GB∕T 43650-2024 野生動物及其制品DNA物種鑒定技術規(guī)程（正式版）

野生動物及其制品DNA物種鑒定技術規(guī)程2024-03-15發(fā)布2024-07-01實施國家標準化管理委員會I前言 l2規(guī)范性引用文件 13術語、定義和縮略語 13.1術語和定義 13.2縮略語 24樣品采集與儲存 24.1樣品采集 24.2抽樣 24.3取樣與儲存 24.4運輸 35DNA鑒定程序的構成 46DNA鑒定程序 46.1樣品前處理 4 56.3DNA純化 56.4DNA質(zhì)量評估 56.5檢測方法 67結果表述 8追溯方法 9污染預防與處理 10實驗室區(qū)域設置 11儀器和試劑要求 12實驗室清潔 13安全防護 14廢棄物處理 附錄A(資料性)電泳檢測程序 A.1常規(guī)電泳檢測法 A.2芯片電泳檢測法 A.3其他電泳檢測法 附錄B(資料性)通用引物序列信息 B.1Cytb基因通用引物 B.2COI基因通用引物 ⅡGB/T43650—2024B.312SrRNA基因通用引物 B.416SrRNA基因通用引物 附錄C(資料性)通用引物PCR反應體系與反應程序 C.1反應體系 C.2反應程序 附錄D(資料性)特異性PCR的引物、反應程序與反應體系 C.1高鼻羚羊(Saigatatarica)特異引物 C.2雪豹(Pantherauncia)特異引物 C.3豹(Pantherapardus)特異引物 C.4虎(Pantheratigris)特異引物 C.5黑熊(Ursusthibetanus)特異引物 附錄E(資料性)qPCR反應體系與反應程序 E.1反應體系 E.2反應程序 附錄F(資料性)dPCR反應體系與反應程序 F.1反應體系 F.2反應程序 參考文獻 Ⅲ本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由國家林業(yè)和草原局提出。本文件由全國野生動物保護管理與經(jīng)營利用標準化技術委員會(SAC/TC369)歸口。本文件起草單位：東北林業(yè)大學、東北林業(yè)大學司法鑒定所、深圳華大生命科學研究院、中國海關科學技術研究中心、黑龍江省公安廳、哈爾濱檢驗檢測認證集團有限公司、深圳華大法醫(yī)科技有限公司、廣東華大法醫(yī)物證司法鑒定所、黑龍江省野生動物研究所、華南動物物種環(huán)境損害司法鑒定中心、南寧海關技術中心、南京警察學院、合肥海關技術中心、廣西壯族自治區(qū)公安廳、東營市公安局。唐閎凱。1野生動物及其制品DNA物種鑒定技術規(guī)程1范圍本文件規(guī)定了對野生動物及其制品的來源進行DNA物種鑒定時樣品采集與儲存、DNA鑒定程序的構成、DNA鑒定程序、結果表述、追溯方法、污染預防與處理、實驗室區(qū)域設置等主要技術要求。本文件適用于野生動物及其制品來源物種的DNA檢驗鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T19495.2轉基因產(chǎn)品檢測實驗室技術要求GB/Z31233分立個體類產(chǎn)品隨機抽樣實施指南GB/T34796水溶液中核酸的濃度和純度檢測紫外分光光度法GA/T383法庭科學DNA實驗室檢驗規(guī)范LY/T2501野生動物及其產(chǎn)品的物種鑒定規(guī)范NY/T541—2016獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術規(guī)范3術語、定義和縮略語3.1術語和定義下列術語和定義適用于本文件。選定的標準區(qū)域的、用于物種鑒定的一段相對較短的保守DNA片段。DNA物種鑒定DNAspeciesidentification利用DNA檢驗技術對野生動物及其制品進行分類地位(科、屬、種)的判定。利用計算機算法和程序，確定兩個或多個核苷酸序列的相似性以至于同源性。人工合成的兩段互補寡核苷酸片段，一段與靶區(qū)域5'端DNA模板鏈互補；另一段與靶區(qū)域3'端DNA模板鏈互補。2熒光探針fluorescentprobe5'端和3'端分別標記熒光基團和淬滅基團，并與目的DNA序列堿基互補的一段DNA片段。下列縮略語適用于本文件。BOLD:生命條形碼數(shù)據(jù)系統(tǒng)(barcodeoflifedatasystem)Cytb:細胞色素b(cytochromeb)dPCR:數(shù)字PCR(digitalPCR)PCR:聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction)qPCR:實時熒光定量PCR(real-timefluorescencequantitativePCR)RFLP:限制性片段長度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism)4樣品采集與儲存4.2.1形態(tài)特征完整、可分類識別的同類多個檢材，按照GB/Z31233中的簡單隨機抽樣或等距抽樣規(guī)4.2.2具有部分形態(tài)特征、可簡單分類的多個檢材，先分類，再按照GB/Z31233中的簡單隨機抽樣或等距抽樣規(guī)定執(zhí)行；或按照GB/Z31233中的分層抽樣規(guī)定執(zhí)行。4.2.3不具有可識別的形態(tài)特征的大批量檢材，先按照GB/Z31233中的簡單隨機抽樣或等距抽樣規(guī)定執(zhí)行，結果出現(xiàn)多個物種時，再按照GB/Z31233中的分層抽樣規(guī)定執(zhí)行。物種的個體數(shù)量可按鑒定結果所占比例核算。昆蟲等小型無脊椎動物可整體取樣，取適量或整體粉碎，收集到離心管或密封袋等儲存介質(zhì)中，干應先去除易污染的表層，宜采取新鮮潔凈的組織或內(nèi)臟5mm3以上，收集到離心管或密封袋等儲取1cm2以上收集到離心管或密封袋等儲存介質(zhì)中，干燥常溫、冷藏或—20℃保存。3整體送檢或清洗后取不少于0.2g骨粉或牙粉(組織殘留時宜取組織),收集到離心管或密封袋等整體送檢或清洗后取不少于0.2g粉末等收集到離心管或密封袋等儲存介質(zhì)中，干燥常溫、冷藏收集1根以上置于離心管或密封袋等儲存介質(zhì)中，干燥常溫、冷藏或—20℃保存。4.3.6血液(血痕)宜選新鮮全血采集于EDTA抗凝管或采血卡。血痕宜用采樣拭子等采集?？鼓芎筒蓸邮米拥扔们鍧嵢萜骰蛎芊獯仁占?mL～5mL,密封，冷藏或一20℃保存。用消毒的鑷子或勺等取整顆或在表層和內(nèi)層各取不低于0.2g,收集到離心管或密封袋等儲存介質(zhì)唾液等用消毒的紗布、棉花或拭子等采集，晾干密封常溫保存；或者直接密封，冷藏或一20℃保存；收集足量其他分泌物到離心管或密封袋等儲存介質(zhì)中，冷藏保存，宜盡快于一20℃保存。注：分泌物是指由腺體和組織器官分泌的物質(zhì)。4.4.1樣品宜盡快送檢。干燥樣品常溫運輸，鮮軟組織等易腐敗的樣品應冷藏(特殊時干冰冷凍)運輸。4.4.2每個樣品應分別包裝，在樣本袋或容器外標記清楚，再將各樣品放到統(tǒng)一包裝袋或盒中。4.4.5疑似疫病(如禽流感等)動物樣品，應先消毒處理后，包裝按照NY/T541—2016中7.2的規(guī)定45DNA鑒定程序的構成DNA鑒定程序包括5個操作步驟，檢材無形態(tài)鑒別特征時，有4大類方法可選；檢材具有部分形態(tài)鑒別特征或理化鑒別指標等時，可與之結合進行綜合判斷，程序流程圖如圖1所示。1.1.樣品前處理(見6.1)2.DNA提取(見6.2)3.DNA純化(見6.3)4,DNA質(zhì)量評估(見6.4)具有部分形態(tài)鑒別特征等5.1PCR法(見6.5.1)5.2等溫擴增法(見6.5.2)5.5綜合判斷(見6.5.5)5.3基因組測序法(見6.5.3)5.4其他DNA方法(見6.5.4)5.檢測方法(見6.5)無形態(tài)鑒別特征圖1DNA鑒定程序流程圖6DNA鑒定程序6.1樣品前處理用75%乙醇或去離子水等清洗表面2次～3次，粉碎(必要時脫鈣)處理。新鮮皮張等去除表層，剪碎或研磨。干燥皮張等應先用75%乙醇或去離子水等清洗2次～3次，緩沖液浸泡去除表層，再剪碎或研磨。新鮮干凈組織直接剪碎或研磨。干燥組織應先用緩沖液浸泡、去除表層，再剪碎或研磨。5用75%乙醇、去離子水等充分清洗、剪碎。依據(jù)檢材類型和DNA物種鑒定目標，確定DNA提取方法，應設置空白對照并嚴防交叉污染。6.2.2苯酚氯仿提取法適用于組織、血液等樣品量充足的檢材，按照GA/T383的相關規(guī)定執(zhí)行。適用于組織、血液等樣品量充足，且需要大片段DNA進行全基因組測序的檢材。適用于組織、血液等樣品量充足的檢材，毛、羽等微量檢材以及糞便等檢材，應嚴格按照說明書操作。6.2.5磁珠法試劑盒適用于毛、羽等微量檢材以及糞便等檢材，應嚴格按照說明書操作。6.2.6全自動工作站法適用于大批量樣品，應嚴格按照儀器說明書操作。6.2.7其他提取方法使用等效DNA提取試劑盒，或驗證的新方法?？蛇x擇高質(zhì)量純化試劑盒或同行驗證的純化方法。6.4DNA質(zhì)量評估按照GB/T34796方法，測定DNA濃度，并判定DNA純度。評估DNA片段大小，判斷DNA完整性(見附錄A)。檢測樣品目標基因的Ct值，分析DNA含量。檢測與DNA結合熒光染料的熒光強度，定量目標DNA的濃度。66.5檢測方法應嚴格設置陰性對照(不加DNA的空白對照)與陽性對照(已知物種的DNA樣品，必要時)。確定目標區(qū)域(如DNA條形碼、Cytb基因等),選擇通用引物(見附錄B),按照反應體系和反應程序(見附錄C)進行PCR擴增，電泳檢測見附錄A,有擴增產(chǎn)物且與預期大小一致，則純化(按純化試劑盒操作)或直接測序(混合樣品克隆測序)。如無擴增產(chǎn)物，分析原因重新試驗。使用BLAST或CLUSTAL等軟件，將測序所得有效DNA序列與候選物種的標準序列進行序列比對，得到序列一致性結果；或在數(shù)據(jù)庫中進行序列比對，選取一致性最高的序列及其他近緣物種的同注：多個數(shù)據(jù)庫綜合比對，包括但不限于自建標準數(shù)據(jù)庫、國家動物核酸數(shù)據(jù)庫以及各專項數(shù)據(jù)庫、國際的BOLD和GenBank數(shù)據(jù)庫等，注意甄別其數(shù)據(jù)的正確性。具體結果判定如下：a)與單一物種一致性最高，且≥99%,判定與已知物種一致，判定該檢材“來源于×××(物種)”b)與兩個及以上物種一致性最高，且≥99%,應加測基因，或判定該檢材“來源于×××(物種)或×××(物種)……”或“檢出×××(物種)或×××(物種)DNA成分”;c)與單一物種一致性最高，且在90%～99%之間，應加測基因，如仍未達到99%,應謹慎判定；d)或進化樹中，位于同一單系分支且置信值達80%以上的物種即為檢材所屬物種，判定該檢材e)因為檢材質(zhì)量原因，未獲得有效DNA,或缺乏比對的標準序列，判定“無法判定”或"無法確定應嚴格設置陽性對照(已知物種的DNA樣品，即檢材疑似物種的DNA樣品)和陰性對照(近緣物種的DNA和以無菌去離子水代替DNA模板的空白對照)。選擇目標區(qū)域(如DNA條形碼、Cytb基因等),并選擇根據(jù)物種特異位點設計的物種特異性引物，確定反應體系和反應程序(見附錄D),進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物進行電泳檢測(見附錄A)。具體結果判定如下：7a)檢材與陽性對照有擴增產(chǎn)物，產(chǎn)物的大小與DNA分子量標準比對時與預期大小一致，且陰性對照無擴增產(chǎn)物，則表示結果陽性，判定該檢材“來源于×××(物種)”或“檢出×××(物種)DNA成分”。若存在疑問可測序驗證。b)陽性對照有擴增產(chǎn)物，且產(chǎn)物的大小與DNA分子量標準比對時與預期大小一致，檢材和陰性對照均無擴增產(chǎn)物；或者檢材擴增產(chǎn)物與預期大小不一致，則表示結果陰性，判定為“未檢出×××(物種)DNA成分”。陰性結果謹慎判別，可更換方法驗證。c)檢材、陽性對照和陰性對照均有擴增產(chǎn)物且產(chǎn)物的大小與DNA分子量標準比對時，與預期大小一致，則表示試驗污染，應分析原因，重新試驗。檢材、陽性對照和陰性對照均無擴增產(chǎn)d)因為檢材質(zhì)量原因無法獲得有效DNA,判定“無法判定”或“無法確定具體物種”。應嚴格設置陽性對照(已知物種的DNA樣品，即檢材疑似物種的DNA樣品)、陰性對照(非疑似物種的DNA)和空白對照(提取時設置的提取空白對照和以無菌去離子水代替DNA模板的PCR空白對根據(jù)選擇的目標區(qū)域(如DNA條形碼、Cytb基因等),選擇物種特異性引物和熒光探針，確定反應體系和反應程序(見附錄E),進行qPCR擴增。qPCR反應結束后，應設置無效基線范圍。基線范圍選擇在3個～15個循環(huán)，如果有強陽性樣本，應根據(jù)實際情況調(diào)整基線范圍。閾值設置原則以基線剛好超過正?？瞻讓φ諗U增曲線(無規(guī)則的噪聲線)的最高點，且Ct值不出現(xiàn)任何數(shù)值為準。以下條件有一條不滿足時，試驗視為無效，應重做qPCR擴增：a)提取空白對照無特異性擴增曲線；b)PCR空白對照無特異性擴增曲線；c)陰性對照無特異性擴增曲線；d)陽性對照Ct值<35。具體結果判定如下。a)待測樣品DNA物種特異性擴增的Ct值<35并有明顯擴增曲線，陽性對照、陰性對照和空白對照擴增正常(含內(nèi)參基因時，檢測結果也為陽性),判定該樣品“檢出×××(物種)DNA成b)待測樣品DNA物種特異性擴增的Ct值>40,陽性對照、陰性對照和空白對照擴增正常(含內(nèi)參基因時，檢測結果也為陽性),判定該樣品“未檢出×××(物種)DNA成分”。陰性結果謹慎判別，可更換方法驗證。c)待測樣品DNA成分的物種特異性擴增的Ct值介于35～40之間，陽性對照、陰性對照和空白對照擴增正常(含內(nèi)參基因時，檢測結果也為陽性),可加倍DNA模板量，重復試驗，如果Ct值減小并擁有明顯擴增曲線，陽性對照、陰性對照和空白對照依然擴增正常(含內(nèi)參基因時，檢8測結果也為陽性),判定該樣品“檢出×××DNA成分”。否則判為“未檢出×××(物種)d)陽性對照、陰性對照和空白對照皆陰性(含內(nèi)參基因時，檢測結果也為陰性),試驗無效。e)因為檢材質(zhì)量原因無法獲得有效DNA,判定“無法判定”或“無法確定具體物種”。根據(jù)選擇的目標區(qū)域(如DNA條形碼、Cytb基因等),選擇物種特異性引物和熒光探針，確定反應體系和反應程序(見附錄F),進行dPCR擴增。反應有熒光信號為陽性，無熒光信號為陰性，軟件記錄每個樣品的陽性和陰性數(shù)。正確度偏差不應超過標準值的25%,應符合數(shù)字PCR方法操作指南要求。具體結果判定如下：a)陽性對照、陰性對照和空白對照擴增正常，檢材陽性，判定該檢材“檢出×××(物種)DNA成分”或“來源于×××(物種)”。若存在疑問可b)陽性對照、陰性對照和空白對照擴增正常，檢材陰性，判定該檢材“未檢出×××DNA成分”。陰性結果謹慎判別，可測序驗證物種。c)因為檢材質(zhì)量原因無法獲得有效DNA,判定“無法判定”或“無法確定具體物種”。根據(jù)預判的物種范圍和選擇的目標基因，選擇物種特異性引物或通用引物，確定反應體系和反應程序(見附錄C),進行PCR擴增，電泳檢測，若擴增產(chǎn)物片段大小正確，則進行下一步酶切反應。根據(jù)特異位點選擇限制性內(nèi)切酶，按該酶說明書反應條件酶切。酶解產(chǎn)物進行電泳檢測，酶切片段數(shù)量和大小與目標物種預期一致，判定該檢材為“檢出×××(物疑問可更換方法驗證。因為檢材質(zhì)量原因無法獲得有效DNA,巢式PCR、溶解曲線法等PCR方法，以及公開發(fā)表在權威專業(yè)性期刊上的其他基于PCR的DNA物種鑒定方法，應經(jīng)專家組評估、驗證后使用。依據(jù)標準程序進行操作。96.5.2等溫擴增法環(huán)介導等溫擴增技術、重組酶聚合酶擴增技術和實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術等方法，應經(jīng)專家組評估、驗證后使用，依據(jù)方法驗證的標準程序進行操作。注：等溫擴增法是一類分子生物學技術的總稱，在某一特定的溫度下，擴大核酸的拷貝數(shù)。6.5.3基因組測序法DNA文庫要基于被行業(yè)內(nèi)廣泛認可的測序平臺的標準流程進行構建?；谖膸鞓嫿ǚ椒?，選擇使用合適的測序平臺進行全基因組測序。應嚴格把控測序質(zhì)量。測序質(zhì)量可以通過多種指標來評估，包括Q20、Q30和N區(qū)比例等。還應考慮測序深度和測序覆蓋度。一般測序深度宜大于5倍。注：全基因組測序是指對生物檢材進行整個基因組測序，包括長讀長測序和短讀長測序，用以獲得物種完整的基因組序列信息。合適基因組區(qū)域的確定待測樣本與其他物種進行序列的比較分析時(如構建系統(tǒng)進化樹等),應選取各物種中的同源區(qū)域。一般宜過濾掉性染色體區(qū)域以及基因區(qū)，選擇進化中性區(qū)域。全基因組物種鑒定分析選取疑似物種或其近緣物種的高質(zhì)量基因組作為參考基因組，將待測個體與其他候選物種的測序數(shù)據(jù)比對到參考基因組上，進行遺傳變異的檢測，篩選出高質(zhì)量SNP(單核苷酸多態(tài)性)位點，通過物種特異位點比較分析，或構建系統(tǒng)進化樹，完成鑒定分析。結果與目標物種預期相符，判定該檢材“檢出×××(物種)DNA成分”或“來源于×××物種”。否則，判定該檢材“未檢出×××(物種)DNA成分”或“非來源于×××物種”。因為檢材質(zhì)量原因無法獲芯片法以及利用新技術開發(fā)的DNA物種鑒定方法，經(jīng)同行專家組評估、驗證后，形成標準程序，可使用。6.5.5綜合判斷具有部分形態(tài)鑒別特征的檢材，上述DNA結果可以結合形態(tài)學特征綜合判斷；還可以結合地理分布、理化鑒別指標等綜合判斷。7結果表述7.2“×××”檢材“為×××(物種)×××(制品名稱)(結合形態(tài)或理化指標時)。7.3“×××”檢材“來源于×××(物種)或×××(物種)……”或“檢出×××(物種)或×××(物8追溯方法8.1標記方法在執(zhí)行4.3和6.1過程中，標記的內(nèi)容包括：樣品編號、取樣日期、樣品類型、其他。在執(zhí)行第6章其他過程中標記樣品編號。在執(zhí)行第6章所規(guī)定的程序過程中，記錄并保持以下內(nèi)容：執(zhí)行各程序的人員姓名、操作日期、執(zhí)行的操作內(nèi)容、操作的結果或觀察到的現(xiàn)象、其他。9污染預防與處理按照LY/T2501的相關規(guī)定執(zhí)行。10實驗室區(qū)域設置按照LY/T2501的相關規(guī)定執(zhí)行。11儀器和試劑要求按照LY/T2501的相關規(guī)定執(zhí)行。12實驗室清潔按照GB/T19495.2的相關規(guī)定執(zhí)行。13安全防護按照LY/T2501和GB/T19495.2的相關規(guī)定執(zhí)行。14廢棄物處理按照GB19489的相關規(guī)定執(zhí)行。(資料性)電泳檢測程序A.1.1試劑與儀器A.1.1.3核酸熒光染料。A.1.1.4瓊脂糖。A.1.1.6電泳儀器。A.1.1.7微量移液器。A.1.1.8紫外透射儀或凝膠成像系統(tǒng)。A.1.1.9微波爐。A.1.1.10電子天平。A.1.2.1配制瓊脂糖凝膠A.配制1×TAE緩沖液取50×TAE緩沖液20mL,加水至1000mL,配制成1×TAE稀釋緩沖液，待用。稱取1g瓊脂糖，置于200mL錐形瓶中，加入100mL1×TAE稀釋緩沖液，放入微波爐加熱至瓊脂糖全部溶化，取出搖勻，為1%瓊脂糖凝膠液。膠板制備步驟如下。a)將膠槽置于水平支持物上，插上樣品梳。b)瓊脂糖膠液冷卻至50℃~60℃,加入10μL核酸熒光染料(如SYBRGreen、SYBRGold等)溶液使其終濃度為1/10000(根據(jù)染料不同可調(diào)整),輕輕搖勻(也可取1μL～2μL染料工作液和5μL電泳樣品混勻靜置5min直接上樣)。慢慢地倒入膠槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層。檢查并排除氣泡。c)室溫下靜置30min～45min,待瓊脂糖溶液完全凝固，垂直拔出樣品梳，注意不要損傷梳底部凝膠；將凝膠放入電泳槽中。d)加入電泳緩沖液(1×TAE)至電泳槽中，使液面高于膠面。取9μL檢測樣品與1μL(1/10體積)的10×DNA上樣緩沖液混勻，用微量移液器小心加入樣品槽中。避免損壞凝膠或將樣品槽底部凝膠刺穿。A.1.2.3電泳接通電泳儀電源，按照需要調(diào)節(jié)電壓，電泳開始，觀察電流情況或電泳槽中負極的鉑金絲有氣泡出現(xiàn)。根據(jù)片段大小電泳15min～30min,關閉電源。取出凝膠，在波長為302nm(或365nm)紫外光下觀察。DNA存在處顯示出肉眼可辨的熒光條帶。觀察時應有防護，以免損傷眼睛。A.2芯片電泳檢測法按儀器說明書操作。A.3其他電泳檢測法按各透射儀的儀器說明書操作。(資料性)通用引物序列信息B.1Cytb基因通用引物mcb398:5'-TACCATGAGGACAAATATCATTCTG-3'mcb869:5'-CCTCCTAGTTTGTTAGGGATTGATCG-3PCR產(chǎn)物472bp,可擴增脊椎動物和無脊椎動物(Verma&.Singh,2003)。L14724:5'-GATATGAAAAACCATCGTTG-3'H15149:5'-CTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3'PCR產(chǎn)物約442bp,可擴增脊椎動物(Kocheretal.1989)。L14841:5'-AAAAAGCTTCCATCCAACATCTCAGCATGAAA-3'H15149:5'-CTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3'PCR產(chǎn)物約381bp,可擴增脊椎動物(Kocheretal.1989)。L14724:5'-GATATGAAAAACCATCGTTG-3'H15915:5'-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3'PCR產(chǎn)物約1140bp,可擴增脊椎動物(Xiaoetal.2001)。B.2COI基因通用引物LCO1490:5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'HCO2198:5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'PCR產(chǎn)物約750bp,可擴增脊椎動物和無脊椎動物(Folmeretal.1994)。FishF1:5'-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3'FishR1:5'-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3'PCR產(chǎn)物約710bp,可擴增魚類(Wardetal.2005)。B.312SrRNA基因通用引物L1091:5'-AAACTGGGATTAGATACCCCACTAT-3'H1478:5'-GAGGGTGACGGGCGGTGTGT-3'PCR產(chǎn)物440bp,可擴增脊椎動物(Kocheretal.1989;DelPeroetal.2000)。B.416SrRNA基因通用引物16SA:5'-GTGCAAAGGTAGCATAATCA-3'16SB:5'-TGTCCTGATCCAACATCGAG-3'GB/T43650—2024PCR產(chǎn)物約440bp,可擴增脊椎動物和無脊椎動物(Ramadan,2011)。16SAR:5'-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3'16SBR:5'-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3'PCR產(chǎn)物長約572bp,可擴增脊椎動物和無脊椎動物(Inoueetal.2001)。16S-F:5'-TRACTGTRCAAAGGTAGC-3'16S-R:5'-TTAATTCAACATCGAGGTC-3'J12888:5'-CCGGTCTGAACTCARATCATGTA-3'N13889:5'-ATTTATTGTACCTTKTGTATCAG-3'PCR產(chǎn)物1049bp,可擴增脊椎動物和無脊椎動物(Simonetal.2006)。注：根據(jù)發(fā)表文獻等公開信息進行驗證、補充引物。(資料性)通用引物PCR反應體系與反應程序C.1反應體系表C.1反應體系試劑加樣量(50μL反應體系)ddH?OTaqMix(2×)DNA注：預試驗反應體系減為20μL。C.2反應程序LCO1490/HCO2198:94℃/5min;(94℃/30s,45℃→50℃/30s,72℃/60s)6個循環(huán)；(94℃/30s,52℃/30s,FishF1/FishR1:L14724/H15149和L14841/H15149:L14724/H15915:C.2.416SrRNA基因(資料性)特異性PCR的引物、反應程序與反應體系D.1.1引物序列D.1.2反應程序D.1.3反應體系反應體系見表D.1。試劑加樣量(20μL反應體系)ddH?OTaqMix(2×)DNA注：變性溫度和退火、延伸時間根據(jù)不同的TaqMix做調(diào)整。如果調(diào)整退火溫度，需經(jīng)過試驗確認。D.2雪豹(Pantherauncia)特異引物D.2.1引物序列D.2.2反應程序94℃/5min;(94℃/30s,60℃/30s,72℃/30s)35個循環(huán)；72℃/5min。D.2.3反應體系D.3.1引物序列Ppo-CbF:5'-GTAAATTATGGCTGAATTATCCGG-3'Ppo-CbR:5'-CATAACCGTGAACAATAATAD.3.2反應程序Pta-CbF:5'-TTTGGCTCCTTACTAGGGGTG-3'Pta-CbR:5'-CCGTAAACAATAGCACAATCCCGATA-3'PCR產(chǎn)物271bp(Sugimotoetal,2006)。D.4.2反應程序94℃/5min;(94℃/30s,60℃/45s,72℃/45s)35個循環(huán)；72℃/5min。D.4.3反應體系D.5黑熊(Ursusthibetanus)特異引物D.5.1引物序列Ut172f:5'-GACGCGACTACAGCCTTTTC-3'Ut367r:5'-CTATGAATGCGGTGGCTATAAC-3'PCR產(chǎn)物約217bp(Peppinetal,2008)。D.5.2反應程序(資料性)qPCR反應體系與反應程序E.1反應體系滅菌去離子補足反應體系總體積至20μL。注1:qPCRmix使用等效品牌試劑。引物和熒光探針的使用量根據(jù)具體物種及靶基因進行優(yōu)化、調(diào)整和確認注2:每個樣品設置2個平行樣。E.2反應程序95℃/10min;95℃/10s,60℃/30s,(40個～50個)循環(huán)；60℃/min。循環(huán)在退火時收集熒光信號。注：不同儀器根據(jù)儀器要求，或根據(jù)不同物種鑒定方法調(diào)整循環(huán)參數(shù)。(資料性)dPCR反應體系與反應程序F.1反應體系20μL體系含2×ddPCRSupermixforpr物種特異熒光探針1μL、DNA模板10ng～100ng,無菌去離子水補足反應體系總體積至20μL。注：ddPCRSupermixforprobes,使用等效試劑。F.2反應程序95℃/3min;94℃/30s,(55℃~68℃)/30s,(40個～60個)循環(huán)。注：不同儀器根據(jù)儀器要求或不同物種鑒定方法調(diào)整參數(shù)。[1]陳浩峰.新一代基因組測序技術[M].北京：科學出版社，2016.[2]李金明.實時熒光PCR技術：第2版[M].北京：科學出版社，2016.[3]彭年才.數(shù)字PCR——原理、技術及應用[M].北京：科學出版社，2017.[4]彭濤.核酸等溫擴增技術及其應用[M].北京：科學出版社，2018.[5]王廷華，劉佳，夏慶杰.PCR理論與技術：第3版[M].北京：科學出版社，2013.[6]張曉璐，白素英，徐艷春.賽加羚羊的分子生物學鑒別[J].東北林業(yè)大學學報，2006,34(3):forPublicationofQuantitativeReal-TimePCRExperiments[J].ClinChem,55:611-622.fGeneticClassificationinBushBabies[J].IntJPrimatol,21:889-904.Biotechnol,3(5):294-299.SystemforAbsoluteQuantitationofDNACopyNumber[J].AnalChem,83:8604-8610.osteanphylogeny:Resolvinghigher-levelrelationshigenetEvol,20(2):275-285.[14]JaneckaJE,JacksonR,MunkhtsogB,[J].GigaScience,2019,8(10)[16]KocherTD,ThomasWK,MeyerA,e6196-6200.tionofDNA[J].Nucleicacidsres,28:E63-E63.sicidentificationofAsiaticbl[19]PinheiroLB,Colema1003-1011.[20]RamadanHA.2011.Sequenceofspecificmitochondrial16SrRNAgenefragmentfromEgyptianbuffaloisusedasapatternfordiscriminationbetweenriverbuffaloes,cattle,sheepandgoats[J].MolBiolRep,38(6):3929-3934.[21]SchulmeisterS.2003.SimultaneousanalysisofbasalHymen