細(xì)胞分選（FACS）14FACS是通過(guò)將待分選的腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞用同一種或多種熒光素標(biāo)記的特異性抗體標(biāo)記，根據(jù)腫瘤干細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞結(jié)合熒光素標(biāo)記抗體能力的差異，通過(guò)流式細(xì)胞儀將腫瘤干細(xì)胞分選出來(lái)的方法。[PMID：27517564]。02腫瘤干細(xì)胞分離（2）流式細(xì)胞分選（FACS）1402腫瘤干細(xì)胞分離（3）根據(jù)生物學(xué)特性分離15根據(jù)腫瘤干細(xì)胞具有的某些生物學(xué)特性將腫瘤干細(xì)胞分離篩選出的方法。如可以通過(guò)細(xì)胞核對(duì)核染料的拒染性質(zhì)、腫瘤干細(xì)胞體外培養(yǎng)所需的特殊條件等特性，分離出腫瘤干細(xì)胞[PMID:14711994]

。02腫瘤干細(xì)胞分離（4）旁群細(xì)胞分選法(SP)16腫瘤干細(xì)胞具有對(duì)核染料Hoechst33342拒染的特性。Hoechst33342是一種核酸染料，在紫外光激發(fā)下可發(fā)出藍(lán)色熒光(波長(zhǎng)450nm左右)和紅色熒光(波長(zhǎng)650nm左右)，腫瘤干細(xì)胞可將染料外排，而不發(fā)出熒光，從而可將這類(lèi)旁群細(xì)胞分離出來(lái)。[PMID:14711994]。02腫瘤干細(xì)胞分離（5）無(wú)血清培養(yǎng)基分選法(SFM)17在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，引入特定的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞添加劑，使絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞由于缺乏生長(zhǎng)所必須的血清成分而停止生長(zhǎng)，經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)后最終死亡，而腫瘤干細(xì)胞則可以在含特定生長(zhǎng)因子和添加劑的無(wú)血清培養(yǎng)基中呈球狀懸浮生長(zhǎng)，經(jīng)幾代的培養(yǎng)增殖形成富含腫瘤于細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞球在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，引入特定的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞添加劑，使絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞由于缺乏生長(zhǎng)所必須的血清成分而停止生長(zhǎng)，經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)后最終死亡，而腫瘤干細(xì)胞則可以在含特定生長(zhǎng)因子和添加劑的無(wú)血清培養(yǎng)基中呈球狀懸浮生長(zhǎng)，經(jīng)幾代的培養(yǎng)增殖形成富含腫瘤于細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞球。[PMID:14645703]

。02腫瘤干細(xì)胞分離（6）聯(lián)合多種方法分離18在目前的研究中，腫瘤干細(xì)胞的分離并不是采用單一的方法，而是選用兩種或者兩種以上的分離方法，以獲得數(shù)量更多、純度更高的腫瘤干細(xì)胞。0103目錄19腫瘤干細(xì)胞特性腫瘤干細(xì)胞的鑒定04幾種常見(jiàn)腫瘤干細(xì)胞的分離與鑒定02腫瘤干細(xì)胞的分離03腫瘤干細(xì)胞的鑒定20123利用腫瘤干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物進(jìn)行鑒定異種移植成瘤性實(shí)驗(yàn)鑒定腫瘤干細(xì)胞的其他鑒定方法03腫瘤干細(xì)胞鑒定(1)利用腫瘤干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物進(jìn)行鑒定21目前，腫瘤干細(xì)胞最為廣泛且可靠的鑒定方法就是利用腫瘤干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物。將分離出的腫瘤干細(xì)胞通過(guò)免疫組織化學(xué)法、流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)等方法測(cè)定陽(yáng)性或陰性細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)情況，進(jìn)而鑒定是否是腫瘤干細(xì)胞。下表為幾種已鑒定出的腫瘤干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物。03腫瘤干細(xì)胞鑒定(1)利用腫瘤干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物進(jìn)行鑒定22腫瘤干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物PMID急性粒細(xì)胞白血病CD34+/CD38-[PMID:7509044]乳腺癌Lineage-/CD24-(lower)/CD44+,ALDH1+[PMID:

20630801]

[PMID:12629218]胰腺癌CD133+,CD24+/CD44+/ESA+[PMID:

17283135]肺腺癌CD133+[PMID:18049477]神經(jīng)膠質(zhì)瘤CD133(AC133)+[PMID:

14522905]胃腸道癌CD133+,CD44+/EpCAM(high）[PMID:

21448722]

[PMID:

17122772

]肝癌CD90+,CD133+[PMID:

18242515]黑色素瘤ABCB5+[PMID:18202660]腎癌CD105+[PMID:

18614581

]卵巢癌CD44+/CD117+,CD133+,CD44+/MYD88+[PMID:

19158483][PMID:

18836486]子宮內(nèi)膜癌CD133+[PMID:

20089663]03腫瘤干細(xì)胞鑒定23將分離出的腫瘤于細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液后種植到異種動(dòng)物體內(nèi)，如將人的腫瘤干細(xì)胞接種于NOD/SCID小鼠體內(nèi)，觀察其能否形成腫瘤病灶，且異種動(dòng)物體內(nèi)形成的腫瘤病灶在組織學(xué)結(jié)構(gòu)上與原發(fā)腫瘤病灶類(lèi)似，則可鑒定為腫瘤干細(xì)胞。一般來(lái)說(shuō)，腫瘤干細(xì)胞形成腫瘤病灶所需的細(xì)胞密度比普通腫瘤細(xì)胞要小。(2)異種移植成瘤性實(shí)驗(yàn)鑒定03腫瘤干細(xì)胞鑒定23(2)異種移植成瘤性實(shí)驗(yàn)鑒定03腫瘤干細(xì)胞鑒定24對(duì)于腫瘤干細(xì)胞的鑒定，還可通過(guò)腫瘤干細(xì)胞具有的類(lèi)干細(xì)胞特性進(jìn)行鑒定。如根據(jù)腫瘤干細(xì)胞核對(duì)核染料拒染(如Hoechst33342染料)的性質(zhì)進(jìn)行鑒定；根據(jù)腫瘤干細(xì)胞長(zhǎng)期處于靜止?fàn)顟B(tài)的特性，應(yīng)用溴脫氧尿嘧啶核苷法進(jìn)行鑒定和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)鑒定等。(3)腫瘤干細(xì)胞的其他鑒定方法01目錄26腫瘤干細(xì)胞的特性04幾種常見(jiàn)腫瘤干細(xì)胞的分離與鑒定02腫瘤干細(xì)胞的分離03腫瘤干細(xì)胞的鑒定04幾種常見(jiàn)腫瘤干細(xì)胞的分離與鑒定12肝癌腫瘤干細(xì)胞膠質(zhì)瘤干細(xì)胞273結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞01肝癌腫瘤干細(xì)胞（LCSCs）分離2501肝癌腫瘤干細(xì)胞（LCSCs）分離2801肝癌腫瘤干細(xì)胞（LCSCs）鑒定29指標(biāo)：Oct4,Sox2,c-Myc,Klf4qRT-PCR/WB免疫熒光02膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（GSCs）分離流式細(xì)胞儀分選（方法略[PMID：29535786]）分離的原代GBM細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM和Ham’sF-12培養(yǎng)基中，并補(bǔ)充10%胎牛血清，37℃融合培養(yǎng)。融合原代GBM細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶和0.25%EDTA溶液消化后用神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基（NBM），輔以B27（1X；GiBCO），肝素（2ug/ml），bFGF（20ng/ml，Sigma、美國(guó)）和EGF（20ng/ml，Sigma，美國(guó)）置于24孔板中進(jìn)行成球培養(yǎng)。當(dāng)膠質(zhì)球直徑達(dá)到100um時(shí)，收集膠質(zhì)球并用流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光染