DNA序列測定課件

DNA序列測定第一節(jié)概述一、DNA序列測定即核酸DNA分子一級結(jié)構(gòu)的測定，是現(xiàn)代分子生物學(xué)一項重要的技術(shù)。

1963年，Sanger和Thompson等人第一次完成胰島素51個氨基酸的序列測定，這在當(dāng)時來說是一件了不起的大事。70年代后期，Sanger和MaxamGilbert等人又建立了核酸序列測定的方法，Sanger雙脫氧末端終止法和MaxamGilbert化學(xué)裂解法將核酸序列測定技術(shù)推進到“直讀”階段，使核酸序列測定變得遠(yuǎn)比蛋白質(zhì)氨基酸序列測定容易，這樣人們可以通過核酸序列和遺傳密碼推導(dǎo)出蛋白質(zhì)氨基酸的序列。二、DNA序列測定工作原理

在四種反應(yīng)體系中，寡聚核苷酸分別終止于不同位置的A、T、G或C堿基，將待測DNA片段轉(zhuǎn)變成一系列放射性核素標(biāo)記的單鏈DNA片斷，并使其一端為一固定的末端，而另一端由于長度不同，成為一系列相差1個堿基的連續(xù)末端。經(jīng)電泳分離，放射自顯影，可直接讀出DNA的序列。三、核酸序列分析的目的意義和策略（具體方法）（一）序列分析的目的，2種：1、確證性測序通過測定對突變進行定位和鑒定，應(yīng)用時測定野生型基因上同源區(qū)和突變體的相應(yīng)序列直接在一張膠片上比較二者序列差異。（已知基因序列）2、從頭序列目的是提供一段DNA準(zhǔn)確的核苷酸序列。（未知基因序列）（二）測定在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域相應(yīng)應(yīng)用，2個方面：1、對已知基因序列檢查，特別是有遺傳傾向的病例檢測相關(guān)基因有無突變，有助于闡明疾病發(fā)病機理及建立相應(yīng)診療方案。2、對已經(jīng)克隆的未知序列進行測定，從而闡明該基因的一級結(jié)構(gòu)，如人類基因組計劃中大量的工作是要闡明克隆片段的核苷酸的排列順序。（三）序列分析的策略（具體方案）測序目的不同或靶DNA片段大小有區(qū)別，則序列分析的具體方案有所不同，所以測序之前應(yīng)根據(jù)相應(yīng)情況制訂序列測定的策略，這個問題在后面將涉及到，但由于學(xué)時限制，不可能完全展開來講，請同學(xué)參看相關(guān)書籍。四、測序的常用方法DNA序列測定常用方法有如下3種：

1、末端終止法2、化學(xué)裂解法3、DNA測序自動化使用特異性引物與單鏈模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下進行延伸反應(yīng)，用ddNTP終止，用PAGE區(qū)分長度僅相差1個核苷酸的ssDNA，從而完成測序的方法。用化學(xué)試劑在A、G、C、T處特定的裂解DNA片段，產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈，經(jīng)過PAGE放射自顯影可直讀DNA順序。類似末端終止法，所不同的是用熒光染料標(biāo)記，計算機自動讀出。優(yōu)點簡便、迅速、應(yīng)用廣泛。不需酶促反應(yīng)，可以對寡核苷酸測序。1、高負(fù)荷，1塊膠可測16個樣品；2、機讀不需放射自顯影；3、安全不用同位素；4、簡單迅速8-10h。不管是上述哪一種方法，測序基本過程如下：1、制備待測DNA序列模板；2、酶促或化學(xué)反應(yīng)將其轉(zhuǎn)變“等差數(shù)列”（n=1）；3、PAGE；4、讀序。（P255,圖10-2）五、測序的基本過程六、測序技術(shù)的最近發(fā)展

1、商品化測序試劑盒解決了質(zhì)粒問題，節(jié)省了時間，但缺乏靈活性。2、自動化測序儀以酶學(xué)測序反應(yīng)或（和）放標(biāo)測序產(chǎn)物為基礎(chǔ)，微機處理。3、熱循環(huán)測序使極少數(shù)測序產(chǎn)物線性放大。4、測序商品化

60.-180.￥，搞定。七、DNA序列測定的應(yīng)用分析基因組核苷酸排列序列分析基因序列基因定點誘變的基礎(chǔ)基因工程載體構(gòu)建中DNA序列定位和排序的基礎(chǔ)確定DNA序列中蛋白質(zhì)的編碼區(qū)第二節(jié)Sanger雙脫氧末端終止法一、原理（一）DNA復(fù)制的4個基本條件1、ssDNA模板2、DDDP3、帶有3’-OH末端的單鏈寡核苷酸引物4、4種dNTP（二）鏈終止劑（chain-reminator）2，3-二脫氧核糖核酸酶當(dāng)3’-OH由于脫氧或被取代，下一個核苷酸不能通過5’磷酸形成3’，5’磷酸二酯鍵，使鏈的延伸反應(yīng)終止在這個異常的核苷酸處。如果用相同的4組引物-模板混合物，每一組加4種dNTP，其中1種用32P（或35S）標(biāo)記，加1種ddNTP，每組將產(chǎn)生一種特異性的以ddNTP為末端的不同長度的核苷酸鏈，經(jīng)PAGE分離，即可讀出被測定的全部順序（dNTP和ddNTP競爭結(jié)合底物）。（P255，圖10-2）（三）Sanger雙脫氧鏈終止法的原理

在DNA合成時，利用ddNTP與dNTP競爭摻入到新生的DNA鏈上使鏈終止的原理。即在A、C、G、T4種反應(yīng)體系中，分別加入不同的ddNTP，其他試劑相同，經(jīng)酶促合成反應(yīng)，生成具有相同的5′末端，而3′不同的DNA片段的混合物。經(jīng)電泳分離，放射自顯影，直接讀出DNA的核苷酸序列。二、試劑（一）引物

酶促測序反應(yīng)中利用一個與模板特定序列互補的合成寡核苷酸作為DNA合成的引物。在許多情況下可將靶DNA片段克隆于M13噬菌體或噬菌粒載體，以取得單鏈DNA分子作為模板。也可用Sanger法測定變性雙鏈DNA模板序列（如變性質(zhì)粒DNA）。以上兩種情況都可以采用能與位于靶DNA側(cè)翼的載體序列相退火的通用引物，不必取得與未知DNA序列互補的引物。M13噬菌體重組子的通用測序引物一般長15-29bp，與緊靠M13mp18多克隆位點區(qū)的HindIII或M13mp19多克隆位點區(qū)EcoRI位點的序列互補。這些引物同樣也可用于PUC質(zhì)粒的DNA進行“雙鏈”測序，并且已經(jīng)商品化。（二）模板純單鏈DNA和經(jīng)過熱變性或堿變性的雙鏈DNA都可以用作Sanger法測定的模板。模板的質(zhì)量和所用的DNA聚合酶的種類是至關(guān)重要的。通常采用M13噬菌體顆粒分離到的單鏈DNA模板效果最佳，用變性雙鏈DNA作模板則難獲此效果。小量制備質(zhì)粒DNA常被寡核苷酸小分子，核糖核苷酸及DNA聚合酶抑制劑所污染，前兩者可被用作隨機引物，造成假象和強終止現(xiàn)象，使測序膠含糊不清。采用小量制備質(zhì)粒DNA測定未知DNA克隆片段的序列，并不可取，如果用CsCl-溴化乙錠梯度離心結(jié)果純化質(zhì)粒DNA，測序結(jié)果會好得多，但又耗費大量的人力和物力。DNA序列測定模板制備方法因為DNA是相當(dāng)大的分子，一般由幾kb組成，最小的質(zhì)粒和病毒也在1kb以上，而測序的最好方法，一次也只能測幾百個bp（以300-500bp為好，300bp最佳），所以測序前，可以用2種限制酶消化待測DNA，使其降解成小片段，用瓊脂糖凝膠電泳分離回收?；厥掌?，如果超過700-800bp，則進行第二次限制酶消化，再次分離回收。然后分別測定每個片段的順序。由于兩種限制酶在DNA鏈上的切點位置不同，產(chǎn)生的片段之間有交錯重疊順序，據(jù)2片段的這種末端重疊現(xiàn)象，用計算機定出各片段的位置，而排出DNA的全部序列。在測序中，小片段DNA只需直接克隆到M13mp或者質(zhì)粒載體中，進行雙鏈或單鏈模板測序?，F(xiàn)在常用的M13mp載體一般是成對設(shè)計，如M13mp18與M13mp19都有相同的多克隆位點，但方向相反。同一待測的DNA片段分別克隆到這兩個載體中，用一通用引物進行測序。對于數(shù)kb大片段DNA分子，則有幾種策略，如定向克隆，內(nèi)部片段克隆，原位亞克隆，包含上述用2種限制酶消化DNA等。1、用噬菌體M13克隆待測DNA片段1）噬菌體是寄生在細(xì)菌的病毒。存在3種狀態(tài)，有尾20面體，無尾20面體和絲狀單鏈?zhǔn)删w（filamentous），M13是一類雄性特異的大腸桿菌噬菌體，含單鏈環(huán)狀的DNA。它感染細(xì)菌（宿主菌）呈溶原狀態(tài)生長，在菌體內(nèi)形成過渡階段雙鏈環(huán)狀復(fù)制型DNA（ReplicativeformDNA，RFDNA），在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以擴增至數(shù)百個拷貝。成熟的噬菌體成為單鏈（正鏈、RF則以正鏈為模板復(fù)制1條鏈，再以此鏈復(fù)制正鏈）分泌到培養(yǎng)液中。因此雙鏈DNA（RF）可以按質(zhì)粒提取方法從細(xì)菌細(xì)胞中制備，做為克隆所用的載體。從培養(yǎng)上清液提取成熟的單鏈DNA做為測序模板。在感染過程中，M13并不殺死細(xì)胞，但細(xì)胞的生長受到某種程度抑制。dsDNA復(fù)制又產(chǎn)生大量的ssDNA，它被1個外殼蛋白包裝成成熟的噬菌體，在細(xì)胞生長的過程中，子代噬菌體顆粒釋放出來，這是M13不同于其他噬菌體的特點。每ml培養(yǎng)液沉淀的噬菌體可提取5-10mgssDNA，產(chǎn)量是很高的。用作克隆載體，M13有1個得天獨厚的優(yōu)點，即可產(chǎn)生大量含有外源DNA其中1條鏈的DNA分子，后者可在下列工作中充作模板：

（1）末端終止法測序（2）制備“放標(biāo)”單鏈用于雜交DNA探針（3）利用寡核苷酸進行定點誘變。2）M13mp18和M13mp19載體（1）mp系列載體特點：①都是從同一重組M13mp1改造而來。

②在基因II-IV（500bp，570bp左右）之間有1個多克隆位點（multiplecloningsites，MCS）可供外源基因插入。③該區(qū)域（MCS）插入了1小段Ecoli.DNA，有β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的調(diào)控序列及其N端146個aa編碼信息，它與宿主菌（含LacZ）α-互補，形成有活性的β-半乳糖苷酶，使平板上底X-gal生色成藍(lán)噬菌斑，當(dāng)外源基因插入MCS，破壞了α-互補，幾乎無一例外生成無色（白）噬斑。這是一種非常有效的克隆篩選選擇性標(biāo)志。（2）M13mp18和M13mp19是一對載體，它們有相同的13個多克隆位點，但方向相反。（當(dāng)RFDNA被兩種限制酶切割后，M13mp18和M13mp19輕易不能重新環(huán)化，當(dāng)連接混合液中含外源匹配末端dsDNA片段時方閉合成環(huán)，這一片段在二者中將以互為相反的兩個方向插入。這樣M13mp18正鏈中含有外源DNA的一條鏈，而在M13mp19正鏈中含外源DNA的另一條鏈）。所以M13mp18和M13mp19作為一對載體可用同一通用引物，（從所插入DNA片段任一端開始），測定互為相反兩條鏈的DNA序列。（并可制備只與外源DNA任意1條DNA鏈互補的探針）。（分子克隆P202）。2、定向連續(xù)次級克隆待測大片段DNA片段測定數(shù)kb的DNA序列時，可以建立一系列一端刪切200-300bp的DNA片段次級克隆。對它們分別測序，就可以連續(xù)讀出該大片段DNA的全部序列。核酸酶BAL31和核酸外切酶III，均可以達(dá)到連續(xù)刪切的目的。核酸酶BAL31-是從乳白短桿菌（Brevibacteriumalbidum）細(xì)菌中分離。它能以漸進的方式將線型DNA分子的3’，5’兩端同時降解，形成小的寡核苷酸片段或單核苷酸。底物可以是帶延伸末端的，也可以是平頭末端的dsDNA，對3’，5’兩端降解有同樣性，此酶要求Ca2+作輔因子，以EDTA作螯合劑，可使該酶失活。BAL31還有較弱的單鏈特異內(nèi)切酶活性，與核酸酶S1相似，降解ssDNA或ssRNA形成5’磷酸末端的單或寡核苷酸酶片段，能從DNA片段中切除單鏈尾巴，產(chǎn)生平頭末端。核酸酶S1是從米曲霉（AspergillusOryze）中分離的。外切核酸酶III-是一種從E.coli中分離，從dsDNA的3’-OH末端降解產(chǎn)生5’單核苷酸的外切酶。（此外，外核酸酶III還有內(nèi)核酸酶，RnaseH和3’-磷酸酶的活性。（三）DNA聚合酶1、大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow大片段Klenow大片段DDDPI是由分子量109KD一條多肽鏈組成，此酶可被枯草桿菌蛋白酶分解成2個片段，1個片段分子量為76KD，有聚合酶，3’→5’外切酶活力，此片段稱為Klenow片段，另一片段34KD，有5’→外切酶活力。此酶是末端終止法最早采用的酶，用它進行測序常常產(chǎn)生較高的本底和假帶，催化鏈延伸反應(yīng)的能力也較差，通常只能讀出距引物250個核苷酸以內(nèi)的序列。此酶價格便宜，容易獲得，對于已知序列DNA次級克隆的鑒定仍有應(yīng)用價值。2、測序酶（Sequenase）測序酶是經(jīng)過改造的T7噬菌體DNA聚合酶，消除了3’→5’外切酶活性?；钚苑浅７€(wěn)定，具有很高的鏈延伸能力和極快的聚合反應(yīng)速度，是測定較長DNA序列的首選酶。該酶及名稱是HSB公司的專利。試劑盒已商品化。3、TaqDNA聚合酶Taq酶用于序列測定，除具有很好的鏈延伸性能外，還可以在高溫（70-80℃）進行反應(yīng)的優(yōu)點，因而能克服富含GC序列的模板形成自身二級結(jié)構(gòu)對測定的影響，將PCR與末端終止法測序結(jié)合進行，只需少量模板。（四）放射性同位素標(biāo)記的dNTP

傳統(tǒng)32P-dNTP，由于32P衰變過程中產(chǎn)生高能的β射線，導(dǎo)致放射自顯影圖譜條帶擴散，分辨率低，限制了識讀序列的數(shù)量。另外，由于32P對DNA樣品輻射分解作用很強，通常都在測序反應(yīng)后24小時內(nèi)上樣電泳，否則無法得到滿意的結(jié)果。α-32S-dNTP近年來得到廣泛使用，它解決了32P的兩大缺點，具有很高的分辨率，較低的本底。測序反應(yīng)產(chǎn)物-20℃保存一周并不明顯影響反應(yīng)結(jié)果。（五）用于測序的變性凝膠電泳膠長40cm，厚度均勻

4~8%丙烯酰胺

7mol/L尿素三、Sanger法測序主要反應(yīng)（一）制膠（二）模板變性（雙鏈）（三）測序反應(yīng)1、模板引物退火2、鏈延伸、鏈標(biāo)記、鏈終止反應(yīng)3、上樣電泳4、讀片（序）（分子克隆P640）（必須經(jīng)過實踐才能獲得技巧）O堿基CPOHH12345O堿基CPOHH12345OH脫氧核苷酸的連接DNA測序O堿基CPOH12345O堿基CPOHH12345H2O脫氧核苷酸的連接O堿基CPHH12345O堿基CPOHH12345OHX雙脫氧核苷酸…?四套反應(yīng)體系1--dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddATP2--dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddCTP3--dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddGTP4--dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddTTPATGCGGTACCAT5’3’測序模板5’

TA5’TACGCCA5’TACGCCATGGTACCC第一套反應(yīng)第二套反應(yīng)5’5’5’ACGTTACGCCATGGTATACGCCATGGTADNA自動測序四、大片段DNA的測序方法（一）隨機法超聲波處理：將DNA隨機斷裂成一組相互重疊的300~900bp片段，電泳回收300~600bp片斷作亞克隆

DNaseI切割：將DNA隨機切割成一組相互重疊的片段，作亞克隆限制酶消化：限制酶將DNA切割為含粘端的DNA片段，作亞克隆將上述含不同子片段的亞克隆擴增后進行測序（二）嵌套缺失法1、將待測DNA與M13mp載體相連，構(gòu)成重組體。

2、用兩種限制酶從待測DNA片段的一端與載體序列之間將DNA切斷，產(chǎn)生線性DNA，使近待測DNA片段的一端為5′突出末端，近載體一端為3′突出末端。

3、外切核酸酶Ⅲ從5′突出末端消化待測DNA，37°C時，每分鐘水解250個核苷酸

4、核酸酶SI去除殘余單鏈，自我環(huán)化，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主菌得到次級克隆。

5、將各克隆用于測序。（三）引物延伸法

是一種定向測序法，從DNA的3′依賴特定引物延伸測定一段DNA序列，再根據(jù)測得序列設(shè)計新的引物，作下一延伸反應(yīng)的引物，如此向前推進，最終測得DNA的全長序列。第三節(jié)Maxam-Gilbert化學(xué)裂解法

化學(xué)裂解（直讀，Sanger雙脫氧末端法也是直讀法）法是Maxam和Gilbert等人1977年創(chuàng)建的，用來測定DNA序列。化學(xué)法是用化學(xué)試劑在A、G、C、T處特定地裂解DNA片段，產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈（等差數(shù)列n=1），經(jīng)過PAGE和放射自顯影后，可以直接讀出DNA的順序。某些試劑能修飾或破壞DNA鏈上特定核苷酸的堿基進而使N-糖苷鍵斷裂，暴露出的糖環(huán)以β-消除反應(yīng)，在3’和5’位上斷裂磷酸二酯鍵。使戊糖脫落，用于嘌呤環(huán)的試劑是硫酸二甲酯，而聯(lián)氨可用于肼解嘧啶環(huán)。4種核苷酸的特異裂解和鑒別方法如下：一、化學(xué)裂解法測序的原理1、用放射性核素標(biāo)記待測DNA一側(cè)末端2、將標(biāo)記DNA分為G、A+G、C+T、C4個反應(yīng)體系3、用不同的化學(xué)試劑處理不同反應(yīng)體系，隨機斷裂DNA片段某種堿基中的任何一個，產(chǎn)生一組一端為放射線標(biāo)記的末端，另一端為不同大小的DNA片段的混合物4、電泳分離，放射自顯影得到互相錯落的梯形圖譜，即可讀出DNA序列表特異斷裂4種脫氧核苷酸的方法作用的堿基試劑與反應(yīng)堿基釋放DNA斷裂強G/弱A稀釋250倍硫酸二甲酯，在50mM卡可酸（PH8.0）10MMgCl2、0.1MEDTA20℃60分鐘，DNAG的N7和A的N3甲基化甲基化嘌呤不穩(wěn)定，在中型PH加熱被破壞在0.1M堿中，90℃15分鐘，戊糖脫落，DNA鏈斷裂，G斷裂比A快5倍A同上0.2NHCl、0℃、60分鐘，堿基被破壞同上，A斷裂比G快C+T15-18M聯(lián)苯胺、20℃50分鐘，嘧啶環(huán)被破壞釋放0.5M哌啶處理，斷裂DNA鍵，C與T有同樣速率C2MNaCl，聯(lián)氨處理方法同上，100分鐘，此時，T的破壞被抑制，只有C被破壞釋放同上，只在C處斷裂DNA鏈在4種反應(yīng)體系中，化學(xué)試劑特異地斷裂DNA的機制是：G反應(yīng)硫酸二甲酯（DMS）使GN7甲基化，其后斷開了C8-C9間的化學(xué)鍵，哌啶置換了被修飾鳥嘌呤與核糖的結(jié)合。G+A反應(yīng)（哌啶）甲酸使嘌呤環(huán)上氮原子質(zhì)子化，削弱了嘌呤脫氧核糖核苷酸和腺嘌呤脫氧核糖核苷酸的糖苷鍵，然后哌啶置換了嘌呤。T+C反應(yīng)肼斷開了嘧啶環(huán)，產(chǎn)生堿基片段被哌啶置換。C反應(yīng)在NaCl存在時，只有C才能與肼發(fā)生反應(yīng)，隨后，被修飾的胞嘧啶被哌啶置換。二、堿基特異性修飾及裂解反應(yīng)體系堿基修飾試劑堿基修飾反應(yīng)主鏈斷裂試劑斷裂點G硫酸二甲酯鳥嘌呤甲基化六氫吡啶GG+A甲酸脫嘌呤作用六氫吡啶G和AC+T肼嘧啶開環(huán)六氫吡啶C和TC肼（加鹽）胞嘧啶開環(huán)六氫吡啶C（一）限制酶消化待測DNA，得到長度為100-200bp的一組片段，純化回收每1個片段作為測序材料。（二）堿性磷酸酶處理消除5’磷酸。（三）多核苷酸酶催32PdNTP標(biāo)記（5’-OH）末端。（四）使標(biāo)記片段變性為單鏈。（五）分成4-5個反應(yīng)體系，按上述程序（表或4個機制）化學(xué)處理，嚴(yán)格控制反應(yīng)條件。（使得平均每1個DNA分子只有1個位置被斷裂，這種斷裂是隨機的，如G反應(yīng)，則在DNA鏈上任意位置G斷裂），DNA鏈上每50-100堿基只有1個被裂解，這樣，每個反應(yīng)中雖然都在同一核苷酸處斷裂DNA鏈，但由于堿基位置不同，產(chǎn)生1組不同長度的DNA片段。其長度可由幾個核苷酸到接近待測DNA全長。（六）電泳（七）放射自顯影（八）4個反應(yīng)管統(tǒng)一閱讀，DNA4個堿基每個位置都有一個相應(yīng)的片段，待測DNA全部核苷酸序列就可直接