實(shí)驗室血清學(xué)常用檢測方法

常用血清學(xué)檢測方法介紹一、酶聯(lián)免疫吸附試驗診斷技術(shù)目前，該項技術(shù)已在獸醫(yī)學(xué)上得到廣泛的應(yīng)用，大多數(shù)動物傳染病都已經(jīng)研制成ELISA檢測方法。1、酶聯(lián)免疫吸附試驗的原理ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度。2、ELISA的類型根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的情況以及檢測的具體條件，可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。用于動物疫病檢測的ELISA主要有以下幾種類型：①.雙抗體夾心法測抗原雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法。在臨床檢驗中，此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)、微生物病原體第二價或二價以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。例如豬瘟病毒檢測ELISA、禽流感病毒抗原捕獲ELISA，就是根據(jù)這種原理設(shè)計的。②.雙抗原夾心法測抗體反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測相應(yīng)的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體。乙肝HBs的檢測常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，需要根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于于間接法。此外，該方法不受被檢動物種屬差異的限制。③.間接法測抗體間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗體（抗免疫球蛋白抗體），檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體（見圖1）。操作步驟如下：（1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。（2）加稀釋的受檢血清，保溫反應(yīng)。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去。（3）加酶標(biāo)抗抗體可用酶標(biāo)抗人Ig以檢測總抗體，但一般多用酶標(biāo)抗人IgG檢測IgG抗體。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體抗體結(jié)合，從而間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量正相關(guān)。（4）加底物顯色本法主要用于對病原體抗體的檢測而進(jìn)行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法。間接法在動物疫病抗體檢測中應(yīng)用廣泛，例如禽流感的間接ELISA，用禽流感病毒NP蛋白包被成抗原板，待檢血清中的抗體與之結(jié)合，再加酶標(biāo)二抗反應(yīng)，可以檢測所有A型禽流感病毒抗體。④.競爭法測抗體當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競爭固相抗原。標(biāo)本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，因此陽性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。⑤.競爭法測抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和固相抗原共同競爭一定量的酶標(biāo)抗體。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體愈少，最后的顯色