顯微物鏡數(shù)值孔徑圖像式測量方法

ICS31.260

CCSL50

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

GB/TXXXXX—XXXX

`

顯微物鏡數(shù)值孔徑圖像式測量方法

Imagemeasurementmethodfornumericalapertureofobjective

(點擊此處添加與國際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識)

（征求意見稿）

（本草案完成時間：2022.11）

在提交反饋意見時，請將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

GB/TXXXXX—XXXX

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。

本文件由中國科學(xué)院提出。

本文件由全國光電測試標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會（SAC/TC487）和全國光學(xué)和光子學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會

（SAC/TC103）歸口。

本文件起草單位：中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所、齊之明光電智能科技（蘇州）有限公

司、蘇州中科醫(yī)療器械產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司、蘇州市計量測試研究所、中國計量科學(xué)研究院、中國科學(xué)院

空天信息創(chuàng)新研究院、中國計量大學(xué)、寧波舜宇儀器有限公司、寧波永新光學(xué)股份有限公司。

本文件主要起草人：鞏巖、唐玉國、張艷微、郎松、黎俊、徐英瑩、王璞、張淑琴、胡森虎、崔志

英。

I

GB/TXXXXX—XXXX

顯微物鏡數(shù)值孔徑圖像式測量方法

1范圍

本文件描述了顯微物鏡數(shù)值孔徑圖像式測量方法的測試原理、測試環(huán)境、測試裝置、測試步驟以及

數(shù)據(jù)處理與分析。

本文件適用于數(shù)值孔徑名義值大于1.00的無限遠(yuǎn)校正顯微物鏡。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T26600—2011顯微鏡光學(xué)顯微術(shù)用浸液

JB/T8230.4—1997顯微鏡用蓋玻片

JJF1059.1—2012測量不確定度評定與表示

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

物鏡objective

物體成初次像的成像系統(tǒng)的第一部件。由透鏡、透鏡裝配件及相關(guān)部件組成，單獨或與鏡筒透鏡組

合使用。

[來源：GB/T27668.1—2011，3.105]

無限遠(yuǎn)校正物鏡infinity-correctedobjective

物體的初次像距校正在無限遠(yuǎn)，因而需用對應(yīng)鏡筒透鏡的物鏡。

[來源：GB/T27668.1—2011，3.105.3]

數(shù)值孔徑numericalaperture

NA

以nsinu表示，其中n為物鏡與物體之間介質(zhì)的折射率，u為物鏡孔徑角的一半。

[來源：GB/T27668.1—2011，3.10.4，有修改]

蓋玻片coverglass

用于覆蓋顯微標(biāo)本的矩形或圓形的薄玻璃片

注：因為蓋玻片的厚度、折射率和色散會影響計算和校正，所以設(shè)計時蓋玻片被看作是物鏡的一部分。其厚度、折

射率和色散的公差按JB/T8230.4—1997要求。

[來源：GB/T27668.1—2011，3.34]

1

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景深depthoffield

（在物空間）在像平面和物鏡的位置固定時，物平面前后的物體在像平面上仍能成清晰像的軸向空

間深度。

[來源：GB/T27668.1—2011，3.36]

焦距focallength

從物鏡的主平面到相應(yīng)的焦平面之間的沿軸距離。

[來源：GB/T27668.1—2011，3.60，有修改]

鏡筒透鏡tubelens

作為無限遠(yuǎn)校正物鏡的基本組件的中間透鏡。

[來源：GB/T27668.1—2011，3.86.10，有修改]

浸液immersionliquid

指定適用于浸沒物鏡與物體之間空間的液體，常用的有浸油、水或甘油。

注：因為在校正計算時，浸液被看作物鏡的一部分，因此對其折射率和色散（或阿貝常數(shù)）的要求是嚴(yán)格的。

[來源：GB/T27668.1—2011，3.77，有修改]

全反射圓直徑diameteroftotalreflectioncircle

物鏡數(shù)值孔徑測試圖像中圓環(huán)的內(nèi)圓直徑。

數(shù)值孔徑圓直徑diameterofnumericalaperturecircle

物鏡數(shù)值孔徑測試圖像中圓環(huán)的外圓直徑。

4測試原理

顯微物鏡數(shù)值孔徑圖像式測量方法見圖1，測量光光源發(fā)出的光經(jīng)過準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡組形成一束平行光，

該平行光經(jīng)分光棱鏡反射后進(jìn)入待測物鏡，再經(jīng)浸液后聚焦于蓋玻片下表面。蓋玻片下方為空氣，光線

由蓋玻片入射到空氣時，會發(fā)生反射和折射。將入射光線與蓋玻片法線之間的夾角定義為入射角?；?/p>

全反射原理，入射角大于全反射臨界角的光線將發(fā)生全反射，入射角小于臨界角的光線的將小部分反射

和大部分折射。經(jīng)蓋玻片下表面反射的光線再次經(jīng)待測物鏡形成一束邊緣強(qiáng)、中心弱的圓環(huán)形平行光束，

最后經(jīng)分光棱鏡到達(dá)圖像傳感器。

圖像傳感器接收到的圖像為一個中心亮度低、邊緣亮度高的圓環(huán)形圖案，稱為物鏡數(shù)值孔徑測試圖

像。中心亮度低的圓形區(qū)域是由入射角小于全反射臨界角的光線形成，邊緣亮度高的圓環(huán)部分由入射角

大于全反射臨界角的反射光線形成。

注1：在物鏡設(shè)計時，蓋玻片被看作是物鏡的一部分，其厚度、折射率和色散的公差按JB/T8230.4—1997要求，測試

時，需準(zhǔn)備滿足要求的蓋玻片。

注2：在物鏡設(shè)計時，浸液被看作是物鏡的一部分，其折射率、色散等特性按GB/T26600—2011要求，浸液常用的有

浸油、水或甘油。測試時，需根據(jù)待測物鏡要求準(zhǔn)備與之匹配的浸液。

2

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標(biāo)引序號說明：

1——LED光源；9——測量光光源；

2——聚光鏡；10——準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡組；

3——蓋玻片；11——入射角大于全反射臨界角的光線；

4——浸液；12——入射角小于全發(fā)射臨界角的光線；

5——待測物鏡；13——載物臺；

6——分光棱鏡；14——調(diào)焦機(jī)構(gòu)；

7——鏡筒透鏡；15——物鏡數(shù)值孔徑測試圖像。

8——圖像傳感器；

圖1數(shù)值孔徑圖像式測量方法

如圖1所示，當(dāng)待測物鏡出射的光線在蓋玻片與空氣界面發(fā)生全反射時，該光線在浸液和蓋玻片介

質(zhì)中的入射角滿足公式（1）。

?1sin(?1)=?2sin(?2)=1…….….……………..（1）

式中：

n1——浸液的折射率；

θ1——光線在浸液中的入射角，單位為度（°）；

n2——蓋玻片的折射率；

θ2——光線在蓋玻片與空氣界面處的全反射臨界角，單位為度（°）。

從待測物鏡出射的邊緣光線的入射角由待測數(shù)值孔徑?jīng)Q定，該光線在浸液和蓋玻片介質(zhì)中傳播，滿

足公式（2）。

?1sin(?1)=?2sin(?2)=??…..….……………..（2）

3

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式中：

α1——光線在浸液中的最大入射角，單位為度（°）；

α2——光線在蓋玻片中的最大入射角，單位為度（°）；

NA——待測物鏡的數(shù)值孔徑。

對于無限遠(yuǎn)校正物鏡，其全反射圓直徑與數(shù)值孔徑圓直徑分別由公式（3）和公式（4）計算得到。

?內(nèi)=2?1?osin(?1)…….….……………..（3）

?外=2?1?osin(?1)…….….……………..（4）

式中：

D內(nèi)——全反射圓直徑，單位為毫米（mm）；

??——待測物鏡的焦距，單位為毫米（mm）；

D外——數(shù)值孔徑圓直徑，單位為毫米（mm）。

聯(lián)立公式（1）（2）（3）（4），可得到待測物鏡的數(shù)值孔徑計算公式（5）為：

?

??=外….…………….…………….…………….（5）

?內(nèi)

5測試環(huán)境

測試在室內(nèi)進(jìn)行，環(huán)境條件應(yīng)滿足：

a)溫度：23℃±5℃；

b)相對濕度：20%~70%；

c)氣壓（海拔高度）：86kPa~106kPa。

6測試裝置

裝置組成

物鏡數(shù)值孔徑圖像式測試裝置見圖2，包括測量照明模塊、成像照明模塊、測試模塊、調(diào)焦模塊、

探測模塊及數(shù)據(jù)處理模塊。

圖2物鏡數(shù)值孔徑圖像式測試裝置示意圖

4

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測量照明模塊

由光源和準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡組構(gòu)成。該模塊輸出的測量光束應(yīng)滿足發(fā)散角小于0.4mrad，光束口徑大于待

測物鏡的出瞳，光斑光強(qiáng)分布均勻。

成像照明模塊

由LED光源和聚光鏡構(gòu)成，用于對待測物鏡進(jìn)行透射照明。

測試模塊

由分光棱鏡、浸液、蓋玻片構(gòu)成。分光棱鏡的反射與透射分光比為1:1，浸液及蓋玻片的選擇以待測

物鏡型號為準(zhǔn)，蓋玻片的一個表面應(yīng)標(biāo)記用于成像觀測的圖案。

調(diào)焦模塊

由調(diào)焦機(jī)構(gòu)和載物臺構(gòu)成，用于精確調(diào)節(jié)待測物鏡與蓋玻片之間的距離，調(diào)焦機(jī)構(gòu)分辨率應(yīng)優(yōu)于待

測物鏡景深的二分之一。

探測模塊

由鏡筒透鏡、圖像傳感器（CCD或CMOS）構(gòu)成。對焦時，鏡筒透鏡置于測試光路中，與待測物鏡

聯(lián)合使用，確保待測物鏡焦面與圖像傳感器探測面為共軛關(guān)系，通過透射照明，實現(xiàn)對蓋玻片下表面圖

案的清晰成像。物鏡測試時，需將鏡筒透鏡移出光路，圖像傳感器接收經(jīng)蓋玻片下表面反射回的光束，

得到物鏡數(shù)值孔徑測試圖像。圖像傳感器的探測尺寸應(yīng)大于待測物鏡出瞳，且分辨率優(yōu)于400像素400

像素，保證物鏡數(shù)值孔徑測試圖像被有效記錄。探測模塊對焦時的光路布局示意見圖3。

標(biāo)引序號說明：

1——LED光源；6——分光棱鏡；

2——聚光鏡；7——鏡筒透鏡；

3——蓋玻片；8——圖像傳感器；

5

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4——浸液；13——載物臺；

5——待測物鏡；14——調(diào)焦機(jī)構(gòu)。

圖3探測模塊對焦光路布局示意圖

數(shù)據(jù)處理模塊

對物鏡數(shù)值孔徑測試圖像進(jìn)行二值化處理，提取內(nèi)圓邊界和外圓邊界，最后計算數(shù)值孔徑圓直徑和

全反射圓直徑，計算方法見附錄A，最后根據(jù)公式（5）計算得到待測物鏡數(shù)值孔徑。

7測試步驟

物鏡數(shù)值孔徑測試步驟如下：

a)按照圖1搭建測試裝置；

b)測試前，將待測物鏡擦拭干凈，根據(jù)待測物鏡設(shè)計要求，準(zhǔn)備與之匹配的蓋玻片和浸液；

c)打開測試裝置電源和測試界面，將鏡筒透鏡置于測試光路中；

d)將待測物鏡安裝于測試裝置的物鏡接口上；

e)將蓋玻片固定在載物臺上，有標(biāo)記圖案的一面朝下；

f)待測物鏡與蓋玻片之間點入充分的浸液；

g)關(guān)閉測量照明光源，打開成像照明光源；

h)利用調(diào)焦機(jī)構(gòu)精密調(diào)節(jié)蓋玻片與待測物鏡之間的距離，直至圖像傳感器上觀測到蓋玻片下表

面圖案，且達(dá)到最清晰狀態(tài)；

i)保持蓋玻片與待測物鏡之間的距離不變，關(guān)閉成像照明光源，打開測量照明光源，將鏡筒透鏡

移出光路；

j)調(diào)節(jié)圖像傳感器曝光時間，使其觀測到的物鏡數(shù)值孔徑測試圖像無過度曝光；

k)保存物鏡數(shù)值孔徑測試圖像。

8數(shù)據(jù)處理

對物鏡數(shù)值孔徑測試圖像按以下步驟進(jìn)行處理：

a)利用數(shù)據(jù)處理模塊對采集的物鏡數(shù)值孔徑測試圖像進(jìn)行處理，最終得到數(shù)值孔徑圓直徑和全

反射圓直徑，具體方法見附錄A；

b)按照公式（5）計算得到待測物鏡數(shù)值孔徑，并記錄相關(guān)參數(shù)，記錄格式參見附錄B。

9不確定度分析

參考《JJF1059.1—2012測量不確定度評定與表示》，根據(jù)不確定度傳播律以及數(shù)值孔徑計算公式

（5）可知，其不確定度與數(shù)值孔徑圓直徑和全反射圓直徑有關(guān)，物鏡數(shù)值孔徑測試結(jié)果的合成標(biāo)準(zhǔn)不

確定度計按公式（6）計算：

22

??

????√?外?內(nèi)（）

???=NA(?????)+(?????).…………….……….………….6

?外?內(nèi)

式中：

6

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???——數(shù)值孔徑的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度；

??????——數(shù)值孔徑測試結(jié)果算術(shù)平均值；

數(shù)值孔徑圓直徑的不確定度，單位為像素數(shù)量；

??外——

?????

?外——數(shù)值孔徑圓直徑的算術(shù)平均值，單位為像素數(shù)量；

全反射圓直徑的不確定度，單位為像素數(shù)量；

??內(nèi)——

?????

?內(nèi)——全反射圓直徑的算術(shù)平均值，單位為像素數(shù)量。

不確定度評定方法分為A類和B類，其中，A類方法采用多次重復(fù)測試，B類方法主要分析儀器

的不確定度和測試時的估計誤差，一般情況下，后者遠(yuǎn)小于前者，可忽略不計。

數(shù)值孔徑圓直徑和全反射圓直徑的A類標(biāo)準(zhǔn)不確定度按公式（7）計算：

∑?(????)2

?=√?=1?……………….…...……….………….（7）

??(??1)

式中：

??——A類標(biāo)準(zhǔn)不確定度；

??——第i次測試結(jié)果；

N——測試次數(shù)；

??——N次測試結(jié)果的算術(shù)平均值。

由于測量次數(shù)有限，需要對A類標(biāo)準(zhǔn)不確定度進(jìn)行修正，修正因子??應(yīng)參照J(rèn)JF1059.1—2012中

附錄B確定取值。修正公式（8）為：

??=????…..….……….………….（8）

式中：

??——修正后的A類標(biāo)準(zhǔn)不確定度；

??——修正因子。

B類方法主要通過圓擬合精度分析數(shù)值孔徑圓直徑和全反射圓直徑的不確定度，經(jīng)過仿真分析與實

驗驗證，數(shù)值孔徑圓和全反射圓直徑的擬合精度約為5個像素?？紤]到擬合圓直徑可能值的分布為矩

形（均勻）分布，參照J(rèn)JF1059.1—2012中表3，置信因子?取值應(yīng)為√3。按照公式（9）可計算得到兩

者的B類標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

?

?=……………..….………...…….………….（9）

??

式中：

??——B類標(biāo)準(zhǔn)不確定度；

?——擬合圓直徑可能值的半寬度；

?——置信因子。

按照公式（10）分別計算得到全反射圓直徑和數(shù)值孔徑圓直徑的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

22

?=√??+??……………..….……….………….（10）

式中：

?——合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

將上述計算結(jié)果代入公式（6），即可計算得到物鏡數(shù)值孔徑測試結(jié)果的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度。附錄

C示例了NA1.49顯微物鏡數(shù)值孔徑測試結(jié)果的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度分析步驟和結(jié)果。

7

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A

A

附錄A

（規(guī)范性）

數(shù)值孔徑圓直徑和全反射圓直徑計算方法

對物鏡數(shù)值孔徑圖像式測試裝置中圖像傳感器采集到的物鏡數(shù)值孔徑測試圖像進(jìn)行處理，提取數(shù)

值孔徑圓和全反射圓的邊界，并根據(jù)邊界計算數(shù)值孔徑圓和全反射圓的直徑，計算步驟如下：

a)將數(shù)值孔徑測試圖像（見圖A.1）轉(zhuǎn)化為（x，y，灰度值）形式，x，y分別為圖像的橫向和縱

向像素點坐標(biāo)；

圖A.1物鏡數(shù)值孔徑測試圖像

b)利用最大類間方差算法計算數(shù)值孔徑測試圖像的二值化閾值，并利用該閾值對數(shù)值孔徑測試

圖像進(jìn)行二值化，二值化結(jié)果見圖A.2；

圖A.2物鏡數(shù)值孔徑測試圖像二值化結(jié)果

c)二值化后的圖像為一個圓環(huán)圖案，遍歷二值化圖像的所有像素，提取所有邊界像素點坐標(biāo)；

d)將邊界像素點分為外圓像素點合集（紅色像素點）和內(nèi)圓像素點合集（綠色像素點），見圖A.3，

其中外圓像素點合集為數(shù)值孔徑圓的邊界，內(nèi)圓像素點合集為全反射圓的邊界；

8

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圖A.3圓環(huán)邊界提取結(jié)果

e)根據(jù)數(shù)值孔徑測試圖像中數(shù)值孔徑圓的邊界像素點坐標(biāo)和全反射圓的邊界像素點坐標(biāo)，分別

進(jìn)行圓擬合，并計算得到擬合圓直徑，具體計算方法如下：

圓方程（A.1）為：

222

(xxcc)(yy)R.…….......…………..…………..（A.1）

式中：

x,y——坐標(biāo)系橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)，單位為像素；

xc,yc——圓心的橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)，單位為像素；

R——圓半徑，單位為像素數(shù)量。

定義輔助函數(shù)（A.2）：

222

g(x,y)=(x-xcc)+(y-y)-R......…..…….....….....…………..（A.2）

定義目標(biāo)損失函數(shù)定義為（A.3）：

N

（）2（）

fx,yg()xii,y....….......……….……..…………..A.3

i1

式中：

xi,yi——待擬合數(shù)據(jù)點的橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)，單位為像素；

N——待擬合數(shù)據(jù)點的個數(shù)。

使目標(biāo)損失函數(shù)達(dá)到最小值，即（A.4）：

9

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f

0

xc

f

0..........………………..…………..……..（A.4）

yc

f

0

R

按照公式（A.2）、（A.3）、（A.4）可計算得到擬合圓直徑，計算公式（A.5）如下：

N

22（）

D2(xi-xc)+(yi-yc)/N.............……….…………..A.5

i1

式中：

D——擬合圓直徑，單位為像素數(shù)量。

10

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B

B

附錄B

（資料性）

物鏡數(shù)值孔徑測試結(jié)果記錄表

物鏡數(shù)值孔徑測試記錄見表B.1。

表B.1物鏡數(shù)值孔徑測試結(jié)果記錄表

待測物鏡型號-編號數(shù)值孔徑設(shè)計值

制造商名稱制造商地址

測試環(huán)境溫度測試環(huán)境濕度

℃%

蓋玻片型號浸液型號

測試地點測試日期年月日

測試波長

測試人員

nm

算術(shù)平

測試次數(shù)12345678910

均值

數(shù)值孔徑圓直徑

像素數(shù)量

全反射圓直徑

像素數(shù)量

數(shù)值孔徑

11

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附錄C

（資料性）

NA1.49顯微物鏡數(shù)值孔徑測試不確定度分析

按照標(biāo)準(zhǔn)所述不確定度分析方法對NA1.49物鏡數(shù)值孔徑測試結(jié)果進(jìn)行不確定度分析，按所述測試

步驟對該物鏡進(jìn)行10次重復(fù)測試，測試結(jié)果見表C.1，不確定度分析步驟如下：

a)根據(jù)測試結(jié)果，計算得到數(shù)值孔徑圓直徑的算術(shù)平均值為471.02像素，全反射圓直徑的算術(shù)

平均值為315.86像素，數(shù)值孔徑測試結(jié)果的算術(shù)平均值為1.491；

b)利用A類評定方法，根據(jù)公式（7）和公式（8）計算得到數(shù)值孔徑圓直徑與全反射圓直徑修正

后的類標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：，，其中修正因子的取值為

A??_?外=2.106??_?內(nèi)=1.535??2.26

（測量次數(shù)為10，置信概率為0.95）；

c)利用B類評定方法，根據(jù)公式（9）計算得到數(shù)值孔徑圓直徑和全反射圓直徑的B類標(biāo)準(zhǔn)不確

定度為：，其中置信因子取值為；

??_?外=??_?內(nèi)=2.887?√3

d)根據(jù)公式（）計算數(shù)值孔徑圓直徑和全反射圓直徑的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：，

10??外=3.574

；

??內(nèi)=3.270

e)將上述計算結(jié)果代入公式（6），計算得到數(shù)值孔徑的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為???=0.019。

表C.1NA1.49顯微物鏡數(shù)值孔徑測試結(jié)果

數(shù)值孔徑圓直徑全反射圓直徑

測試次數(shù)數(shù)值孔徑

像素數(shù)量像素數(shù)量

1471.66313.841.503

2472.88312.611.513

3470.59312.991.504

4466.48318.031.467

5466.60316.841.473

6474.99314.801.509

7473.43315.941.498

8469.22317.931.476

9473.99317.581.492

10470.40318.001.479

12

GB/TXXXXX—XXXX

參考文獻(xiàn)

[1]GB/T27668.1—2011顯微術(shù)術(shù)語第1部分：光學(xué)顯微術(shù)

13

GB/TXXXXX—XXXX

目次

前言..................................................................................I

1范圍................................................................................1

2規(guī)范性引用文件......................................................................1

3術(shù)語和定義..........................................................................1

4測試原理............................................................................2

5測試環(huán)境............................................................................4

6測試裝置............................................................................4

裝置組成........................................................................4

測量照明模塊....................................................................5

成像照明模塊....................................................................5

測試模塊........................................................................5

調(diào)焦模塊........................................................................5

探測模塊........................................................................5

數(shù)據(jù)處理模塊....................................................................6

7測試步驟............................................................................6

8數(shù)據(jù)處理............................................................................6

9不確定度分析........................................................................6

附錄A（規(guī)范性）數(shù)值孔徑圓直徑和全反射圓直徑計算方法.................................8

附錄B（資料性）物鏡數(shù)值孔徑測試結(jié)果記錄表..........................................11

附錄C（資料性）NA1.49顯微物鏡數(shù)值孔徑測試不確定度分析.............................12

參考文獻(xiàn).............................................................................13

I

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顯微物鏡數(shù)值孔徑圖像式測量方法

1范圍

本文件描述了顯微物鏡數(shù)值孔徑圖像式測量方法的測試原理、測試環(huán)境、測試裝置、測試步驟以及

數(shù)據(jù)處理與分析。

本文件適用于數(shù)值孔徑名義值大于1.00的無限遠(yuǎn)校正顯微物鏡。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T26600—2011顯微鏡光學(xué)顯微術(shù)用浸液

JB/T8230.4—1997顯微鏡用蓋玻片

JJF1059.1—2012測量不確定度評定與表示

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

物鏡objective

物體成初次像的成像系統(tǒng)的第一部件。由透鏡、透鏡裝配件及相關(guān)部件組成，單獨或與鏡筒透鏡組

合使用。

[來源：GB/T27668.1—2011，3.105]

無限遠(yuǎn)校正物鏡infinity-correctedobjective

物體的初次像距校正在無限遠(yuǎn)，因而需用對應(yīng)鏡筒透鏡的物鏡。

[來源：GB/T27668.1—2011，3.105.3]

數(shù)值孔徑numericalaperture

NA

以nsinu表示，其中n為物鏡與物體之間介質(zhì)的折射率，u為物鏡孔徑角的一半。

[來源：GB/T27668.1—2011，3.10.4，有修改]

蓋玻片coverglass

用于覆蓋顯微標(biāo)本的矩形或圓形的薄玻璃片

注：因為蓋玻片的厚度、折射率和色散會影響計算和校正，所以設(shè)計時蓋玻片被看作是物鏡的一部分。其厚度、折

射率和色散的公差按JB/T8230.4—1997要求。

[來源：GB/T27668.1—2011，3.34]

1

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景深depthoffield

（在物空間）在像平面和物鏡的位置固定時，物平面前后的物體在像平面上仍能成清晰像的軸向空

間深度。

[來源：GB/T27668.1—2011，3.36]

焦距focallength

從物鏡的主平面到相應(yīng)的焦平面之間的沿軸距離。

[來源：GB/T27668.1—2011，3.60，有修改]

鏡筒透鏡tubelens

作為無限遠(yuǎn)校正物鏡的基本組件的中間透鏡。

[來源：GB/T27668.1—2011，3.86.10，有修改]

浸液immersionliquid

指定適用于浸沒物鏡與物體之間空間的液體，常用的有浸油、水或甘油。

注：因為在校正計算時，浸液被看作物鏡的一部分，因此對其折射率和色散（或阿貝常數(shù)）的要求是嚴(yán)格的。

[來源：GB/T27668.1—2011，3.77，有修改]

全反射圓直徑diameteroftotalreflectioncircle

物鏡數(shù)值孔徑測試圖像中圓環(huán)的內(nèi)圓直徑。

數(shù)值孔徑圓直徑diameterofnumericalaperturecircle

物鏡數(shù)值孔徑測試圖像中圓環(huán)的外圓直徑。

4測試原理

顯微物鏡數(shù)值孔徑圖像式測量方法見圖1，測量光光源發(fā)出的光經(jīng)過準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡組形成一束平行光，

該平行光經(jīng)分光棱鏡反射后進(jìn)入待測物鏡，再經(jīng)浸液后聚焦于蓋玻片下表面。蓋玻片下方為空氣，光線

由蓋玻片入射到空氣時，會發(fā)生反射和折射。將入射光線與蓋玻片法線之間的夾角定義為入射角?；?/p>

全反射原理，入射角大于全反射臨界角的光線將發(fā)生全反射，入射角小于臨界角的光線的將小部分反射

和大部分折射。經(jīng)蓋玻片下表面反射的光線再次經(jīng)待測物鏡形成一束邊緣強(qiáng)、中心弱的圓環(huán)形平行光束，

最后經(jīng)分光棱鏡到達(dá)圖像傳感器。

圖像傳感器接收到的圖像為一個中心亮度低、邊緣亮度高的圓環(huán)形圖案，稱為物鏡數(shù)值孔徑測試圖

像。中心亮度低的圓形區(qū)域是由入射角小于全反射臨界角的光線形成，邊緣亮度高的圓環(huán)部分由入射角

大于全反射臨界角的反射光線形成。

注1：在物鏡設(shè)計時，蓋玻片被看作是物鏡的一部分，其厚度、折射率和色散的公差按JB/T8230.4—1997要求，測試

時，需準(zhǔn)備滿足要求的蓋玻片。

注2：在物鏡設(shè)計時，浸液被看作是物鏡的一部分，其折射率、色散等特性按GB/T26600—2011要求，浸液常用的有

浸油、水或甘油。測試時，需根據(jù)待測物鏡要求準(zhǔn)備與之匹配的浸液。

2

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標(biāo)引序號說明：

1——LED光源；9——測量光光源；

2——聚光鏡；10——準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡組；

3——蓋玻片；11——入射角大于全反射臨界角的光線；

4——浸液；12——入射角小于全發(fā)射臨界角的光線；

5——待測物鏡；13——載物臺；

6——分光棱鏡；14——調(diào)焦機(jī)構(gòu)；

7——鏡筒透鏡；15——物鏡數(shù)值孔徑測試圖像。

8——圖像傳感器；

圖1數(shù)值孔徑圖像式測量方法

如圖1所示，當(dāng)待測物鏡出射的光線在蓋玻片與空氣界面發(fā)生全反射時，該光線在浸液和蓋玻片介

質(zhì)中的入射角滿足公式（1）。

?1sin(?1)=?2sin(?2)=1…….….……………..（1）

式中：

n1——浸液的折射率；

θ1——光線在浸液中的入射角，單位為度（°）；

n2——蓋玻片的折射率；

θ2——光線在蓋玻片與空氣界面處的全反射臨界角，單位為度（°）。

從待測物鏡出射的邊緣光線的入射角由待測數(shù)值孔徑?jīng)Q定，該光線在浸液和蓋玻片介質(zhì)中傳播，滿

足公式（2）。

?1sin(?1)=?2sin(?2)=??…..….……………..（2）

3

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式中：

α1——光線在浸液中的最大入射角，單位為度（°）；

α2——光線在蓋玻片中的最大入射角，單位為度（°）；

NA——待測物鏡的數(shù)值孔徑。

對于無限遠(yuǎn)校正物鏡，其全反射圓直徑與數(shù)值孔徑圓直徑分別由公式（3）和公式（4）計算得到。

?內(nèi)=2?1?osin(?1)…….….……………..（3）

?外=2?1?osin(?1)…….….……………..（4）

式中：

D內(nèi)——全反射圓直徑，單位為毫米（mm）；

??——待測物鏡的焦距，單位為毫米（mm）；

D外——數(shù)值孔徑圓直徑，單位為毫米（mm）。

聯(lián)立公式（1）（2）（3）（4），可得到待測物鏡的數(shù)值孔徑計算公式（5）為：

?

??=外….…………….…………….…………….（5）

?內(nèi)

5測試環(huán)境

測試在室內(nèi)進(jìn)行，環(huán)境條件應(yīng)滿足：

a)溫度：23℃±5℃；

b)相對濕度：20%~70%；

c)氣壓（海拔高度）：86kPa~106kPa。

6測試裝置

裝置組成

物鏡數(shù)值孔徑圖像式測試裝置見圖2，包括測量照明模塊、成像照明模塊、測試模塊、調(diào)焦模塊、

探測模塊及數(shù)據(jù)處理模塊。

圖2物鏡數(shù)值孔徑圖像式測試裝置示意圖

4

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測量照明模塊

由光源和準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡組構(gòu)成。該模塊輸出的測量光束應(yīng)滿足發(fā)散角小于0.4mrad，光束口徑大于待

測物鏡的出瞳，光斑光強(qiáng)分布均勻。

成像照明模塊

由LED光源和聚光鏡構(gòu)成，用于對待測物鏡進(jìn)行透射照明。

測試模塊

由分光棱鏡、浸液、蓋玻片構(gòu)成。分光棱鏡的反射與透射分光比為1:1，浸液及蓋玻片的選擇以待測

物鏡型號為準(zhǔn)，蓋玻片的一個表面應(yīng)標(biāo)記用于成像觀測的圖案。

調(diào)焦模塊

由調(diào)焦機(jī)構(gòu)和載物臺構(gòu)成，用于精確調(diào)節(jié)待測物鏡與蓋玻片之間的距離，調(diào)焦機(jī)構(gòu)分辨率應(yīng)優(yōu)于待

測物鏡景深的二分之一。

探測模塊

由鏡筒透鏡、圖像傳感器（CCD或CMOS）構(gòu)成。對焦時，鏡筒透鏡置于測試光路中，與待測物鏡

聯(lián)合使用，確保待測物鏡焦面與圖像傳感器探測面為共軛關(guān)系，通過透射照明，實現(xiàn)對蓋玻片下表面圖

案的清晰成像。物鏡測試時，需將鏡筒透鏡移出光路，圖像傳感器接收經(jīng)蓋玻片下表面反射回的光束，

得到物鏡數(shù)值孔徑測試圖像。圖像傳感器的探測尺寸應(yīng)大于待測物鏡出瞳，且分辨率優(yōu)于400像素400

像素，保證物鏡數(shù)值孔徑測試圖像被有效記錄。探測模塊對焦時的光路布局示意見圖3。

標(biāo)引序號說明：

1——LED光源；6——分光棱鏡；

2——聚光鏡；7——鏡筒透鏡；

3——蓋玻片；8——圖像傳感器；

5

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4——浸液；13——載物臺；

5——待測物鏡；14——調(diào)焦機(jī)構(gòu)。

圖3探測模塊對焦光路布局示意圖

數(shù)據(jù)處理模塊

對物鏡數(shù)值孔徑測試圖像進(jìn)行二值化處理，提取內(nèi)圓邊界和外圓邊界，最后計算數(shù)值孔徑圓直徑和

全反射圓直徑，計算方法見附錄A，最后根據(jù)公式（5）計算得到待測物鏡數(shù)值孔徑。

7測試步驟

物鏡數(shù)值孔徑測試步驟如下：

a)按照圖1搭建測試裝置；

b)測試前，將待測物鏡擦拭干凈，根據(jù)待測物鏡設(shè)計要求，準(zhǔn)備與之匹配的蓋玻片和浸液；

c)打開測試裝置電源和