微生物發(fā)酵制藥技術基礎（發(fā)酵制藥課件）

培養(yǎng)基的選擇微生物發(fā)酵制藥技術基礎培養(yǎng)基的類型和用途（一）按來源合成培養(yǎng)基:原料化學成分明確、穩(wěn)定實驗室范圍作為有關營養(yǎng)、代謝、分類鑒定、生物測定及選育菌種、遺傳分析定量研究工作天然培養(yǎng)基:采用天然原料（動植物組織或微生物的浸出液、水解液等物質）原料來源豐富(大多為農副產品)、營養(yǎng)豐富，價格低廉、適于工業(yè)化生產；組分復雜，不易重復，不加控制會影響生產穩(wěn)定性。半合成培養(yǎng)基：天然成分+純化學試劑M培養(yǎng)基(1L)：Na2HPO46g，KH2PO43g，NaCl0.5g，NH4Cl1g，MgSO4.7H2O0.5g，CaCl20.011g，葡萄糖2-10,pH7.0YPS培養(yǎng)基：酪蛋白胨10g，酵母提取物5g,NaCl10g，PH7.2培養(yǎng)大腸桿菌常用兩種培養(yǎng)基（二）按狀態(tài)1、固體培養(yǎng)基適合于菌種和孢子培養(yǎng)和保存，也廣泛應用于有子實體的真菌類。常用麩皮、大米、小米、谷殼和瓊脂等，有的還另加其他營養(yǎng)成分。（二）按狀態(tài)2、半固體培養(yǎng)基即在配好的液體培養(yǎng)基中加入少量瓊脂，一般用量為0.5-0.8%，培養(yǎng)基即呈半固體狀態(tài)。主要用于：鑒定菌種，觀察細菌運動特征及噬菌體的效價滴定等。（二）按狀態(tài)3、液體培養(yǎng)基80-90%是水，內含可溶或不溶營養(yǎng)成分，是發(fā)酵工業(yè)大規(guī)模使用的培養(yǎng)基，有利于氧和物質傳遞。供菌種繁殖孢子用。要求：能使菌體迅速生長，產生較多優(yōu)質的孢子，不易引起菌種發(fā)生變異?；九渲埔螅籂I養(yǎng)不要太豐富(特別是有機氮源)，否則不易產孢子。所用無機鹽的濃度要適量，不然也會影響孢子產量和顏色。注意培養(yǎng)基的pH和濕度。

1.孢子培養(yǎng)基（三）按用途常用的孢子培養(yǎng)基有：麩皮培養(yǎng)基、小米培養(yǎng)基、大米培養(yǎng)基、玉米碎屑培養(yǎng)基和用葡萄糠、蛋白陳、牛肉膏、食鹽等配制成的瓊脂斜面培養(yǎng)基。大米和小米常用作霉菌孢子培養(yǎng)基，因為它們含氮少，硫松、表面積大，所以是較好孢子培養(yǎng)基。2.種子培養(yǎng)基目的：擴大培養(yǎng)增加細胞數量；培養(yǎng)高活力細胞；加速細胞分裂或菌絲生長。特點必須有較完全和豐富的營養(yǎng)物質，特別需要充足的氮源和生長因子；各種營養(yǎng)物質的濃度不必太高；供孢子發(fā)芽生長用的種子培養(yǎng)基，可添加一些易被吸收利用的碳源和氮源；成分還應考慮與發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分相近。3.發(fā)酵培養(yǎng)基目的：供菌種生長、繁殖和合成產物用。除菌體生長所必需的元素和化合物外，還要有產物合成所需的特定元素、前體和促進劑等。提供合成微生物細胞和發(fā)酵產物的基本成分利于減少培養(yǎng)基原料的單耗利于提高培養(yǎng)基和產物的濃度以提高生產能力利于提高產物合成的速度，縮短發(fā)酵周期減少副產物的形成便于分離純化原料低廉，質量穩(wěn)定，取材容易原料減少對通氣攪拌的影響，提高氧利用率，降能耗利于產品分離純化，減少產生三廢物質發(fā)酵培養(yǎng)基選擇提供必要的營養(yǎng)成分配制合適的濃度主成分和其他成分的配比避免產生微生物不能利用的物質或形成沉淀注意代謝調節(jié)物的影響控制合適的pH添加有關前體物質和誘導物：一些酶的發(fā)酵生產需加入誘導物才能合成。阻遏物或抑制劑的影響金屬離子的影響：檬酸發(fā)酵中鐵、錳和鋅離子都能明顯影響產量；鈷離子對葡萄糖異構酶的發(fā)酵是必需的，發(fā)酵培養(yǎng)基設計和注意事項pH的控制方法①可以在微生物培養(yǎng)過程中加入酸或堿或流加某些營養(yǎng)物質調節(jié)培養(yǎng)基的pH,配制培養(yǎng)基時考慮所用營養(yǎng)物質的組成成分。②注意有些營養(yǎng)物質被利用后培養(yǎng)基的pH變化情況。③在培養(yǎng)基中添加具有一定緩沖能力的物質作為營養(yǎng)物。如以磷酸鹽作為磷的成分；避免使用容易產生生理酸性或堿性物質使培養(yǎng)基pH波動太大的物質。（四）根據主要成分或使用目的分基礎培養(yǎng)基：含有一般微生物生長繁殖所需的基本營養(yǎng)物質的培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)基：適合某種微生物生長而不適合其他微生物生長，從而達到從自然界分離這種微生物的目的。鑒別培養(yǎng)基：根據微生物能否利用培養(yǎng)基中某種營養(yǎng)成分，借助指示劑的顯色反應，以鑒別不同種類的微生物。如：伊紅美藍培養(yǎng)基鑒別大腸桿菌選擇培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入某種化學物質，以抑制不需要菌的生長，而促進某種需要菌的生長。培養(yǎng)基的選擇微生物發(fā)酵制藥技術基礎培養(yǎng)基的選擇方法根據微生物的特點選擇培養(yǎng)基液體和固體培養(yǎng)基的選擇根據生產實踐和科學試驗的不同要求選擇從經濟效益方面考慮選擇生產原料

用于大規(guī)模培養(yǎng)的微生物主要有細菌、酵母菌、霉菌和放線菌等四大類。它們對營養(yǎng)物質的要求不盡相同，要依據微生物的不同特性，來考慮培養(yǎng)基的組成。根據微生物的特點選擇培養(yǎng)基液體和固體培養(yǎng)基的選擇發(fā)酵工業(yè)中大多采用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)種子和進行發(fā)酵，并根據微生物對氧的需求，分別作靜止或通風培養(yǎng)。固體培養(yǎng)基則常用于微生物菌種的保藏、分離、菌落特征鑒定、活細胞數測定等方面。此外，工業(yè)上也常用一些固體原料，如小米、大米、麩皮、馬鈴薯等直接制作成斜面或茄子瓶來培養(yǎng)霉菌、放線菌。根據生產實踐和科學試驗的不同要求選擇種子培養(yǎng)基主要是供微生物菌體的生長和大量增殖。種子培養(yǎng)基要求營養(yǎng)豐富、完全，氮源、維生素的比例應較高，所用的原料也應是易于被微生物菌體吸收利用。發(fā)酵培養(yǎng)基除需要維持微生物菌體的正常生長外，主要是要求合成預定的發(fā)酵產物。所以，發(fā)酵培養(yǎng)基碳源物質的含量往往要高于種子培養(yǎng)基。從經濟效益方面考慮選擇生產原料對于生產過程來講，由于配制發(fā)酵培養(yǎng)基的原料大多是糧食、油脂、蛋白質等，且工業(yè)發(fā)酵消耗原料量大。因此，在工業(yè)發(fā)酵中選擇培養(yǎng)基原料時，除了必須考慮容易被微生物利用并滿足生產工藝的要求外，還應考慮到經濟效益，必須以價廉、來源豐富、運輸方便、就地取材以及沒有毒性等為原則選擇原料。培養(yǎng)基的選擇微生物發(fā)酵制藥技術基礎淀粉制備葡萄糖的生產技術在發(fā)酵生產之前，必須將淀粉水解為葡萄糖，才能供發(fā)酵使用。大多數微生物不能直接利用淀粉（所有的氨基酸生產菌不能直接利用）有些微生物能夠直接利用淀粉作原料，但必須在微生物產生淀粉酶后才能進行，過程緩慢，發(fā)酵周期延長。若直接利用淀粉作原料，滅菌過程的高溫會導致淀粉結塊，發(fā)酵液粘度劇增。淀粉水解制糖的意義在工業(yè)生產中，將淀粉水解為葡萄糖的過程稱淀粉的糖化，制得的溶液叫淀粉水解糖。淀粉水解糖的制備方法及原理酸解法酶解法酸酶結合法原料：薯類、玉米、小麥、大米等根據原料淀粉的性質和水解使用的催化劑的不同水解過程：總反應式：(C6H10O5)n+nH2OnC6H12O6過程：(C6H10O5)n(C6H10O5)xC12H22O11C6H12O6

淀粉糊精麥芽糖葡萄糖H+對作用點無選擇性，α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵均被切斷。（一）酸解法

定義：以酸為催化劑，在高溫高壓下使淀粉水解生成葡萄糖的方法。

淀粉

葡萄糖復合二糖5‘－羥甲基糠醛

復合低聚糖有機酸、有色物質

在淀粉的酸水解過程中，三種反應同時發(fā)生復合反應分解反應鹽酸副反應酸解法復合反應：在淀粉酸水解過程中，一部分生成的葡萄糖在酸和熱的催化作用下，能通過糖苷鍵聚合，失掉水分子，生成二糖、三糖和其它低聚糖等，這種反應稱為復合反應。生成的多數復合糖不能被微生物利用，使發(fā)酵結束時殘?zhí)歉?。酸解法分解反應：在淀粉的酸水解過程中，由于反應溫度過高和時間過長，使部分葡萄糖脫水，發(fā)生分解反應，生成5′-羥甲基糠醛。5′-羥甲基糠醛的性質不穩(wěn)定，又可進一步分解成乙酰丙酸、蟻酸等物質。這些物質有的自身相互聚合，有的與淀粉中所含的有機物質相結合，產生色素。生成的5‘－羥甲基糠醛是產生色素的根源，增加了糖化液精制脫色的困難。酸解法副反應的影響降低了葡萄糖的收率。給產物的提取和糖化液的精制帶來困難。如何控制分解反應和復合反應的發(fā)生？淀粉乳濃度酸濃度不能過高溫度酸解法酸解法工藝流程

淀粉、水、鹽酸→調漿→進料→水解→冷卻、中和（Na2CO3)

→脫色（活性碳）→過濾→糖化液酸水解1.調漿：干淀粉用水調成10-11Bx的淀粉乳，加鹽酸0.5-0.8％至pH1.5。2.糖化：水解鍋預熱，打料后直接蒸汽加熱，加壓0.25-0.4MPa，糖化10-20min。3.冷卻：至80℃下中和。4.中和：燒堿中和，至pH4.0-5.05.脫色：活性炭脫色和脫色樹脂。活性炭用量為0.6-0.8％，在70℃及酸性條件下攪拌后過濾。6.過濾除雜評價優(yōu)點：工藝簡單，水解時間短，生產效率高，設備周轉快。缺點：要求設備耐腐蝕、耐高溫和耐壓。副產物多，影響糖液純度，一般DE值只有90％左右。對淀粉原料要求嚴格，不能用粗淀粉，只能用純度較高的精制淀粉。酸解法DE值：dextroseequivalentvalue

（葡萄糖當量值）表示淀粉糖的含糖量。還原糖含量（％）DE值＝

100％干物質含量（％）DE值定義用專一性很強的淀粉酶及糖化酶將淀粉水解為葡萄糖的工藝。分兩步（1）液化：用α-淀粉酶將淀粉轉化為糊精和低聚糖（2）糖化：用糖化酶（又稱葡萄糖淀粉酶）將糊精和低聚糖轉化為葡萄糖。淀粉的液化和糖化均在酶作用下進行，又稱雙酶法。

（二）酶解法淀粉水解的過程淀粉吸水膨脹糊化（無化學反應）α-淀粉酶液化

糖化酶糖化酶

糊精

低聚糖麥芽糖

葡萄糖（由7-12個葡萄糖殘基組成）3-6個2個1

（二）酶解法1.液化淀粉在α-淀粉酶的作用下，分子內部的α-1，4糖苷鍵發(fā)生斷裂。隨著酶解進行，淀粉的相對分子質量變得越來越小，酶解液黏度不斷下降，流動性增強，最終生成了能溶于水的糊精和低聚糖，這個過程稱為液化。

（二）酶解法α-淀粉酶水解底物內部的α-1、4糖苷鍵，不能水解α-1,6糖苷鍵，但能越過

-1．6-糖苷鍵繼續(xù)水解

-1、4-糖苷鍵，而將

-1.6糖苷鍵留在在水解產物中。直鏈淀粉葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖。支鏈淀粉以上+異麥芽糖及含有

-1、6-糖苷鍵的低聚糖（二）酶解法液化條件國內目前較為普遍采用的是一次升溫液化法和連續(xù)進出料液化法一次升溫液化法過程如下：用純堿溶液將30％～35％淀粉乳（13～14°Bé）調整pH至6.2～6.4，然后加入Ca2+和α-淀粉酶，攪勻后泵入密閉的液化鍋內，加熱到88～90℃，保溫15～20min。液化完畢，用碘液檢查，合格后，即升溫至100℃，加熱使酶失活。α-淀粉酶用量為8～10U/g淀粉。反應液中Ca2+濃度為0.01mol/L。根據糖化酶對底物分子大小的要求，應以液化液與碘液反應顯棕色（要求液化產物為20～30個葡萄糖單位）為淀粉的液化終點。2.糖化由糖化酶將淀粉的液化產物糊精和低聚糖進一步水解成葡萄糖的過程，稱為糖化。（二）酶解法2.糖化糖化工藝具體如下：將30％淀粉乳的液化液泵入帶有攪拌器和保溫裝置的開口桶內，加入糖化酶，用酶量按80-100U/g淀粉來計算，然后在一定pH和溫度下進行糖化，48h后，用無水酒精檢查糖化是否完全。糖化結束，升溫至80℃，維持20min，殺滅糖化酶。糖化時的溫度和pH取決于糖化酶的性質。一般，糖化溫度為55～60℃，pH為4.4～4.6。（3）脫色與過濾通常采用粉末活性碳對糖化液進行脫色。

一般控制脫色的溫度在60～65℃。3.評價優(yōu)點：（1）副反應少，水解糖液純度高（DE值可達98%以上）。（2）反應條件溫和，不需高溫、高壓設備。（3）對原料要求粗放，可用粗原料并在較高淀粉乳濃度下水解。（4）糖液顏色淺，質量高。缺點：（1）生產周期長，一般需要48小時。（2）需要更多的設備，且操作嚴格。（二）酶解法

集酸解法和酶解法的優(yōu)點而采取的生產工藝。根據原料淀粉性質分：

酸酶法酶酸法（三）酸酶結合法先將淀粉酸水解成糊精和低聚糖，再用糖化酶將其水解為葡萄糖。適用：淀粉顆粒堅硬（如玉米、小麥）的原料，若用

-淀粉酶液化，短時間液化，反應往往不徹底。酸酶法先用-淀粉酶液化，再用酸水解。適用：顆粒大小不一（如碎米淀粉）的淀粉原料，若用酸法，則水解不均勻。酶酸法培養(yǎng)基的選擇微生物發(fā)酵制藥技術基礎培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分六大營養(yǎng)物質包括碳源、氮源、能源、無機鹽、生長因子和水。工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基除了含有這些外，有的還含有某些前體、產物促進劑和抑制劑等。1.能源功能：微生物生長、繁殖、合成、分解、運動、熱的產生等，即微生物的一切行為都需要消耗能源。一、培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分1.能源光能------光能自養(yǎng)菌的能源。如：小球藻、螺旋藻利用光能生產單細胞蛋白；嗜鹽藻利用光能生產甘油、β-胡羅卜素和單細胞蛋白等。氫、亞硝酸鹽、亞鐵鹽等還原態(tài)的無機物------化能自養(yǎng)微生物的能源。如：細菌煉銅所使用的氧化亞鐵硫桿菌，將亞鐵鹽作為能源。碳水化合物等有機物------異養(yǎng)微生物能源，同時也是碳源物質。一、培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分1.能源2.碳源用于構成微生物細胞和代謝產物中碳素的來源，并為微生物的生長繁殖和代謝活動提供能源。主要功能提供微生物生長繁殖所需的能源；提供微生物合成菌體的碳成分；提供合成目的產物的碳成分。工業(yè)生產常用的碳源：糖類、油脂、有機酸、低碳醇和碳氫化合物等。如碳源貧乏時，蛋白質水解物或氨基酸等也被作為碳源使用。工業(yè)生產所用微生物絕大多數是異養(yǎng)菌，不像自養(yǎng)菌那樣能夠利用光、還原態(tài)無機物或碳酸鹽作為能源物質，只能利用有機碳水化合物作為能源。對于異養(yǎng)微生物，碳源又兼做能源，稱為雙功能營養(yǎng)物。（1）糖類：發(fā)酵培養(yǎng)基中使用最廣泛的碳源。

純糖天然原料木糖單糖：葡萄糖、雙糖：蔗糖、麥芽糖、乳糖

多糖：淀粉、糊精及其水解液糖蜜類：甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜糖類：麥芽汁淀粉質類：山芋粉、馬鈴薯粉、玉米粉、燕麥粉、木薯粉其它：纖維素水解液、乳清、碳源物質的易利用順序：(單)葡萄糖→(雙)蔗糖、麥芽糖、乳糖→(多)糊精→淀粉速效碳源遲效碳源葡萄糖是工業(yè)發(fā)酵中最常用的單糖，它是由淀粉加工制備的，有固體粉狀和葡萄糖糖漿兩種產品形式。葡萄糖是碳源中最容易利用的單糖，所以常作為培養(yǎng)基的主要成分，并且也作為促進細胞快速生長的一種有效的糖類物質。它被廣泛用于抗生素、氨基酸、有機酸、多糖、甾體轉化等發(fā)酵產品的生產中。但葡萄糖過多會加速菌體的呼吸，在通氣不足、溶解氧不能滿足需要的情況下，其代謝中間產物如丙酮酸、乳酸、乙酸等不完全氧化而積累在菌體或培養(yǎng)基中，會導致培養(yǎng)基的pH值下降，影響某些酶的活性，從而抑制微生物的生長和產物的合成。葡萄糖還會引起葡萄糖效應，阻遏微生物利用其他的糖。由于葡萄糖等快速利用的糖對產物合成有調節(jié)作用，應控制其濃度，一般是將其和緩慢利用的多糖組成混合碳源，即有利于菌體生長又有利于產物形成。工業(yè)發(fā)酵生產中用的雙糖主要有蔗糖、乳糖和麥芽糖。蔗糖、乳糖可以使用其純制產品，也可以使用含有此二糖的糖蜜和乳清，麥芽糖多用其糖漿。糖蜜是制糖生產時的結晶后母液，是制糖工業(yè)的副產物，主要含蔗糖(總糖含量可達50％～75％)、氮素、無機鹽和維生素等營養(yǎng)物質，是微生物發(fā)酵培養(yǎng)基物美價廉的碳源。常用在酵母和丙酮、丁醇的生產中。糖蜜使用的注意點：除糖分外，含有較多的雜質，其中有些是有用的，但是許多都會對發(fā)酵產生不利的影響，需要進行預處理。例：谷氨酸發(fā)酵有害物資：膠體成分（起泡、結晶）、鈣鹽（結晶）生物素（發(fā)酵控制）預處理：澄清→脫鈣→脫除生物素糊精、淀粉及其水解液等多糖是僅次于葡萄糖的常用碳源，尤其是淀粉可以克服葡萄糖代謝過快的弊病，價格也比較低廉。玉米淀粉及其水解液多用于抗生素、核苷酸、氨基酸、酶制劑等發(fā)酵；小麥淀粉、燕麥淀粉和甘薯淀粉等常在有機酸、醇等發(fā)酵中使用。另淀粉有直鏈淀粉和支鏈淀粉之分，在培養(yǎng)基中用量較大時，發(fā)酵液比較稠，一般>2.0%時要加入一定的α-淀粉酶先行水解。（2）油和脂肪在培養(yǎng)基中糖類物質缺乏或微生物生長的某一階段，許多微生物可以利用脂類作為碳源和能源生長。許多霉菌和放線菌都具有比較活躍的脂肪酶，在脂肪酶的作用下，油或脂肪被水解為甘油和脂肪酸，在有氧時，進一步氧化成CO2和H2O，并釋放出大量的能量。當微生物利用脂肪作為碳源時，所消耗的氧量增加，因此要供給比糖代謝更多的氧?？捎玫挠椭愑卸褂?、菜油、葵花籽油、豬油、魚油、棉籽油、玉米油、亞麻子油、橄欖油等在發(fā)酵過程中加入的油脂還兼有消泡的作用。（3）有機酸及其鹽類一些微生物對乳酸、檸檬酸、乙酸、延胡索酸等及其鹽類有很強的氧化能力，因此這些有機酸和它們的鹽也能作為微生物的碳源。有機酸作為碳源，氧化產生的能量被菌體用于生長繁殖和代謝產物的合成。在利用有機酸時，發(fā)酵液的pH會隨著有機酸氧化而上升，尤其是有機酸鹽氧化時，常伴隨著堿性物質的產生，使pH進一步上升。對整個發(fā)酵過程中pH的調節(jié)和控制增加困難。醋酸鹽做為碳源被氧化時，反應如下：

CH3COONa+2O2

2CO2+H2O+NaOH（4）烴和醇類近年來隨著石油工業(yè)的發(fā)展，烷烴(一般是從石油裂解中得到的14～18碳的直鏈烷烴混合物，以及甲烷、乙烷、丁烷等)用于有機酸、氨基酸、維生素、抗生素和酶制劑的工業(yè)發(fā)酵中。甘油、甲醇、乙醇、山梨醇等也用于發(fā)酵碳源或生產某些單細胞蛋白。其他碳源物質如石油、天然氣等石油化工產品，也是許多微生物的碳源。例如乳糖發(fā)酵短桿菌以乙醇為碳源生產谷氨酸，對乙醇的轉化率為31％，產率達78g／L。3.氮源氮源是指構成微生物細胞物質和代謝產物的氮素的來源。其主要功能是：構成微生物細胞結構物質，如氨基酸、蛋白質、核酸等；合成含氮代謝產物；作為酶的組成分或維持酶的活性；調節(jié)滲透壓、PH值、氧化還原電位等；當培養(yǎng)基中碳源不足時，可作為補充碳源。氮源的種類無機氮源有機氮源氨基氮：

NH4OH(NH4)2SO4NH4NO3NH4Cl硝態(tài)氮：

NaNO3KNO3合成產物：尿素天然原料：植物蛋白：黃豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉、菜籽餅粉、

麥麩、玉米漿、玉米麩質粉動物蛋白：蛋白胨、魚粉、蠶蛹粉、牛肉膏微生物蛋白：酵母粉/浸膏、廢菌絲粉其它：酒糟等工業(yè)上常用的有機氮源都是一些廉價的原料或副產品。（1）無機氮源銨鹽((NH4)2SO4

、(NH4)2Cl、NH4NO3)、硝酸鹽(NaNO3、KNO3)氨水等。特點有：①成分簡單，質量穩(wěn)定；②易被菌體吸收利用；銨鹽中的NH4+與細胞中有機氮處于相同的氧化水平(細胞內的含氮物質也都以氨基或亞氨基的形式存在)，可被菌體直接吸收用于合成細胞物質；因此NH3·H2O最容易利用，(NH4)2SO4次之。硝酸鹽中的硝態(tài)氮需還原成氨后才能被微生物吸收利用，因此銨鹽比硝酸鹽能更快被微生物利用。無機氮源被微生物利用后常會引起發(fā)酵液pH的變化銨態(tài)氮和硝基氮氮源同化結果：(NH4)2SO4→2NH3+H2SO4：NH3被菌體利用，留下H2SO4則使pH值下降；NaNO3+4H2→NH3+2H2O+NaOH：NH3被菌體利用，留下NaOH使pH值上升；經過微生物代謝作用后能產生酸性物質的營養(yǎng)成分稱為生理酸性物質；生理酸性物質使pH值下降；經過微生物代謝作用后能產生堿性物質的營養(yǎng)成分稱為生理堿性物質；生理堿性物質使pH值上升。正確使用生理酸性物質和生理堿性物質，對穩(wěn)定和調節(jié)發(fā)酵過程的pH有積極作用。氨水是發(fā)酵工業(yè)常用的無機氮源，除了作為氮源之外，還可以調節(jié)pH，在許多微生物發(fā)酵生產中都有通氨工藝。例如在青霉素、鏈霉素、四環(huán)類抗生素的發(fā)酵生產中采用通氨工藝后，發(fā)酵單位均有不同程度的提高。在紅霉素的發(fā)酵生產中通氨工藝不僅可以提高紅霉素的產量，而且可以增加有效組分的比例。在采用通氨工藝時應注意兩個問題：一是氨水堿性較強，因此在使用時要防止局部過堿，應少量多次加入，并強強攪拌；二是氨水中含有多種嗜堿性微生物，因此在使用前要用石棉等過濾介質進行過濾除菌，防止因通氨而引起的染菌。（2）有機氮源來源：工業(yè)上常用的有機氮源都是一些廉價的原料，花生餅粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、魚粉、蠶蛹粉、尿素、廢菌絲體和酒糟。成分復雜：除提供氮源外，有些有機氮源還提供大量的無機鹽及生長因子。例如玉米漿：①可溶性蛋白、生長因子（生物素）、苯乙酸②較多的乳酸③硫、磷、微量元素等

有機氮源在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸被菌體吸收利用，或進一步分解，最終用于合成菌體的細胞物質和含氮的目的產物。其主要作用有：①除含有豐富的蛋白質、多肽和游離氨基酸外，還含有糖類、脂肪、無機鹽、維生素及某些生長因子，因而微生物在含有機氮的培養(yǎng)基中表現出生長旺盛、菌絲濃度增加迅速的特點。在配制培養(yǎng)基時，應該將其他物質的含量充分考慮進去。②有機氮源還能提供次級代謝產物的氮素來源，影響微生物次級代謝產物的產量和組分。更為重要的是還含有目的產物合成所需的誘導物、前體等物質。玉米漿中含有的磷酸肌醇對紅霉素、鏈霉素、青霉素和土霉素等的生產有促進作用；因此，有機氮源是影響發(fā)酵水平的重要因素之一。③某些氨基酸不僅能作為氮源，而且是微生物藥物的前體物質，因此在培養(yǎng)基中直接加入這些氨基酸可以提高代謝產物的產量。在培養(yǎng)基中加入纈氨酸可以提高紅霉素的發(fā)酵單位，因為在此發(fā)酵過程中纈氨酸既是菌體的氮源，又是紅霉素生物合成的前體。色氨酸是合成硝吡咯菌素和麥角堿的前體。但是，由于氨基酸成本高，一般不直接使用，而是通過有機氮源的分解來獲得氨基酸。常用的有機氮源黃豆餅粉是發(fā)酵工業(yè)中最常用的有機氮源。但是，黃豆的產地和加工方法不同，營養(yǎng)物質種類、水分和含油量也隨之不同，對菌體的生長和代謝有很大影響。根據油脂的含量：根據加工方法不同：全脂黃豆粉(油脂含量在18％以上)低脂黃豆粉(含油脂量9％以下)脫脂黃豆粉(含油脂量2％以下)。熱軋黃豆餅粉冷軋黃豆餅粉玉米漿是玉米淀粉生產中的副產品，為黃褐色的濃稠不透明的絮狀懸浮物，是一種很容易被微生物利用的氮源。玉米漿有玉米漿粉和液態(tài)玉米漿(干物質含量住50％左右)兩種，它們除了含有豐富的氨基酸(丙氨酸、賴氨酸、谷氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸)，還含有還原糖、有機酸、磷、微量元素和生長因子。由于玉米漿含有較多的有機酸(如乳酸、苯乙酸)，其pH偏低，一般在4.0左右。玉米的來源和加工條件不同，玉米漿的質量常有較大的波動，對菌體生長和代謝有很大的影響。其中含有的磷酸肌醇對紅霉素、鏈霉素、土霉素等的生產有促進作用；苯乙酸和苯丙氨酸有青霉素前體的作用

。蛋白胨是由動物組織或植物蛋白質經酶或酸水解而獲得的由胨、肽、氨基酸組成的水溶性混合物，經真空干燥或噴霧干燥后制得的產品。原材料和加工工藝的不同，蛋白胨中營養(yǎng)成分的組成和含量差異較大。酵母粉一般是啤酒酵母或面包酵母的菌體粉碎物；酵母膏是以酵母為原料，經酶解、脫色脫臭、分離和低溫濃縮(噴霧干燥)而制成的。酵母粉和酵母膏都含有蛋白質、多肽、氨基酸、核甘酸、維生素和微量元素等營養(yǎng)成分。魚粉是一種優(yōu)質的蛋白質原料，約含60％左右的粗蛋白，還含有游離氨基酸、脂肪、氯化鈉和微量元素等成分。尿素因其成分單一，所以不具有其他有機氮源的特點。但在青霉素和谷氨酸等生產中仍常被采用。在谷氨酸生產中，尿素可以使a-酮戊二酸還原并氨基化，提高谷氨酸的產量。工業(yè)上常用的有機氮源及含氮量(質量分數/%)氮源含氮量氮源含氮量大麥1.5～2.0花生粉8.0甜菜糖蜜1.5～2.0燕麥粉1.5～2.0甘蔗糖蜜1.5～2.0大豆粉8.0玉米漿4.5乳清粉4.5有機氮源都來自天然產物，受產地不同、加工方法不同，其質量不穩(wěn)定，常引發(fā)發(fā)酵水平波動，因此，選擇有機氮源時，要注意品種、產地、加工方法、貯藏條件對發(fā)酵的影響，注意它們與菌體生長和代謝產物合成的相關性。根據被微生物利用速度的不同，氮源也分為速效氮源和遲效氮源。無機氮源或以蛋白質降解產物形式存在的有機氮，如玉米漿，可以直接被菌體吸收利用，這些氮源被稱為速效氮源。黃豆餅粉和花生餅粉、酵母膏等，有機氮源中所含的氮存在于蛋白質中，必須在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸和多肽以后，才能被菌體直接利用，它們則被稱為遲效氮源。速效氮源通常有利于菌體的生長，遲效氮源一般有利于代謝產物的形成。因此，在抗生素發(fā)酵過程中，往往將速效氮源和遲效氮源、有機氮源和無機氮源按一定比例配成混合氮源，以控制菌體生長與目的代謝產物的形成，達到提高抗生素產量的目的。早期：加入易同化的氮源—無機氮源或速效氮源；中期：菌體的代謝酶系已形成，則可利用遲效氮源。主要功能是構成菌體成分、作為酶的組成部分、酶的激活劑或抑制劑、調節(jié)培養(yǎng)基滲透壓、調節(jié)pH值等。一般微生物所需要的無機鹽為硫酸鹽、磷酸鹽、氯化物和含鉀、鈉、鎂、鐵的化合物。還需要一些微量元素，如銅、錳、鋅、鉬等。4.無機鹽（1）磷酸鹽組成細胞的礦質元素中磷的含量最高磷是合成核酸、磷酸、一些重要的輔酶NAD、NADP、CoA等以及高能磷酸化合物（ADP、ATP）的重要原料。磷還有利于糖代謝的進行，因此對微生物的生長有明顯的促進作用。磷酸鹽還是磷酸緩沖液的組成成分，對環(huán)境中的pH起著重要的調節(jié)作用。配置培養(yǎng)基時，必須加入一定量的磷酸鹽.但是過量的磷常會抑制許多產物的合成。例如，谷氨酸發(fā)酵生產中，磷含量對谷氨酸發(fā)酵影響很大。磷濃度過高時，菌體生長旺盛，但是會抑制6-磷酸葡萄糖脫氫酶的活性，菌體轉向合成纈氨酸，谷氨酸產量降低；但磷含量過低，菌體生產不好。但也有一些產物的生產需要較高濃度的磷酸鹽。（2）硫酸鎂鎂

除葉綠素，不參與細胞的組成。酶激活劑，影響基質氧化與蛋白質合成。常以硫酸鎂加入，堿性溶液中會生成氫氧化鎂沉淀，配料時要注意。硫硫是含硫氨基酸的成分和某些輔酶的活性基，如輔酶A、硫辛酸和谷胱甘肽等。在某些產物中硫是組成元素。如青霉素分子含硫元素，在其生產培養(yǎng)基中，需要加入硫酸鈉或硫代硫酸鈉等含硫化合物作硫源。（3）鐵是細胞色素、細胞色素氧化酶和過氧化氫酶的成分，是菌體有氧氧化必不可少的元素。鐵制發(fā)酵罐內的溶液即使不加任何含鐵化合物，其鐵離子濃度已達30ug/ml。一些天然培養(yǎng)基的原料中也含有鐵，所以在一般發(fā)酵培養(yǎng)基中不再加入含鐵化合物。

鐵：有些產品對鐵很敏感：

例1：青霉素要求最適鐵含量在20ug/ml以下。

例2：檸檬酸生產中，無鐵培養(yǎng)基中產酸率可比含鐵培養(yǎng)基提高近3倍。

例3：生產啤酒時，糖化用水若鐵離子濃度高，就會降低酵母發(fā)酵活力。新發(fā)酵罐往往會造成培養(yǎng)基鐵離子濃度過高，所以要加以處理。處理方法：罐內壁涂生漆或耐熱環(huán)氧樹脂，以防止鐵離子脫落。（4）鈣能控制細胞透性。常用碳酸鈣，能與代謝產生的酸起反應，對pH有一定的調節(jié)作用。配制培養(yǎng)基時，要先將培養(yǎng)基用堿調到中性，才能將碳酸鈣加入。當培養(yǎng)基中磷和鈣均要求較高濃度時，可將二者分別消毒或逐漸補加。（5）鉀、鈉鉀、鈉離子雖然不是細胞的組成成分，但仍是微生物發(fā)酵所必須的成分。這些離子與維持細胞的滲透壓和細胞透性有關。（6）鎂、鋅、Cu、Mn、Co等微量元素是某些酶的輔酶或激活劑。

5.生長因子生長因子為微生物必不可少的物質，一般為小分子有機物，需求量很小。包括：維生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶及其衍生物、卟啉及其衍生物、固醇、胺類以及脂肪酸等。能夠提供生長因子的天然物質有酵母膏、蛋白胨、麥芽汁、玉米漿、動植物組織或細胞浸液及微生物生長環(huán)境的提取液。也可以在培養(yǎng)基中加入已知成分和含量的復合維生素液。主要功能是提供微生物重要化學物質（蛋白質、核酸和脂質）、輔因子（輔酶和輔基）的組分和參與代謝。應用實例：生物素——合成生物質膜的重要輔酶，不足會造成細胞膜不完整，細胞內容物的滲漏。添加亞適量（5mg/L），可即使菌體生長少受抑制也可以使過多的谷氨酸因外泄而源源不斷地合成。6.發(fā)酵培養(yǎng)基專用添加劑——

前體、誘導物、促進劑和抑制劑前體前體指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在生物合成過程中能直接被微生物結合到產物分子中去，而其自身的結構并沒有多大變化，但產物的產量卻因加入前體而有較大的提高。在青霉素發(fā)酵時，人們發(fā)現添加玉米漿后，青霉素單位可從20μg/Lml增加到l00μg/ml。進一步研究表明，發(fā)酵單位增加的主要原因是玉米漿中含有苯乙酰胺，它能被優(yōu)先結合到青霉素分子中，從而提高了青霉素G的產量。青霉素苯乙酸前體必須通過產生菌的生物合成過程，才能摻入到產物的分子結構中。在一定條件下，前體可以起到控制菌體代謝產物的合成方向和增加產量的作用。例如在青霉素發(fā)酵中加入苯乙酸或苯乙酰胺可以提高青霉素G的產量，而且使青霉素G的比例提高到99%，若不加入前體，青霉素G只占青霉素總量的20%-30%。根據前體的來源，可將前體分為外源性前體和內源性前體。外源性前體是指產生菌不能合成或合成量極少，必須由外源添加到培養(yǎng)基中供給其合成代謝產物，如青霉素G的前體苯乙酸、青霉素V的前體苯氧乙酸。外源性前體是發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分之一。內源性前體是指產生菌在細胞內能自身合成的、用來合成代謝產物的物質，如頭孢菌素C生物合成中的α-氨基己二酸、半胱氨酸和纈氨酸是內源性前體。需要注意的是：有些外源性前體物質，如苯乙酸、丙酸等濃度過高會對菌體產生毒性；此外，有些產生菌能氧化分解前體，因此在生產中為了減少毒性和提高前體的利用率，補加前體宜采用少量多次的間歇補加方式或連續(xù)流加的方式?？股厍绑w物質青霉素G苯乙酸或在發(fā)酵中能形成苯乙酸的物質，如苯乙基酰胺等青霉素V苯氧乙酸放線菌素C3肌氨酸鏈霉素肌醇、精氨酸金霉素氯化物紅霉素丙酸、丙醇、丙酸鹽灰黃霉素氯化物抗生素發(fā)酵常用的前體物質氨基酸發(fā)酵的前體物質氨基酸前體物質絲氨酸甘氨酸色氨酸氨茴酸色氨酸吲哚蛋氨酸2-羥基4-甲基硫代丁醇異亮氨酸α-氨基丁酸異亮氨酸D-蘇氨酸蘇氨酸高絲氨酸（2）誘導物誘導物一般是指一些特殊的小分子物質，在微生物發(fā)酵過程中添加這些小分子物質后，能夠誘導代謝產物的生物合成，從而顯著提高發(fā)酵產物的產量。根據誘導物的來源，可將誘導物分為內源性誘導物和外源性誘導物。內源性誘導物又稱為內源性誘導因子或自身調節(jié)因子，是在微生物的代謝過程中產生的調節(jié)因子，如鏈霉素的產生菌灰色鏈霉菌的發(fā)酵液中有一種被稱為A因子的物質能夠使不產鏈霉素的突變株恢復產生鏈霉素，其他還有I因子、L因子等。外源性誘導物又稱為外源性誘導因子，是添加在培養(yǎng)基中的外源性物質，如存在于培養(yǎng)基中的淀粉、糊精是淀粉酶發(fā)酵的誘導物。（3）促進劑和抑制劑

在發(fā)酵過程中加入某些對發(fā)酵起一定促進作用的物質，稱為促進劑或刺激劑。在培養(yǎng)基中添加微量的促進劑可大大地增加某些微生物酶的產量。常用促進劑有各種表面活性劑（洗凈劑、吐溫80、植酸等）、二乙胺四乙酸、大豆油抽提物、黃血鹽、甲醇等。巴比妥鹽能使利福霉素單位增加，并能使鏈霉菌推遲自溶，延長分泌期。酵母甘露聚糖可誘導甘露糖苷酶的產生，促使甘露糖鏈霉素轉化為鏈霉素。控制生物素的加入量，可以促進谷氨酸從細胞內分泌到細胞外。加聚乙烯醇衍生物可防止菌絲結球，提高糖化酶的產量。舉例：（3）促進劑和抑制劑

在不同的情況下，不同的促進劑所起的作用也各不相同。抑制劑在發(fā)酵過程中加入某些化學物質會抑制某些代謝途徑的進行，同時會使另一代謝途徑活躍，從而獲得人們所需的某種代謝產物，或使正常代謝的中間產物積累起來，這種物質被稱為抑制劑。抑制劑舉例1：如在四環(huán)素發(fā)酵時，加入溴化物可以抑制金霉素的生物合成，而使四環(huán)素的合成加強。舉例2：微生物發(fā)酵生產甘油。在發(fā)酵液中加入亞硫酸氫鈉，它與代謝中產生的乙醛生成加成物，使乙醇的產生受阻CH3CHO+NaHSO3→CH3CHOH-OSO3Na乙醛不能成受氫體，而使NADH在細胞中積累。

G

ATPADP6-P-G

6-P-F

1，6-二磷酸-果糖

2*3-磷酸-甘油醛2*NAD+2*乙醇（CH3CH2OH）

2*NADH+H+

2*1，3-二磷酸-甘油酸

2*ADP

2*乙醛（氫受體）

（CH3CHO）

2*ATP2*3-P-甘油酸2*丙酮酸

2*ATP2*2-P-甘油酸2*磷酸烯醇式丙酮酸2*ADP

EMP途徑

乙醇發(fā)酵PiATPADPCO2乙醇脫氫酶

NADH在細胞中積累，激活３

-磷酸甘油脫氫酶的活性，使磷酸二羥基丙酮作為NADH的受氫體，而還原為３

-磷酸甘油酸，再甘油激酶催化形成甘油。亞硫酸氫納是乙醇代謝的抑制劑，促使甘油形成。溴化劑能抑制金霉素形成的代謝途徑，促使四環(huán)素的生成。抑制劑促進的抗生素被抑制的產物抑制劑鏈霉素甘露糖鏈霉素甘露聚糖去甲基鏈霉素鏈霉素乙硫氨酸四環(huán)素金霉素溴化物、巰基苯并噻唑、硫脲嘧啶、硫脲去甲基金霉素金霉素磺胺化合物、乙硫氨酸頭孢菌素C頭孢菌素NL-蛋氨酸利福霉素B其他利福霉素巴比妥藥物抗生素生產中應用的促進劑或抑制劑培養(yǎng)基和設備的滅菌微生物發(fā)酵制藥技術基礎培養(yǎng)基滅菌的原理在發(fā)酵工業(yè)中，對培養(yǎng)基和發(fā)酵設備的滅菌，廣泛使用濕熱滅菌法。當培養(yǎng)基被加熱滅菌時，常會出現這樣的矛盾：加熱時，微生物固然會被殺死，但培養(yǎng)基中的有用成分也會隨之遭到破壞。因此，必須選擇一個既能滿足滅菌需要，又可使培養(yǎng)基的破壞盡可能少的滅菌工藝條件。致死溫度：殺死微生物的極限溫度。致死時間：在致死溫度下，殺死全部微生物需要的時間。熱阻：對熱的抵抗力，指微生物在某一特定條件（主要是溫度和加熱方式）下的致死時間。相對熱阻：微生物對熱的相對抵抗能力。指微生物在某一特定條件下的致死時間與另一微生物在相同條件下的致死時間的比值。（一）微生物的熱阻N—殘存的活菌數；t—滅菌時間（s）；K—滅菌速率常數（s-1），或比死亡速率常數，此常數的大小與微生物的種類與加熱溫度有關；dN/dt—活菌數瞬時變化速率，即死亡速率。（二）對數殘留定律

1.滅菌時間的確定

微生物受熱死亡的主要原因是高熱能使蛋白質變性，這種反應可認為是單分子反應，死亡速率可視為一級反應。

微生物的死亡速率與任一瞬時殘存的活菌數成正比。滅菌時間的確定：對數殘留定律

t取決于污染程度N0滅菌的程度Ns：Ns=0，t→∞；工程設計常用Ns=10-3個/mL，也就是每處理1000批培養(yǎng)基只允許殘留一個活的微生物或1000次滅菌操作中有一次失敗。

只有相對無菌，沒有絕對無菌。滅菌速率常數k：是微生物耐熱性的特征，k的大小與微生物的種類和滅菌溫度有關。

2.死亡速率常數k

滅菌速率常數k是判斷微生物受熱死亡難易程度的基本依據，隨微生物種類和滅菌溫度而異。同一溫度下，不同微生物的k值不同，k值愈小，微生物愈耐熱。同一種微生物，滅菌溫度越低，k值越小；滅菌溫度越高，k值越大。因此，提高滅菌溫度，k值增大，滅菌時間t顯著縮短。A---頻率常數，也稱阿累尼烏斯常數，s-1；R---氣體常數，8.314J/mol·K；T---絕對溫度，K；ΔE---微生物死亡活化能，J/mol?；蚺囵B(yǎng)基成分分解所需活化能K—滅菌速率常數（s-1），或培養(yǎng)基內易被破壞成分的分解速率常數微生物的受熱死亡及培養(yǎng)基受熱破壞都屬于單分子反應，符合一級反應動力學，兩個方程中的速率常數K與溫度之間的關系可用阿累尼烏斯公式表示：從上式可知，K值的大小與微生物或營養(yǎng)成分的種類與加熱溫度有關3.滅菌溫度的選擇溫度為T1時，（2-9）溫度為T2時，

（2-10）上述兩式相除后，取對數得（2-11）培養(yǎng)基滅菌時，當加熱溫度由T1升至T2時，微生物的死亡速率常數k的變化情況為：對培養(yǎng)基成分的破壞而言，同樣有：（2-12）滅菌時殺死微生物的活化能大于培養(yǎng)基成分的破壞活化能能，因此：

即隨著溫度的上升，微生物的死亡速率常數增加倍數要大于培養(yǎng)基成分破壞速率的增加倍數。從上述的分析可知，在熱滅菌過程中，同時會發(fā)生微生物死亡和培養(yǎng)基破壞這兩種過程。溫度升高，菌體死亡速率大于培養(yǎng)基成分破壞的速率。滅菌溫度（℃）滅菌時間（min）維生素B1的破壞量（%）1001101201301451504003640.50.080.0199.367.027.08.02.0＜1.0不同滅菌溫度、時間與培養(yǎng)基成分破壞情況（Ns/No=10-3）滅菌溫度越高，培養(yǎng)基達到完全滅菌所需時間越短，營養(yǎng)成分的破壞量也越少。提高滅菌溫度，縮短滅菌時間，可達到相同的滅菌效果，并有利于減少培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質的破壞。因此發(fā)酵培養(yǎng)基通常采用高溫短時的滅菌方法。滅菌要達到殺死99.99%的細菌芽孢，有兩種方法可以采用，一種是118℃滅菌15min，另一種是128℃滅菌5min。哪一種方法好，為什么？問題（三）影響滅菌的因素污染雜菌的種類、數量滅菌溫度、時間（三）影響滅菌的因素培養(yǎng)基成分、物理狀態(tài)脂肪、糖分和蛋白質等有機物增加微生物細胞的耐熱性，高濃度鹽類、色素等的存在會削弱微生物細胞的耐熱性。固體培養(yǎng)基滅菌時間要比液體培養(yǎng)基滅菌時間長。培養(yǎng)基的pH值pH值6.0～8.0，微生物最耐熱；培養(yǎng)基的pH值愈低，滅菌所需時間愈短培養(yǎng)基中微生物數量微生物數量越多，達到滅菌效果所需的時間愈長微生物細胞含水量、菌齡

微生物細胞所含水分越多，則蛋白質凝固溫度越低，微生物細胞愈易受熱而喪失生命力。年老細胞含水量低，對不良環(huán)境的抵抗能力比年輕細胞強。微生物的耐熱性

芽孢＞孢子＞營養(yǎng)體空氣排出情況攪拌、泡沫

實際生產中應防止突然減少進汽或加大排汽，減少進排汽不平衡，防止泡沫的大量生成，同時對極易發(fā)泡的培養(yǎng)基應加少量消泡劑減少泡沫量。培養(yǎng)基和設備的滅菌微生物發(fā)酵制藥技術基礎培養(yǎng)基滅菌方法（一）分批滅菌分批滅菌：分批滅菌就是將配制好的培養(yǎng)基全部輸入到發(fā)酵罐內或其他裝置中，通入蒸汽將培養(yǎng)基和所用設備一起加熱至滅菌溫度后維持一定時間，再冷卻到接種溫度，也稱為間歇滅菌，實罐滅菌或實消，是中小型發(fā)酵罐通常采用的一種培養(yǎng)基滅菌方法。分為三個階段：升溫、保溫和冷卻。實罐滅菌是典型的分批滅菌。全過程包括升溫、保溫、降溫三個過程

培養(yǎng)基的配制及輸送：在配制罐中按照培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基后，通過專用管道輸入發(fā)酵罐中。滅菌前準備工作：開始滅菌時，將發(fā)酵罐的空氣分過濾器進行滅菌，用壓縮空氣將分過濾器吹干，保壓。放去夾套或蛇管中的冷卻水，開啟排氣管閥。1.操作方法加熱（1）預熱開啟攪拌，在夾套或蛇管中通入蒸汽進行間接加熱，培養(yǎng)基的溫度達到90℃左右時，停止攪拌，關閉夾套蒸汽閥門。預熱的目的防止直接導入蒸汽時由于培養(yǎng)基與蒸汽的溫度過大而產生大量的冷凝水使培養(yǎng)基稀釋防止直接導入蒸汽所造成的泡沫急劇上升而引起的物料外溢。1.操作方法（2）三路進汽從空氣管、取樣管、放料管蒸汽旁通閥門向罐內直接通入蒸汽，排氣管冒出大量蒸汽后，打開接種、補料、消泡劑、酸堿等管道閥門，調節(jié)好各排汽和進汽閥門的開度，使培養(yǎng)基溫度達到120℃，1×105pa。三路進汽：蒸汽直接從空氣管、取樣管、放料管蒸汽旁通閥門進入罐內直接加熱圖2-4分批滅菌設備示意圖保溫：調節(jié)好各進汽和排汽閥門開度，使罐壓和溫度保持在120℃、1×105pa。凡進口在培養(yǎng)基液面下的各管道（空氣、取樣、排料）都應通入蒸汽，在液面上的各管道（接種、補料、消泡劑、酸堿補料等）則應排放蒸汽，保證滅菌徹底，不留死角。1.操作方法冷卻：先關閉發(fā)酵罐頂部各路進料管道上的閥門，然后依次關閉放料管路、通風管路、取樣管路上的閥門。保持罐頂的排氣閥排蒸汽，使壓力降低至0.05MPa時，打開通風管路上各空氣閥，進無菌空氣保壓，一般調節(jié)罐壓在0.1MPa左右。

再在夾套或蛇管中通入冷水，培養(yǎng)基溫度降至70-80℃后，開攪拌，繼續(xù)降溫。使培養(yǎng)基溫度降到所需要的溫度。1.操作方法需注意問題配制的培養(yǎng)基體積應準確培養(yǎng)基滅菌前，要對發(fā)酵罐進行空消，對pH、DO傳感電極進行校正夾套內可通入蒸汽對培養(yǎng)基進行間接加熱（預熱），也可通入冷卻水使培養(yǎng)基降溫，這兩個過程均需進行攪拌，但必須在70-80℃下才能攪拌。在加熱和保溫過程中應使所有與發(fā)酵罐相連的管道中都有蒸汽通過，不留死角。加熱和保溫過程中，防止突然開大或關小進汽、排汽閥門，避免大量泡沫產生。冷卻階段，注意保壓，防止二次污染3.培養(yǎng)基分批滅菌的優(yōu)點設備要求低，不需另外設置加熱冷卻裝置；操作要求低，適于手動操作；適合于小批量生產規(guī)模；適合于含大量固體物質的培養(yǎng)基滅菌。4.培養(yǎng)基分批滅菌的缺點培養(yǎng)基營養(yǎng)物質損失較多，滅菌后培養(yǎng)基質量下降；需反復進行加熱和冷卻，能耗較高；不適合于大規(guī)模生產過程的滅菌；加熱和冷卻所需時間較長，增加了發(fā)酵的準備時間，就相應地延長了發(fā)酵周期，使發(fā)酵罐得利用率降低。（二）連續(xù)滅菌將配制好的培養(yǎng)基通過專門設計的滅菌器，進行連續(xù)流動滅菌后，進入預先滅菌過的發(fā)酵罐中的滅菌方式，也稱為連消。

依設備和工藝條件的不同，連續(xù)滅菌分：連消塔加熱的連續(xù)滅菌流程噴射加熱器加熱的連續(xù)滅菌流程薄板換熱器加熱的連續(xù)滅菌流程1.連消塔加熱的連續(xù)滅菌流程這是國內味精廠普遍采用的連續(xù)滅菌流程。培養(yǎng)基用泵打入連消塔與蒸汽直接混合，在連消塔內的停留時間為20～30s，達到滅菌溫度132℃。再送入維持罐保溫，時間8～25min，最后由噴淋冷卻器冷卻至后續(xù)的發(fā)酵或培養(yǎng)溫度。

缺點：設備較龐大；維持罐直徑較大，不能保證物料先進先出，易發(fā)生局部過熱或滅菌不足的現象；噴淋冷卻管道很長，對于黏度較高、固形物含量較多的培養(yǎng)基極易堵塞。2.噴射加熱器加熱的連續(xù)滅菌流程優(yōu)點：能保證培養(yǎng)液在噴射加熱器和維持管中的先進先出，避免了培養(yǎng)基過熱和滅菌不徹底現象，培養(yǎng)基總的受熱時間短，營養(yǎng)物質的損失不嚴重。缺點：真空冷卻系統(tǒng)要求嚴格密封，以免重新污染。3.薄板換熱器加熱的連續(xù)滅菌流程

薄板換熱器由于具有設備緊湊、占地面少、拆洗方便、傳熱面積和傳熱系數高、不使熱敏物料產生局部過熱現象等優(yōu)點，被廣泛用于食品、發(fā)酵、制藥、化工部門作為加熱、冷卻或滅菌之用。采用板式換熱器的連續(xù)滅菌流程，生培養(yǎng)液進入板式換熱器的熱回收與熟培養(yǎng)液先進行一次熱交換達到預熱，以便提高熱量的利用率，然后進入加熱階段到滅菌溫度后引入維持器進行保溫，滅菌好的熟培養(yǎng)液再進入熱回收段作為生培養(yǎng)液的加熱介質，同時本身也得到一定程度的冷卻，最后進入冷卻階段用冷卻水冷卻到所需培養(yǎng)溫度。板式換熱器的特點是：培養(yǎng)基在設備中同時完成預熱、滅菌及冷卻過程。雖然加熱和冷卻生培養(yǎng)液所需時間比使用噴射式連續(xù)滅菌較長，但滅菌周期比分批滅菌小得多。由于生培養(yǎng)基的預熱過程即滅菌培養(yǎng)基的冷卻過程，所以節(jié)約了蒸汽及冷卻水的用量，板式換熱器的缺點是制造加工復雜，必須有專業(yè)廠成批生產，密封要求高，密封填圈易損壞，需經常調換。連續(xù)滅菌的優(yōu)缺點優(yōu)點短時間內加熱到保溫溫度且能快速冷卻，減少養(yǎng)分的損失操作條件恒定，滅菌質量穩(wěn)定易于實行管道化和自動化控制避免反復加熱和冷卻，提高了熱利用率發(fā)酵設備利用率高缺點設備要求高，需另外設置加熱冷卻裝置操作比較麻煩染菌機會多對蒸汽要求高不適合大量固體物料的滅菌注意問題連續(xù)滅菌前發(fā)酵罐應進行空消連續(xù)滅菌流程中使用的加熱器、維持器、冷卻器等應先進行清洗和滅菌培養(yǎng)基滅菌前應先預熱耐熱性物料和不耐熱性物料可在不同溫度下分消培養(yǎng)基和設備的滅菌微生物發(fā)酵制藥技術基礎設備和管道的滅菌種子罐、發(fā)酵罐、計量罐、補料罐等空罐滅菌

從各罐底部的有關管道通入蒸汽，使罐內壓力達0.147MPa，維持45min。滅菌完畢，關閉蒸汽閥后，待罐內壓力低于空氣過濾器壓力時通入滅菌空氣保壓至0.098MPa?？諝饪傔^濾器和分過濾器滅菌

從空氣過濾器上部通入蒸汽，并從上、下排氣口排氣，維持壓力0.147MPa，滅菌2h。滅菌完畢，通入壓縮空氣將空氣過濾器吹干，然后保壓。補料管路，消沫劑管路滅菌

可與補料罐、消沫劑罐同時進行滅菌，但保溫時間為1h。接種管路滅菌一般要求蒸汽壓力0.3～0.45MPa，保溫1h。培養(yǎng)基和設備的滅菌微生物發(fā)酵制藥技術基礎

其他物料和實驗用具的滅菌條件滅菌鍋滅菌條件：固體培養(yǎng)基0.098MPa，20-30min；液體培養(yǎng)基0.098MPa，15-20min；玻璃器皿及用具0.098MPa，30-60min種子培養(yǎng)基實罐滅菌條件：121℃，30min消泡劑滅菌條件：121℃，30min尿素溶液滅菌條件：105℃，5min補料實罐滅菌條件：淀粉液121℃，5min

糖液120℃，30min培養(yǎng)基和設備的滅菌微生物發(fā)酵制藥技術基礎滅菌的方法培養(yǎng)基滅菌的定義是指從培養(yǎng)基中殺滅有生活能力的細菌營養(yǎng)體及其孢子，或從中將其除去。工業(yè)規(guī)模的液體培養(yǎng)基滅菌，殺滅雜菌比除去雜菌更為常用。熱滅菌法(干熱、濕熱和火焰滅菌法)射線滅菌法臭氧滅菌法化學試劑滅菌法過濾除菌法(阻留微生物，達到除菌的目的)

（一）干熱滅菌法

160℃，1-2h。使微生物體內的蛋白質發(fā)生氧化作用而死亡。用于玻璃和金屬器皿的滅菌。（二）濕熱滅菌法濕熱滅菌法：利用飽和蒸汽滅菌。使微生物體內的蛋白質發(fā)生凝固作用而致死。由于蒸汽有很強的穿透力，冷凝時放出大量的潛熱，來源方便，價格低廉，滅菌效果好，是目前最基本的適合培養(yǎng)基和設備的滅菌方法。一般條件為：121℃，30min。用于生產設備、培養(yǎng)基、管道、閥門、流加物料等的滅菌。（三）射線滅菌法原理：利用高能電子波、紫外線或放射性物質產生的高能粒子，可以穿透微生物細胞而達到滅菌的方法。常用的射線有：宇宙線（0.0001～0.1?）、γ射線、x射線、紫外線、高速電子流的陰極射線等。適用范圍有限，只用于無菌室、無菌箱等局部空間和器皿等的表面消毒。（四）化學試劑滅菌法消毒劑用途常用濃度使用方法1氧化劑：高錳酸鉀漂白粉

皮膚消毒發(fā)酵工廠環(huán)境消毒

0.1-0.25%2-5%

環(huán)境消毒可直接用于粉體2醇類：乙醇

皮膚及器物的消毒

70-75%

器物消毒浸泡30min3酚類：石碳酸來蘇爾

浸泡衣物、擦拭房間桌面、噴霧消毒皮膚、桌面、器械消毒

1-5%3-5%

作用10-15min4甲醛空氣消毒1-2（10-15ml/m3）加熱熏蒸4h5銨鹽新潔爾滅

皮膚、器械、環(huán)境消毒

0.1-0.25%

浸泡30min化學消毒劑方法的局限性

由于化學試劑會與培養(yǎng)基中的成分作用，并且會殘留在培養(yǎng)基中，所以只適合一些環(huán)境及器皿表面的消毒而不適合于培養(yǎng)基的滅菌。（五）火焰滅菌法利用火焰直接把微生物殺死。方法簡單、滅菌徹底，但僅適用于接種針、玻璃棒、試管口、三角瓶口、接種管口等。（六）過濾除菌法

利用過濾介質將微生物菌體細胞截留過濾，從而達到除菌的方法。

工業(yè)上常用此法制備大量的無菌空氣，供好氣性微生物的培養(yǎng)使用。也可用于容易被熱破壞的培養(yǎng)基的滅菌。過濾介質：發(fā)酵工業(yè)：棉花、玻璃纖維、石棉、濾紙實驗室：硝酸纖維薄膜、聚碳酸膠片（核輻射和化學刻蝕處理濾器孔徑：常用0.22μm、0.45μm。（七）臭氧滅菌法

利用臭氧的氧化作用而殺死微生物細胞的滅菌方法。

使用安全、安裝靈活，殺菌作用明顯，不僅能殺死

各種細菌還能殺滅霉菌。主要用于潔凈室和設備內部的消毒?？諝獬⑸锇l(fā)酵制藥技術基礎空氣除菌方法

適用于供給發(fā)酵需要大量空氣的滅菌和除菌方法：加熱滅菌：空氣中的細菌芽孢在218℃維持24s，就被殺死。可殺死噬菌體

靜電除塵：達不到無菌要求介質過濾除菌：用介質阻截塵埃和微生物。普遍使用。1、加熱滅菌將空氣加熱到一定溫度后保溫一定時間,使微生物蛋白熱失活而致死。熱殺菌是有效的、可靠的殺菌方法，但是如果采用蒸汽或電熱來加熱大量的空氣，以達到殺菌目的，這是十分不經濟的。工業(yè)上是利用空氣壓縮時放出的熱量進行殺菌。利用壓縮熱進行空氣滅菌的流程空氣進口溫度為21℃，出口溫度為187-198℃，壓力為0.7MPa。壓縮后的空氣用管道或貯氣罐保溫一定時間以增加空氣的受熱時間，促使有機體死亡。為防止空氣在貯罐中走短路，最好在罐內加裝導筒。這種滅菌方法已成功地運用于丙酮、丁醇、淀粉酶等發(fā)酵生產上?？諝饪諌簷C粗過濾器保溫層貯氣罐滅菌后空氣

石油發(fā)酵的無菌空氣系統(tǒng)采用渦輪式空壓機，空氣進機前利用壓縮后的空氣進行預熱，以提高進氣溫度并相應提高排氣溫度，壓縮后的空氣用保溫罐維持一定時間。空氣吸收塔滅菌后空氣粗過濾器預熱器渦輪壓縮機保溫罐列管式冷卻器空氣缺點：空氣的傳熱效率較低，溫度分布不均勻；有些耐熱的孢子需要非常長的時間才能殺滅，所以用加熱的方法不能夠大量制備無菌空氣作用：可除去水分、油霧、塵埃、微生物。2.

靜電除菌靜電除塵是利用靜電引力來吸附帶電粒子而達到除菌除塵的目的。優(yōu)點：阻力??；染菌率低，除水除油效果好，耗電少。缺點：設備龐大，需采用高壓電技術，一次性投資較大；一次捕集率尚不能滿足要求。應用：主要應用于超凈工作臺和無菌室等所需無菌空氣的第一次除塵，然后再配合高效過濾器使用。①絕對過濾絕對過濾介質的孔隙小于細菌和孢子，當空氣通過時微生物被阻留在介質的一側。絕對過濾易于控制過濾后空氣質量，節(jié)約能量和時間，操作簡便，它是多年來受到受到國內外科學工作者注意和研究的問題。它采用很細小的纖維介質制成，介質空隙小于0.5um。3.介質過濾除菌②深層介質過濾深層過濾介質的截面孔隙大于微生物，為了達到所需的除菌效果，介質必須有一定的厚度，因此稱為深層過濾介質。深層介質過濾除菌是目前工業(yè)上用的較多的空氣除菌方法，它是采用定期滅菌的介質來阻截流過的空氣所含的微生物，而取得無菌空氣?？諝獬⑸锇l(fā)酵制藥技術基礎

提高空氣過濾除菌效率的措施保證進口空氣清潔度，如加強生產場地衛(wèi)生管理，正確選擇進風口，加強空氣壓縮前的預處理。設計和安裝合理的空氣過濾器，選用除菌效率高的過濾介質。設計合理的空氣預處理設備，選擇合適的空氣凈化流程，以達到除油、水和雜質的目的。降低進入空氣過濾器的空氣相對濕度，如使用無油潤滑的空氣壓縮機，加強空氣冷卻和去油，提高進入過濾器的空氣溫度?？諝獬⑸锇l(fā)酵制藥技術基礎空氣過濾除菌1.棉花

使用要求：有彈性、纖維度適中，纖維直徑16～21μm，在過濾器里的填充密度為150～200kg/m3，

填充率為8.5%～10%。缺點：阻力大，易結團，過濾效果不穩(wěn)定，拆裝勞動強度大，不能再生。容易潮濕，受潮后阻力更大。（一）常用過濾介質與過濾器2.活性炭要求：小圓柱狀顆?；钚蕴?，大小為φ（3×10）～（3×15）mm，應質地堅硬，顆粒均勻，不易壓碎，裝填前應將粉末和細粉篩去。填充密度為470～530kg/m3，填充率44%，其濾層厚度為總濾層厚度的1/3～1/2。常將活性炭夾裝在兩層棉花中使用，以降低介質層的阻力。

3.玻璃纖維使用無堿的玻璃纖維，其直徑一般為5～19μm。直徑越小越好，但小易斷，缺點：更換時碎末飛揚，過敏。散裝時裝填系數不宜過大，一般為5%～11%。超細玻璃纖維：超細玻璃纖維直徑一般為1～1.5μm，一般制成厚度為0.25～0.44mm的纖維紙，3～6張濾紙疊在一起，夾在平板式纖維紙過濾器中。密度為380kg/m3,形成的網格空隙為0.5～5μm，具有較高的過濾效率。4.燒結材料燒結材料過濾介質是將金屬、陶瓷、塑料的粉末加壓成型后，然后在其熔點溫度下粘結固定，由于只是粉末表面熔融，其保持了粒子的空間和間隙，形成了微孔通道，具有微孔過濾的作用。由于這種過濾介質加工困難，空隙不可能做得很小，一般都在10～30μm。

(1)深層纖維介質（棉花、活性炭、玻璃纖維）過濾器：棉花活性炭過濾器的過濾效率可達99%。過濾介質裝填為：上部和下部裝填棉花，其厚度為總過濾層的2*（1/4~1/3），中間再裝入1/2~1/3厚度的活性炭。一般棉花的填充密度為150~200公斤/米3，活性炭40~450公斤/米3。

5.過濾器

(1)深層纖維介質（棉花、活性炭、玻璃纖維）過濾器：填充物順序：孔板－鐵絲網－麻布－棉花－麻布－活性炭－麻布－棉花－麻布－鐵絲網－孔板

棉花-活性炭過濾器示意圖棉花經過多次加熱滅菌后，顏色逐漸變深，靠近過濾器壁的棉花，因經受夾層蒸汽的烤干，受熱更為劇烈，更容易變成粉末，而被空氣帶走，造成過濾層有縫隙，使過濾層疏松而漏風．甚至還因過高的壓力和過長時間的烘烤而引起棉花活性炭著火的事故。(2)平板纖維紙過濾器結構：筒身、頂蓋、濾層、夾板、緩沖層孔板→銅絲網→麻布→濾紙（3-6層）→銅絲網→孔板(二）空氣的過濾除菌原理

當氣流通過濾層時，基于濾層纖維的層層阻礙，迫使空氣在流動過程中出現無數次改變氣速大小和方向的繞流運動，從而導致微生物微粒與濾層纖維間產生慣性撞擊截留、攔截截留、布朗擴散、重力沉降及靜電引力等作用，從而把微生物微粒截留、捕集在纖維表面上，實現了過濾的目的。慣性沖擊滯留作用微粒隨氣流以一定速度通過深層介質時，受到縱橫交錯的纖維絲阻迫，空氣不斷改變運動方向繞過纖維絲從孔隙中通過，而微粒由于慣性大，未能及時改變運動方向，一直運動到纖維表面，由于與纖維的磨擦粘附作用，被吸附在纖維表面上。直徑很小的微粒不隨氣流運動，而是不規(guī)則的直線運動，即布朗擴散運動，如果撞在過濾器纖維上就被捕獲。氣流速度很小、纖維網格孔隙較小時發(fā)生。布朗擴散作用攔截滯留作用小而輕的微粒隨氣流運動，氣流繞過纖維前進時，離纖維表面太近的微粒就會被截留下來。靜電吸附作用空氣中微生物顆粒一方面帶有與介質表面相反的電荷或由于感應而得到相反電荷而被介質吸附；另一方面空氣流過介質時，介質表面就感應出很強的靜電荷而使微生物微粒被吸附而沉淀。在過濾除菌中，有時很難分辨上述各種機理各自所作貢獻的大小。隨著參數的變化，各種機理所起的作用也不相同。一般認為慣性撞擊截留、攔截截留和布朗運動截留的作用較大，而重力和靜電引力的作用則很小。氣流速度小：布朗擴散起主要作用氣流速度中等：攔截截留作用顯著氣流速度大：慣性沖擊滯留作用顯著氣流速度過大：微粒被氣流夾帶返回氣流（三）過濾除菌效率過濾效率就是濾層所濾去的微粒數與原來微粒數的比值，它是衡量過濾器過濾能力的指標：

空氣過濾器的過濾效率主要與微粒的大小、過濾介質的種類和規(guī)格(纖維直徑)、介質的填充密度、介質層厚度以及氣流速度等因素有關。

空氣除菌微生物發(fā)酵制藥技術基礎空氣的預處理過濾除菌的一般流程空氣過濾除菌一般是把吸氣口吸入的空氣先進行壓縮前過濾，然后進入空氣壓縮機。從空氣壓縮機出來的空氣(一般壓力在0.2MPa以上，溫度120-160℃)，先冷卻至適當溫度(20-25℃)除去油和水，再加熱至30-35℃，最后通過總空氣過濾器和分過濾器(有的不用分過濾器)除菌。1.高空取氣管為遠離地面幾十米的管子。每升高10米，空氣中雜菌降低一個數量級。因此從高空取氣要比從低空取氣有利得多。主要作用：捕集較大的灰塵顆粒。減輕壓縮機的磨損和主過濾器的負荷，提高除菌后空氣的質量。常用的粗過濾器有：過濾絲網、紙框粗過濾器、麻袋等。2.粗過濾器（安裝在壓縮機前）作用：增加空氣能量，克服阻力，完成輸送。3.空氣壓縮機作用：（1）消除壓縮空氣的脈動，使排氣均勻而連續(xù)。（2）使部分液滴在罐內沉降。（3）保溫滅菌。4.空氣儲罐5.壓縮空氣的冷卻高溫壓縮空氣直接通入空氣過濾器的后果：引起過濾介質的炭化或燃燒。增大反應罐的降溫負荷，給培養(yǎng)溫度的控制帶來困難。措施：管殼式換熱器、翹板式換熱器、

沉浸式換熱器、噴淋冷卻器來進行冷卻。6.壓縮空氣的除水除油壓縮空氣經冷卻會有水滴出，混在空氣中，如果使用活塞式空氣壓縮機，空氣中還混雜有油滴（油作潤滑作用），為了保證空氣過濾器的效能，必須除去空氣中的水分和油滴。

旋風分離器——利用離心