(高清版)GBT 40135-2021 葡萄細菌性疫病菌檢疫鑒定方法

ICSCCS65.020.01GB/T40135—2021葡萄細菌性疫病菌檢疫鑒定方法DetectionandidentificationofXylophilusampelinus(Panagopoulos)國家市場監(jiān)督管理總局國家標準化管理委員會IGB/T40135—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由全國植物檢疫標準化技術(shù)委員會(SAC/TC271)提出并歸口。1GB/T40135—2021葡萄細菌性疫病菌檢疫鑒定方法1范圍本文件規(guī)定了葡萄細菌性疫病菌的分離培養(yǎng)、免疫學(xué)及分子生物學(xué)等檢測鑒定方法。本文件適用于葡萄及其繁殖材料中葡萄細菌性疫病菌的檢疫和鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法SN/T2122進出境植物及植物產(chǎn)品檢疫抽樣方法3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4葡萄細菌性疫病菌分類信息分類地位：細菌(Bacteria),真細菌(Eubacteria),變形菌門(Proteobacteria),變形菌綱(Betapro-teobacteria),伯克霍爾德氏菌目(Burkholderiales),叢毛單胞菌科(Comamonadaceae),嗜木質(zhì)菌屬(Xylophilus)其他信息見附錄A。5方法原理根據(jù)葡萄細菌性疫病菌與抗體之間特異性反應(yīng)，對待測物進行免疫學(xué)檢測；根據(jù)葡萄細菌性疫病菌的特異性DNA序列進行分子生物學(xué)檢測；根據(jù)葡萄細菌性疫病菌的培養(yǎng)性狀、生物學(xué)特性以及危害癥狀等對病原菌進行分離培養(yǎng)，必要時進行致病性檢測。6.1試劑和材料除有說明外，所有試驗用試劑均為分析純或生化試劑。2GB/T40135—2021試劑及其配制的信息見附錄B。盒等。6.2培養(yǎng)基YPGA培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA),培養(yǎng)基及其制備的信息見附錄C。分離培養(yǎng)基推薦用YPGA,也可用NA代替。7儀器和用具7.1儀器生物顯微鏡(放大倍數(shù)400倍以上)、恒溫培養(yǎng)箱、電子天平(千分之一)、植物光照培養(yǎng)箱、冰箱、離7.2用具8檢疫鑒定方法8.1現(xiàn)場取樣參照附錄A中的癥狀描述觀察藤莖(圖A.1)和葉片(圖A.2)是否有葡萄細菌性疫病菌的典型癥狀。對現(xiàn)場發(fā)現(xiàn)上述類似癥狀的植株進行取樣。果實和植株取樣方法按照SN/T2122。8.2樣品處理實驗室用水應(yīng)滿足GB/T6682要求。根據(jù)后續(xù)試驗的需求可選擇無菌水或不同的抽提緩沖液并做適當(dāng)?shù)南♂尅?.2.1有癥狀植物材料樣品中包括多個植物組織或多個樣品，應(yīng)選擇具有典型癥狀的植物組織分別分離病原菌。幼苗和a)幼苗和藤莖：取葡萄幼苗或藤莖，將表皮或其他腐爛組織去除后，用無菌刀具取病健交界維管束組織0.5cm～1cm數(shù)段放入3mL～5mL無菌水或無菌磷酸鹽緩沖液中靜置10min~也可取長約5cm的幼苗或藤莖用自來水沖洗后迅速浸入75%的酒精約1min,然后用無菌刀具將兩端部分及壞死的病變組織移除，再將剩余部分浸入75%的酒精后并使之燃燒(此部分僅適用于病原菌的分離)。待幼苗上的酒精燒盡后放入無菌塑料袋中，無菌塑料袋中按無菌水：植物組織=6:1比例加入無菌蒸餾水，并捶打擠壓幼苗。將此抽提液室溫下輕輕攪動放置40min～60min,或5℃靜置16h,1000g離心5min備用。b)葉片：用自來水清洗干凈樣品，再用75%的酒精表面消毒并迅速用無菌水漂洗。無菌刀具截取病健交界部位的葉脈和葉柄搗碎后置于無菌水或無菌磷酸緩沖液中，靜置10min～15min3GB/T40135—2021得到抽提液。從幼苗和藤莖、葉片中得到的抽提液應(yīng)即提即用。長期保存需在抽提液中加入無菌甘油(分析純),無菌甘油占總體積的20%～30%(體積分數(shù)),—20℃保存。無癥狀植物材料按照隨機抽取的原則，按照8.2.1中方法獲取抽提液。也可將藤莖切成1cm～2cm長的小段置于10mL～15mL無菌磷酸緩沖液中，或用50mL無菌注射器吸取收集藤莖汁液約2mL置于無菌磷酸緩沖液中備用。抽提液應(yīng)即提即用。長期保存需在抽提液中加入無菌甘油(分析純),無菌甘油占總體積的20%~30%(體積分數(shù)),—20℃保存。葡萄果實用自來水沖洗后迅速浸入75%的酒精約1min,無菌操作去皮后置于無菌培養(yǎng)皿或無菌均質(zhì)袋中，搗碎或均質(zhì)后取葡萄汁液作為抽提液備用。抽提液應(yīng)即提即用。長期保存需在抽提液中加入無菌甘油(分析純),無菌甘油占總體積的20%~30%(體積分數(shù)),—20℃保存。8.3免疫學(xué)檢測采用ELISA方法進行檢測，按照說明書進行操作及結(jié)果判定。8.4分子生物學(xué)檢測從8.2中得到的抽提液，按照附錄D中的D.1提取總DNA作為分子生物學(xué)檢測反應(yīng)模板。對于分離培養(yǎng)得到的疑似菌株，可直接作為分子生物學(xué)檢測反應(yīng)模板。根據(jù)實驗室條件，可選擇下列任一方法(8.4.2或8.4.3)進行檢測。8.4.2普通PCR和巢式PCR從抽提液或其他分離物中提取的DNA作為模板，進行普通PCR和巢式PCR檢測。檢測步驟和條件按照D.2進行。8.4.3實時熒光PCR從抽提液或其他分離物中提取的DNA作為模板，進行實時熒光PCR檢測。檢測步驟和條件按照D.3進行。8.5病原菌分離8.5.1有癥狀植物材料取8.2.1中得到的液體直接涂布于YPGA平板，每個樣品涂布5個～10個平皿。25℃下培養(yǎng)，從色，圓形，邊緣整齊規(guī)則，培養(yǎng)7d～12d后大小約2mm。必要時可對菌落進行一次純化培養(yǎng)。取8.2.2中得到的液體1.0mL,4GB/T40135—2021稀釋液用于YPGA平板涂布分離，每個稀釋度涂布5個～10個平皿。培養(yǎng)方法同8.5.1。8.6致病性檢測致病性實驗在盆栽易感菌葡萄藤莖或新扦插幼苗上進行。將在YPGA培養(yǎng)基上新鮮培養(yǎng)的疑似菌收集后用無菌水制成約1×10?CFU/mL的菌懸液，在幼苗藤莖上用無菌刀具切開2cm～4cm長并直達維管束深的新鮮傷口，將1滴～2滴菌懸液接種到傷口上，或葉片新鮮傷口上，用無菌水蘸濕的滅菌棉覆蓋傷口并用錫箔紙包扎，5個～10個重復(fù)。同法用葡萄細菌性疫病菌標準菌株做陽性對照，用無菌水做陰性對照，至少2個重復(fù)。接種后的葡萄幼苗置于20℃~27℃,日照時間為14h～18h、水分肥料充足的環(huán)境中培養(yǎng)3周～4周。致病性實驗也可在試管內(nèi)已生根的易感菌葡萄藤莖上進行，將在YPGA培養(yǎng)基上新鮮培養(yǎng)的疑似菌收集后用無菌水制成約1×10?CFU/mL的菌懸液，用無菌刀具將葡萄藤莖的最頂端切除后，將1滴菌懸液接種到傷口上，用無菌水蘸濕的滅菌棉覆蓋傷口并用錫箔紙包扎，5個～10個重復(fù)。同法用葡萄細菌性疫病菌標準菌株做陽性對照，用無菌水做陰性對照，至少2個重復(fù)。接種后的葡萄幼苗置于20℃~27℃,日照時間為14h～18h潮濕的環(huán)境中培養(yǎng)3周～4周。9結(jié)果判定9.1有典型癥狀的植物組織對樣品抽提液或疑似菌株按照8.3和8.4進行檢測，兩種方法檢測結(jié)果均為陽性的可判定為檢出葡萄細菌性疫病菌；兩種方法檢測結(jié)果均為陰性的可判定為未檢出葡萄細菌性疫病菌；檢測結(jié)果中只有一個結(jié)果為陽性的，進行病原菌分離，分離得到典型或疑似菌株，經(jīng)8.3或8.4任一方法(與初篩檢測出陽性結(jié)果不同的方法)進行檢測，結(jié)果為陽性的即判定為檢出葡萄細菌性疫病菌，未分離到典型或疑似菌株，或菌株鑒定結(jié)果為陰性的判定為未檢出葡萄細菌性疫病菌。9.2無典型癥狀的植物組織對樣品抽提液采用8.3和8.4方法進行檢測篩選，篩選結(jié)果有一個陽性結(jié)果或兩個均為陽性結(jié)果，進行病原菌分離，分離得到典型或疑似菌落按照8.3和8.4進行檢測，必要時結(jié)合致病性實驗結(jié)果，出現(xiàn)2個陽性結(jié)果則可判定檢出葡萄細菌性疫病菌；兩個均為陰性結(jié)果的可判定未檢出葡萄細菌性疫病菌；結(jié)果有一個陽性的，可采用8.4中與檢測出陽性結(jié)果不同的PCR方法或結(jié)合致病性實驗進行進一步鑒定，進一步鑒定結(jié)果為陰性的可判定未檢出葡萄細菌性疫病菌。按8.3和8.4方法篩選結(jié)果均為陰性的可判定未檢出葡萄細菌性疫病菌。未分離到典型或疑似菌落的，可判定出未檢出葡萄細菌性疫病菌。10樣品保存檢出葡萄細菌性疫病菌的樣品經(jīng)登記和經(jīng)手人簽字后妥善保存6個月以上。保存期滿后應(yīng)經(jīng)高壓滅菌后方可處理。11菌種保存分離并最終鑒定為葡萄細菌性疫病菌的菌株轉(zhuǎn)接到Y(jié)PGA培養(yǎng)基試管斜面上，登記和經(jīng)手人簽字后置于4℃冰箱中保存，30d轉(zhuǎn)接一次。也可將菌株凍干保存。5GB/T40135—2021(資料性)葡萄細菌性疫病菌A.1分布A.2寄主自然寄主：葡萄(VitisviniferaLinn.)是目前知道的其唯一宿主。A.3發(fā)病特征每年春季至6月在葡萄樹上就可以觀察到癥狀。12cm～30cm長的藤條上，下方2或3節(jié)常先發(fā)病，然后逐漸向上擴展。初期出現(xiàn)紅褐色的條斑，從藤條的莖部向頂端擴展，并逐漸發(fā)展成透鏡狀的開狀一樣。在葉上病菌經(jīng)由葉柄、維管束侵入葉片，葉片常?？菟?見圖A.2)。另外病菌由氣孔直接侵染葉片，這種侵染類型使葉片上產(chǎn)生紅褐色的角斑。病菌從氣孔侵染時，變成紅褐色。溫度較高時，病葉上可以看到淡黃色菌膿流出?；ㄊ艿礁腥竞?，成熟前變黑和枯死。病原菌也能侵染葡萄的根，無論是嫁接植株還是自身砧木上的植株，都會使枝梢生長減慢。葡萄細菌性疫病菌的生活周期至今沒有完全闡在潮濕的有風(fēng)的天氣就更容易傳播，然后在初夏季節(jié)擴散到其他新芽。病害發(fā)生需要溫暖、潮濕的條件。圖A.1葡萄細菌性疫病在葡萄嫩苗上的危害狀6GB/T40135—2021圖A.2葡萄細菌性疫病在葡萄葉片上的危害狀A(yù).4病菌生物學(xué)特性菌體桿狀、極端具1根鞭毛，大小0.4mm～0.8mm,革蘭氏陰性菌。在YPGA培養(yǎng)基上，菌落光滑不黏稠，黃色，圓形，邊緣整齊規(guī)則。在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上25℃條件下培養(yǎng)7d～12d,菌落最大直徑約2mm。A.5傳播方式病原菌可以很容易地通過修剪工具傳播，并主要通過修剪的傷口侵入健康組織。病菌可以在木材中存活，因此，可以通過帶病插條在各個溫室間傳播。噴灌則有利于病菌傳播。用來防治葡萄根瘤蚜的灌溉水也可能傳播病菌。病菌主要通過帶菌的繁殖材料進行遠距離傳播，自然的傳播僅局限于葡萄園內(nèi)及周圍區(qū)域。7GB/T40135—2021(資料性)B.1磷酸緩沖液(0.01mol/L)(PBS0.01mol/L)氯化鈉8.0g,十二水磷酸氫二鈉2.7g,二水磷酸二氫鈉0.4g,蒸餾水1000mL(pH7.2)。加熱煮沸后分裝。121℃滅菌15min備用。B.2TE緩沖液B.3TAE電泳緩沖液(pH8.5)(50×)Trisg冰乙酸57.1mLNa?EDTA·2H?O37.5g蒸餾水B.410%十二烷基硫酸鈉(SDS)g蒸餾水900mL加熱至68℃溶解，定容至10008GB/T40135—2021(資料性)將上述成分加入1000mL蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，分裝后121℃滅菌15min備用(pH6.5～7.0)。C.2NA培養(yǎng)基(pH7.3±0.1)。9GB/T40135—2021(規(guī)范性)葡萄細菌性疫病菌的分子生物學(xué)檢測方法D.1總DNA的提取將8.2的步驟得到的液體移至一干凈滅菌的離心管中，12000r/min離心15min,棄上清。在沉淀中加入TE緩沖液5mL,10%SDS溶液300μL,20mg/mL蛋白酶K30μL,混勻，37℃水浴孵育1h。加入等體積的三氯甲烷-異戊醇(24:1),混勻。10000r/min離心5min,將上清液移至一個新離心管中。加入等體積苯酚-三氯甲烷-異戊醇(25:24:1),混勻，10000r/min離心5min,將上清液移至一新離心管。加入0.6倍體積的異丙醇，輕輕混勻，10000r/min離心5min,棄上清，管中加入70%乙醇也可采用商業(yè)化植物基因組DNA提取試劑盒按照操作說明提取樣品總DNA,疑似菌落用細菌基因組DNA提取試劑盒操作說明提取總DNA,—20℃保存?zhèn)溆?。D.2普通PCR和巢式PCR檢測D.2.1普通PCR和巢式PCR引物信息普通PCR和巢式PCR引物序列見表D.1。表D.1普通PCR和巢式PCR引物信息PCR類型引物名稱引物序列PCR產(chǎn)物大小目標基因普通PCR5'-TGCGTAGTTCAACACCAAAGT-3ITS序列rrn基因5'-TATGACCCTCTTTCCACCAGC-3'巢式PCRXaA15'-AGTCGTAACAAGGTAAGCCG-3'5'-CYRYTGCCAAGCATCCACT-3′5'-GGTGTTAGGCCGAGTAGTGAG-35'-GGTCTTTCACCTGACGCGTTA-3'注：普通PCR引物信息來源Xylophilusampelinus2009OEPP/EPPO;巢式PCR引物信息來源：DetectionofD.2.2普通PCR和巢式PCR反應(yīng)體系檢測葡萄細菌性疫病菌的普通PCR和巢式PCR反應(yīng)體系見表D.2。表D.2檢測葡萄細菌性疫病菌的PCR反應(yīng)體系組成加樣體積普通PCR和巢式PCR第一輪巢式PCR第二輪2×PCRMix2×PCRMix正向引物(10pmol/μL)正向引物(10pmol/μL)GB/T40135—2021表D.2檢測葡萄細菌性疫病菌的PCR反應(yīng)體系(續(xù))組成加樣體積巢式PCR第二輪反向引物(10pmol/μL)反向引物(10pmol/μL)模板DNA(1ng/μL～10ng/μL)第一輪PCR產(chǎn)物(10～100倍稀釋)雙蒸水雙蒸水總體積總體積普通PCR:94℃預(yù)變性3min;94℃:30s,60℃:45s,72℃:45s,進行40個循環(huán)；72℃延伸5min;4℃保存。巢式PCR:第一輪(引物對XaA1、XaBl):94℃預(yù)變性3min;94℃:30s,56℃:60s,72℃:60s,進行30個循環(huán)；72℃延伸5min;4℃保存。巢式PCR:第二輪(引物對XaS3、XaS4):94℃預(yù)變性3min;94℃:30s,60℃:45s,72℃:45s,進行40個循環(huán)；72℃延伸5min;4℃保存。D.2.4普通PCR和巢式PCR擴增及產(chǎn)物分析D.2.4.1普通PCR用葡萄細菌性疫病菌標準菌株基因組DNA作為陽性對照，用不含有葡萄細菌性疫病菌的葡萄植物組織材料或其他植物病原菌基因組DNA為陰性對照，用雙蒸水作空白對照，進行PCR擴增。用TAE電泳緩沖液制備2%的瓊脂糖凝膠，按比例混勻電泳上樣緩沖液和PCR產(chǎn)物，將混有上樣緩沖液的PCR擴增產(chǎn)物加至樣品孔中，用DNAMaker作分子量的標記，進行電泳分析，電泳結(jié)束后，在凝膠成像分析儀下觀察是否擴增出預(yù)期的特異性DNA電泳帶，拍攝并記錄實驗結(jié)果。待測樣品擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果與陽性對照一致，陰性對照和空白對照未出現(xiàn)條帶，則判斷為陽性，未出現(xiàn)與陽性對照一致的條帶則判斷為陰性。D.2.4.2巢式PCR巢式PCR第一輪反應(yīng)：以抽提液中提取的DNA或疑似菌株作為模板，用葡萄細菌性疫病菌標準菌株基因組DNA作為陽性對照，用不含有葡萄細菌性疫病菌的葡萄植物組織材料或其他植物病原菌基因組DNA為陰性對照，用雙蒸水作空白對照，進行第一輪擴增和瓊脂糖電泳分析。電泳結(jié)果顯示，空白對照無擴增條帶，陽性對照出現(xiàn)特異性帶條，陰性對照和待測樣品均出現(xiàn)數(shù)條條帶。巢式PCR第二輪反應(yīng)：以第一輪擴增產(chǎn)物作為模板，進行第二輪擴增和瓊脂糖電泳分析。待測樣品擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果與陽性對照一致，陰性對照和空白對照未出現(xiàn)條帶，則判斷為陽性，未出現(xiàn)與陽性對照一致的條帶則判斷為陰性。D.3實時熒光PCR檢測D.3.1實時熒光PCR引物信息葡萄細菌性疫病菌實時熒光PCR檢測的引物和探針見表D.3。GB/T40135—2021表D.3實時熒光PCR引物和探針引物名稱引物探針序列PCR產(chǎn)物大小目標基因5'-CCCGATGATAAATACCGAAAACTC-3'5'-TGTCTTCTGGTTGTTTTGGTTTTAAT-3'5'-FAM-AGCGCCTGACGCAT-MGB-3注：實時熒光PCR引物和探針信息來源Xylophilusampelinus2009OEPP/EPPO。D.3.2實時熒光PCR反應(yīng)體系實時熒光PCR反應(yīng)體系見表D.4。每個樣品進行實時熒光PCR檢測時應(yīng)設(shè)置2個平行。表D.4實時熒光定性PCR反應(yīng)體系組成加樣體積2×PCRMix正向引物(10pmol/μL)反向引物(10pmol/μL)探針(10pmol/μL)模板DNA(1ng/μL～10ng/pL)雙蒸水總體積D.3.3實時熒光PCR反應(yīng)條件D.3.4實時熒光PCR結(jié)果判斷[1]Xylophilusampelinus2009OEPP/EPPO,Bulletin39,403-412.[2]T.Dreo,G.Seljak,J.D.Janse,I.VanderBeld,L.Tjou-Tam-Sin,P.Gorkink-Smits,M.Ravnikar.FirstlaboratoryconfirmationofXylophilusampelinusinSlovenia.2005,BulletinOEPP/EPPOBulletin35,149-155.[3]W.J.Botha,S.Serfontein,M.M.Greyling,D.K.Berger.DetectionofXylophilusampelinusingrapevinecuttingsusinganestedpolymerasechainreaction.PlantPathology(2001)50,515-526.[4]TsutomuKomatsu.NorioKondo.WinterhabitatofXylophilusampelinus,thecauseof