藥物色譜分離技術-色譜分離操作過程（制藥技術課件）

色譜分離技術--薄層色譜分離操作薄層色譜分離操作—色譜分離技術大綱1.薄層色譜法概念2.薄層色譜操作薄層色譜分離操作—色譜分離技術薄層色譜法（TLC）：將適宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或鋁基片上，成一均勻薄層。待點樣、展開后，根據(jù)比移值（Rf）與適宜的對照物按同法所得的色譜圖的比移值（Rf）作對比，用以進行藥品的鑒別、雜質檢查或含量測定的方法。

薄層色譜操作包括：制板、點樣、展開、顯色、Rf計算等。（一）薄層色譜法概念薄層色譜分離操作—色譜分離技術1.薄層板的制備

薄層板的薄層應盡可能的均勻而且厚度要固定。制備薄層板，首先將吸附劑調成糊狀：如稱取約3g硅膠G，加入到6-7mL0.5%的羧甲基纖維素鈉水溶液中，調成均勻的糊狀物。這一步一定要將吸附劑逐漸加入到溶劑中，邊加邊攪拌；如果把溶劑加到吸附劑中，容易產生結塊。然后采用簡單的平鋪法和傾斜法將糊狀物涂布在干凈的載玻片上，制成薄層板。（二）薄層色譜操作薄層色譜分離操作—色譜分離技術一般情況薄層越薄分離效果越好。鋪板的方法有兩種：(1)平鋪法：如圖所示，將自制涂布器洗凈，把干凈的載玻片在涂布器中擺好，上下兩邊各夾一塊比載玻片厚0.25mm的玻璃板，在涂布器槽中倒入糊狀物，將徐布器自左向右推，即可將糊狀物均勻地涂在玻璃板上。（二）薄層色譜操作薄層色譜分離操作—色譜分離技術(2)傾斜法

如沒有涂布器，則可將調好的糊狀物倒在載玻片上，用藥匙攤開后，用手搖晃并輕輕敲擊玻板背面，使其糊狀物均勻鋪開且表面均勻光滑。（二）薄層色譜操作薄層色譜分離操作—色譜分離技術涂好的薄層板室溫水平放置晾干后，放入烘箱內加熱活化，活化條件根據(jù)需要而定。硅膠板一般在烘箱中漸漸升溫，維持105-110℃活化30min。氧化鋁板在200-220℃烘4h可得活性Ⅱ級的薄板。150-160℃烘4h可得活性Ⅲ-Ⅳ級的薄板。（二）薄層色譜操作薄層色譜分離操作—色譜分離技術

薄層板的活性與含水量有關，其活性隨含水量的增加而下降。注意硅膠板活化時溫度不能過高，否則硅醇基會相互脫水而失活?；罨蟮谋討旁诟稍锲鲀缺４妗＃ǘ┍由V分離操作薄層色譜分離操作—色譜分離技術2.點樣點樣所用工具如圖所示。先用鉛筆在距薄層板一端1cm處輕輕劃一橫線作為基線，然后將樣品溶于低沸點溶劑配成的溶液，用毛細管點樣。在薄層色譜中，樣品的用量對物質的分離效果有很大影響，所需樣品的量與顯色劑的靈敏度、吸附劑的種類、薄層的厚度均有關系。（二）薄層色譜操作操作薄層色譜分離操作—色譜分離技術2.點樣

樣品太少，斑點不清楚，難以觀察；樣品量太多，往往出現(xiàn)斑點太大或拖尾現(xiàn)象，以至不易分開。若因樣品溶液太稀，可重復點樣，但應待前次點樣的溶劑揮發(fā)后方可重新點樣，樣點直徑一般以2-4mm為宜。同一薄層上的樣點直徑應一致。另外點樣要輕，不可刺破薄層。（二）薄層色譜操作操作薄層色譜分離操作—色譜分離技術3.展開

將薄層板放入適宜的展開缸內展開。展開劑液面不要超過薄層板的基線。薄層板的展開需要在密閉的色譜缸(也可用標本缸或廣口瓶等)中進行，如圖所示。用來展開樣品中各組分的溶劑(流動相)稱為展開劑。（二）薄層色譜操作薄層色譜分離操作—色譜分離技術3.展開

先將一定量展開劑放在色譜缸中，蓋上缸蓋，讓缸內溶劑蒸氣飽和5-10min。再將點好試樣的薄層板樣點一端朝下放入缸內(注意控制器皿中展開劑的量，切勿使樣點浸入展開劑中），蓋好缸蓋，展開劑因毛細管效應而沿薄層上升，樣品中組分隨展開劑在薄層中以不同的速度自下而上移動而導致分離。當展開劑前沿上升到樣點上方8-10cm時取出薄層板，放平，鉛筆標明溶劑前沿位置，冷風吹干溶劑。計算比移值。（二）薄層色譜操作薄層色譜分離操作—色譜分離技術化合物在薄板上移動距離的多少取決于所選取的溶劑不同。但凡溶劑的極性越大，對化合物的洗脫能力也越大，即Rf值也越大。一個好的溶劑體系應該使混合物中所有的化合物都離開基線，但并不使所有化合物都到達溶劑前端，Rf值最好在0.15～0.85之間。最理想的Rf值為0.4-0.5。（二）薄層色譜操作薄層色譜分離操作—色譜分離技術當一種溶劑不能很好地展開各組分時，常選擇用混合溶劑作為展開劑。合適的混合展開劑常需多次仔細選擇才能確定。

一些常用溶劑和它們的相對極性：（二）薄層色譜操作薄層色譜分離操作—色譜分離技術4.顯色展開的薄層板上化合物斑點本身有顏色時，可直接觀察。若化合物本身無色，可在紫外燈下觀察熒光斑點，也可用顯色劑顯色。簡單常用的顯色劑是碘蒸氣，廣口瓶中放置少量碘晶體，使用時將薄層板放入，蓋上瓶蓋，密封瓶內的碘蒸氣即可使大部分有機化合物顯色(飽和烴與鹵代烴除外)。（二）薄層色譜操作色譜分離技術--薄層色譜原理及特點薄層色譜原理及特點—色譜分離技術大綱1.薄層色譜原理2.薄層色譜特點薄層色譜原理及特點—色譜分離技術薄層色譜(簡稱TLC)，屬于固-液吸附色譜，是一種微量的分離分析方法，具有設備簡單、速度快、分離效果好、靈敏度高以及能使用腐蝕性顯色劑等優(yōu)點。適用于小量樣品的分離。薄層色譜是一種非常有用的跟蹤反應的手段，在進行化學反應時，常利用薄層色譜觀察原料斑點的逐步消失來判斷反應是否完成。

常用作柱色譜的先導，可用于柱色譜分離中展開劑的選擇，可監(jiān)視柱色譜分離狀況和效果。（一）薄層色譜原理薄層色譜原理及特點—色譜分離技術最常用的薄層色譜屬于液-固吸附色譜，把吸附劑(如氧化鋁、硅膠)和粘合劑(如煅石膏、羧甲基纖維素鈉等)均勻地鋪在一塊玻璃板上形成薄層，將分離樣品滴加在薄層的一端，當利用毛細作用使流動相沿著吸附劑薄層(固定相)移動時，吸附劑借各種分子間力(包括范德華力和氫鍵)作用于混合物中各組分，各組分以不同的作用強度被吸附。（一）薄層色譜原理薄層色譜原理及特點—色譜分離技術

被分離組分在固定相與流動相之間進行分配或吸附，經過反復無數(shù)次的分配平衡或吸附平衡，不同組分的極性化合物就會在薄層板上移動不同的距離。極性強的化合物會“粘”在極性的吸附劑上，在薄板上移動的距離比較短。而非極性的物質在薄層板上移動較大的距離。（一）薄層色譜原理薄層色譜原理及特點—色譜分離技術

化合物移動的距離大小用比移值（Rf值）表達，是介于0

1之間的數(shù)值。

比移值的定義為：組分遷移的距離與展開劑遷移的距離之比。

即：樣品原點到斑點中心的距離與樣品原點到溶劑前沿的距離之比。如圖所示。（一）薄層色譜原理薄層色譜原理及特點—色譜分離技術

薄層色譜常用的吸附劑或支持劑是硅膠或氧化鋁。

薄層色譜用的硅膠分為硅膠H不含粘合劑；

硅膠G含煅石膏做粘合劑；

硅膠HF-254含熒光物質，可在波長254nm紫外光下觀察熒光；

硅膠GF-254含有煅石膏和熒光劑。

薄層色譜用的氧化鋁也分為氧化鋁G、氧化鋁GF254及氧化鋁HF254。（一）薄層色譜原理薄層色譜原理及特點—色譜分離技術薄層色譜是紙色譜和柱色譜的結合，兼具二者的特點。①設備簡單，操作方便。只需一塊玻璃板和一個層析缸，即可進行復雜混合物的定性與定量分析及分離制備。其原理與經典柱色譜相同，但在敞開的薄層上操作，在檢查混合物的成分是否分開以及在顯色時都比較方便。（二）薄層色譜特點薄層色譜原理及特點—色譜分離技術②快速，展開時間短。薄層板比濾紙的毛細管作用大，因此展開速度快，薄層色譜一般只需十幾分鐘至幾十分鐘。③顯色方法選擇范圍寬。如對于無機物固定相，可采用腐蝕性的顯色劑。（二）薄層色譜特點薄層色譜原理及特點—色譜分離技術

④可以選用各種固定相。移動相也可廣泛選用，比紙色譜有顯著的靈活性。

⑤斑點比較密集，檢出靈敏度較高。

⑥可適用于大型制備色譜。如增加薄層厚度，可增大樣品的處理量。（二）薄層色譜特點薄層色譜原理及特點—色譜分離技術

⑦展開機理和方式多種多樣。

⑧可適用于熱不穩(wěn)定、難揮發(fā)藥物的分離，但不適用于揮發(fā)性藥物的分離。另外，對于成分太復雜的混合物，用薄層色譜法分離還是有困難的。（二）薄層色譜特點色譜分離技術--親和色譜的分離操作親和色譜的分離操作—色譜分離技術大綱1.操作條件的選擇2.操作方法親和色譜的分離操作—色譜分離技術吸附條件的選擇

吸附反應條件最好是自然狀態(tài)下，配體與目的分子之間反應的最佳條件；

注意控制流速，不能太快；

吸附時間的控制，延長時間可促進吸附；

進樣量的大小控制，減少進樣量，可提高吸附效果。1.操作條件的選擇親和色譜的分離操作—色譜分離技術（2）清洗條件的選擇。洗滌緩沖液的強度應介于目的分子吸附條件與目的分子洗脫條件之間。（3）洗脫條件的選擇。在實際操作過程中，應該在洗脫強度和耐受程度之間做好平衡。1.操作條件的選擇親和色譜的分離操作—色譜分離技術（1）樣品制備。一般地說，雜質的非特異性吸附量與其濃度、性質、載體材料、配基固定化方法以及流動相的離子強度、pH和溫度等因素有關。2.操作方法親和色譜的分離操作—色譜分離技術親和色譜樣品預處理的主要程序：①顆粒、細胞碎片、膜片段等的去除；②樣品的濃縮及除去蛋白酶或抑制劑。2.操作方法親和色譜的分離操作—色譜分離技術（2）配基與目的物結合條件的選擇

配基與目的物的特異性結合需要適宜的pH、緩沖液鹽濃度和離子強度。pH不僅能調節(jié)配基的電荷基團，也能調節(jié)目的物的電荷基團。中等鹽濃度的緩沖液，能穩(wěn)定溶液中蛋白質，并防止由于離子交換所引起的非特異性相互作用。2.操作方法親和色譜的分離操作—色譜分離技術（3）柱操作

柱的大小取決于吸附劑的容量和所需純化的蛋白質的量。一般地說，高的容量可以用于粗的短柱，大多數(shù)情況下，可以采用一次性的塑料小柱和1～5mL凝膠。2.操作方法親和色譜的分離操作—色譜分離技術（4）流速的控制

提高流速可提高分離速度，但柱效降低。因此，吸附操作要在適當?shù)牧鲃酉逻M行，既要保證高速度，又要保證高效率。為了使純化蛋白能夠得到好的洗脫峰、最小的稀釋度和最大的回收率，最好使用低流速。2.操作方法親和色譜的分離操作—色譜分離技術（5）清洗清洗過度會使目標產物的損失增多，而清洗不充分則使洗脫回收的目標產物純度降低。

具體操作是：樣品吸附在柱上之后，必須用幾倍體積的起始緩沖液對柱清洗以除去不結合的所有物質。2.操作方法親和色譜的分離操作—色譜分離技術（7）柱的再生具體操作是用幾倍體積的起始緩沖液進行再平衡，一般足以使親和柱再生，但一些未知的雜質往往仍結合在柱上，必須用苛刻的條件才能除去。應根據(jù)載體材料的不同、配基的性質以及它與載體連接方式的不同，酌情處理。2.操作方法色譜分離技術--親和吸附劑的制備親和吸附劑的制備—色譜分離技術大綱1.載體的選擇2.配基的選擇3.載體的活化與偶聯(lián)4.影響吸附劑親和力的因素親和吸附劑的制備—色譜分離技術

親和色譜是應用生物高分子物質能與相應專一配基分子可逆結合的原理，將配基通過共價鍵牢固地結合于固相載體上，制得親和吸附系統(tǒng)。生物分子上具有特定構象的結構域與配體的相應區(qū)域結合，具有高度的特異性和親和力。親和吸附劑的制備—色譜分離技術①載體必須具有較好的理化穩(wěn)定性和生物惰性，非專業(yè)吸附小。②具有大量可供活化和配基結合的化學基團，以供與配基共價連接之用。1.載體的選擇親和吸附劑的制備—色譜分離技術③具有高度的水不溶性和親水性。④具有稀松的網狀結構，使大分子能自由進入⑤載體要有良好的機械性能，顆粒均勻。1.載體的選擇親和吸附劑的制備—色譜分離技術常用的親和色譜載體主要有：多孔玻璃載體；聚丙稀酰胺載體；纖維素載體；葡聚糖凝膠載體；瓊脂糖凝膠；交聯(lián)瓊脂糖凝膠載體等。1.載體的選擇親和吸附劑的制備—色譜分離技術根據(jù)配基應用和性質，可將其分為兩類：特殊配基和通用配基。親和層析中常用的特殊配基有某一抗原的抗體、某一酶的專用抑制劑、某一激素的受體等。通用配基可適用于一類物質的分離提純，如用NADH作脫氫酶類親和層析的通用配基。2.配基的選擇親和吸附劑的制備—色譜分離技術配基選擇時應注意，所選配基應只能識別被純化的目的物(配體)；

配體與配基應該有足夠大的親和力；

配基與相應目的物之間的結合應具有可逆性；

配體具有足夠的穩(wěn)定性，能夠耐受反應條件以及清洗合再生等。另外，配基的分子大小必須合適。2.配基的選擇親和層析純化蛋白親和吸附劑的制備—色譜分離技術載體由于其相對的惰性，往往不能直接與配基連接，偶聯(lián)前一般需先活化，載體表面經過活化后，產生的活性基團可以在簡單的化學條件下，與配基上的氨基、羧基、羥基和醛基等功能基團，發(fā)生共價結合反應，這一過程稱為配基的鍵合。

載體表面的基團必須具有通用性和高效性，可以與上述配基上的常見基團發(fā)生簡單、快速的反應。3.載體的活化與偶聯(lián)親和吸附劑的制備—色譜分離技術①配基濃度對于親和力低的系統(tǒng)，為了取得較好的配體分離效果，必須提高載體上配基的有效濃度。②空間障礙在制備有些吸附劑時需要在載體與配基之間插入一段適當長度的多烴鏈“手臂”，以增加與載體相連的配基的活動度并減輕載體的立體障礙。4.影響吸附劑親和力的因素親和吸附劑的制備—色譜分離技術③配基與載體的結合位點在多肽或蛋白質等大分子作配基時，必須使它以最少的鍵與載體連接。④載體孔徑載體孔隙是配體向配基接近的運動通道，所以載體的孔徑大小對吸附劑的親和能力有決定性影響。4.影響吸附劑親和力的因素色譜分離技術--紙色譜紙色譜—色譜分離技術大綱1.紙色譜概念2.紙色譜操作紙色譜—色譜分離技術紙色譜是以濾紙為載體的分配色譜。

濾紙纖維一般能吸附25%～29%的水分，其中6%～7%的水分以氫鍵與纖維素結合。

紙色譜的固定相即為濾紙纖維及其結合水；

流動相則為有機溶劑；

依據(jù)混合物中各組分在水相和有機相中的溶解度（分配系數(shù)）的不同，而實現(xiàn)各組分的分離。（一）紙色譜概念紙色譜示意圖紙色譜—色譜分離技術（1）點樣

將混合液（或溶于適當溶劑的混合物）用玻璃毛細管或點樣器在濾紙上點樣。要求點樣點距紙底邊約2cm，每點間距約2cm，點的直徑一般小于0.5cm，也可點成3～5mm橫長條。（二）紙