實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)常用檢測(cè)方法

常用血清學(xué)檢測(cè)方法介紹一、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷技術(shù)目前，該項(xiàng)技術(shù)已在獸醫(yī)學(xué)上得到廣泛的應(yīng)用，大多數(shù)動(dòng)物傳染病都已經(jīng)研制成ELISA檢測(cè)方法。1、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開(kāi)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。2、ELISA的類型根據(jù)試劑的來(lái)源和標(biāo)本的情況以及檢測(cè)的具體條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。用于動(dòng)物疫病檢測(cè)的ELISA主要有以下幾種類型：①.雙抗體夾心法測(cè)抗原雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法。在臨床檢驗(yàn)中，此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)、微生物病原體第二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，但不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。例如豬瘟病毒檢測(cè)ELISA、禽流感病毒抗原捕獲ELISA，就是根據(jù)這種原理設(shè)計(jì)的。②.雙抗原夾心法測(cè)抗體反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測(cè)相應(yīng)的抗體。與間接法測(cè)抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體。乙肝HBs的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，需要根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于于間接法。此外，該方法不受被檢動(dòng)物種屬差異的限制。③.間接法測(cè)抗體間接法是檢測(cè)抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗體（抗免疫球蛋白抗體），檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體（見(jiàn)圖1）。操作步驟如下：（1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。（2）加稀釋的受檢血清，保溫反應(yīng)。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過(guò)程中被洗去。（3）加酶標(biāo)抗抗體可用酶標(biāo)抗人Ig以檢測(cè)總抗體，但一般多用酶標(biāo)抗人IgG檢測(cè)IgG抗體。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體抗體結(jié)合，從而間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量正相關(guān)。（4）加底物顯色本法主要用于對(duì)病原體抗體的檢測(cè)而進(jìn)行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。間接法在動(dòng)物疫病抗體檢測(cè)中應(yīng)用廣泛，例如禽流感的間接ELISA，用禽流感病毒NP蛋白包被成抗原板，待檢血清中的抗體與之結(jié)合，再加酶標(biāo)二抗反應(yīng)，可以檢測(cè)所有A型禽流感病毒抗體。④.競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體。其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)固相抗原。標(biāo)本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，因此陽(yáng)性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。⑤.競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和固相抗原共同競(jìng)爭(zhēng)一定量的酶標(biāo)抗體。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體愈少，最后的顯色