基因芯片課件

基因芯片目錄概述原理基本步驟制備方法應(yīng)用優(yōu)缺點(diǎn)展望一、概述

基因芯片（genechip,又稱DNA芯片，DNA微陣列），是生物芯片的代表。

背景：

隨著人類基因組計(jì)劃（

Humangenomeproject

）的逐步實(shí)施以及分子生物學(xué)相關(guān)學(xué)科的迅猛發(fā)展，越來(lái)越多的動(dòng)植物、微生物基因組序列得以測(cè)定，基因序列數(shù)據(jù)正在以前所未有的速度迅速增長(zhǎng)。然而,怎樣去研究如此眾多基因在生命過程中所擔(dān)負(fù)的功能就成了全世界生命科學(xué)工作者共同的課題。為此，建立新型雜交和測(cè)序方法以對(duì)大量的遺傳信息進(jìn)行高效、快速的檢測(cè)、分析就顯得格外重要了。

基因芯片技術(shù)就是順應(yīng)這一科學(xué)發(fā)展要求的產(chǎn)物。

概念：基因芯片技術(shù)是將大量已知序列的核酸片段有規(guī)律地固定在玻璃片、硅片、尼龍膜等各種固體支持物上形成分子陣列，然后與用熒光標(biāo)記過的核酸樣品進(jìn)行雜交，當(dāng)樣品與基因芯片上對(duì)應(yīng)位置的核酸探針發(fā)生互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，可以通過熒光強(qiáng)度來(lái)確定探針位置，獲得與探針互補(bǔ)的核酸序列，從而獲知樣品信息。分類

有機(jī)基因芯片載體基質(zhì)無(wú)機(jī)基因芯片

基因表達(dá)譜芯片使用功能測(cè)序芯片診斷芯片

高密度芯片探針數(shù)量中低密度芯片

二、原理

基因芯片的原理是將特定的已知核酸序列的cDNA片段或寡核甘酸片段有規(guī)律地固定在固相支撐物(硅片、陶瓷或玻璃片等)表面作為基因探針，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，與用熒光或放射性同位素標(biāo)記過的DNA或RNA樣品進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)系統(tǒng)的雜交信號(hào)進(jìn)行分析，可以高效快速地檢測(cè)靶基因的存在量及其變異性。根據(jù)需要制備探針利用基因探針到基因混合物中識(shí)別特定基因。固定于支持物上的探針,與標(biāo)記樣品的堿基不互補(bǔ)則探針與樣品不能進(jìn)行雜交通過檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱進(jìn)而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。正常

高表達(dá)

低表達(dá)通過檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度及分布來(lái)進(jìn)行分析從而得到基因的表達(dá)水平檢測(cè)原理以及相關(guān)工具

由于DNA芯片本身的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，需要確定雜交信號(hào)在芯片上的位置，尤其是大規(guī)模DNA芯片由于其面積小，密度大，點(diǎn)樣量很少，所以雜交信號(hào)較弱，需要使用光電倍增管或冷卻的電荷偶連照相機(jī)(charged-coupleddevicecamera，CCD)攝像機(jī)等弱光信號(hào)探測(cè)裝置。

此外，大多數(shù)DNA芯片雜交信號(hào)譜型除了分布位點(diǎn)以外還需要確定每一點(diǎn)上的信號(hào)強(qiáng)度，以確定是完全雜交還是不完全雜交，因而探測(cè)方法的靈敏度及線性響應(yīng)也是非常重要的。工具有：

（1）激光掃描熒光顯微鏡：氬離子激光器，分辨率高，圖像質(zhì)量好；

（2）激光掃描共焦顯微鏡：共焦技術(shù)，靈敏度和分辨率較高，掃描時(shí)間長(zhǎng)，比較適合研究用。現(xiàn)在Affymetrix公司已推出商業(yè)化樣機(jī)，整套系統(tǒng)約12萬(wàn)美元；

（3）采用了CCD相機(jī)的熒光顯微鏡：掃描時(shí)間短，靈敏度和分辨率較低，比較適合臨床診斷用；

（4）傳感器：實(shí)時(shí)檢測(cè)DNA微陣列雜交情況而且具有較高的靈敏度，但由于光纖維束所含光纖數(shù)目有限，因而不便于制備大規(guī)模DNA芯片。標(biāo)記物主要有：熒光標(biāo)記物（最常用）和生物素標(biāo)記物熒光標(biāo)記雜交信號(hào)的檢測(cè)方法熒光顯微鏡可以選擇性地激發(fā)和探測(cè)樣品中的混合熒光標(biāo)記物，并具有很好的空間分辨率和熱分辨率，特別是當(dāng)熒光顯微鏡中使用了共焦激光掃描時(shí)，分辨能力在實(shí)際應(yīng)用中可接近由數(shù)值孔徑和光波長(zhǎng)決定的空間分辨率，而在傳統(tǒng)的顯微鏡是很難做到的，這便為DNA芯片進(jìn)一步微型化提供了重要的檢測(cè)方法的基礎(chǔ)。

生物素標(biāo)記方法中的雜交信號(hào)探測(cè)以生物素（biotin）標(biāo)記樣品的方法由來(lái)已久，通常都要聯(lián)合使用其它大分子與抗生物素的結(jié)合物（如結(jié)合化學(xué)發(fā)光底物酶、熒光素等），再利用所結(jié)合大分子的特殊性質(zhì)得到最初的雜交信號(hào)，由于所選用的與抗生物素結(jié)合的分子種類繁多，因而檢測(cè)方法也更趨多樣化。特別是如果采用尼龍膜作為固相支持物，直接以熒光標(biāo)記的探針用于DNA芯片雜交將受到很大的限制，因?yàn)樵谀猃埬ど蠠晒鈽?biāo)記信號(hào)信噪比較低。因而使用尼龍膜作為固相支持物的這些研究者大多是采用生物素標(biāo)記的。三、基本步驟

生物芯片是將生命科學(xué)研究中所涉及的不連續(xù)的分析過程(如樣品制備、化學(xué)反應(yīng)和分析檢測(cè))，利用微電子、微機(jī)械、化學(xué)、物理技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微流體分析單元和系統(tǒng)，使之連續(xù)化、集成化、微型化。生物芯片技術(shù)主要包括四個(gè)基本要點(diǎn)：芯片方陣的構(gòu)建、樣品的制備、生物分子反應(yīng)和信號(hào)的檢測(cè)。1、芯片準(zhǔn)備：先將玻璃片或硅片進(jìn)行表面處理，然后使DNA片段或蛋白質(zhì)分子按順序排列在芯片上。（芯片的制備除了用到微加工工藝外，還需要使用機(jī)器人技術(shù)。以便能快速、準(zhǔn)確地將探針放置到芯片上的指定位置。）2、樣品制備：生物樣品往往是復(fù)雜的生物分子混合體，除少數(shù)特殊樣品外，一般不能直接與芯片反應(yīng)，有時(shí)樣品的量很小。所以，必須將樣品進(jìn)行提取、擴(kuò)增，獲取其中的蛋白質(zhì)或DNA、RNA，然后用熒光標(biāo)記，以提高檢測(cè)的靈敏度和使用者的安全性。3、雜交反應(yīng)：雜交反應(yīng)是熒光標(biāo)記的樣品與芯片上的探針進(jìn)行的反應(yīng)產(chǎn)生一系列信息的過程。選擇合適的反應(yīng)條件能使生物分子間反應(yīng)處于最佳狀況中，減少生物分子之間的錯(cuò)配率。4、芯片信號(hào)檢測(cè)：雜交反應(yīng)后的芯片上各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)的熒光位置、熒光強(qiáng)弱經(jīng)過芯片掃描儀和相關(guān)軟件可以分析圖像，將熒光轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)，即可以獲得有關(guān)生物信息。

基因芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標(biāo)是將從樣品制備、雜交反應(yīng)到信號(hào)檢測(cè)的整個(gè)分析過程集成化以獲得微型全分析系統(tǒng)（micrototalanalyticalsystem）或稱縮微芯片實(shí)驗(yàn)室（laboratoryonachip）。使用縮微芯片實(shí)驗(yàn)室，就可以在一個(gè)封閉的系統(tǒng)內(nèi)以很短的時(shí)間完成從原始樣品到獲取所需分析結(jié)果的全套操作。四、基因芯片的制備

有原位合成法和直接點(diǎn)樣法兩種，原位合成法一般用于制備基因芯片，直接點(diǎn)樣法既可以用于制備基因芯片也可以用于制備蛋白質(zhì)芯片。1、原位合成法，是指將數(shù)量眾多的電極固定在固相支持物上，電極上具有生物親和性的多孔空間，用于合成DNA片段所需的4種單核苷酸可以進(jìn)入電極上的多孔空間，在電極上合成DNA片段，原位合成法又可分為光導(dǎo)原位合成法與原位噴印合成法。（1）光導(dǎo)原位合成法

光導(dǎo)原位合成法是由美國(guó)昂飛公司研發(fā)的，利用光敏保護(hù)基將堿基單體的5‘端羥基保護(hù)起來(lái)，之后固相支持物上的光敏保護(hù)基與1個(gè)核苷酸單體連接，如此循環(huán)直到合成完成。光導(dǎo)原位合成法制備探針之間的距離為5~10μm，1㎝2可以容納106個(gè)探針，這種方法的優(yōu)點(diǎn)是步驟簡(jiǎn)單、合成速度快且合成探針量大，缺點(diǎn)是合成的探針長(zhǎng)度不是很長(zhǎng)。（2）原位噴印合成法

噴印合成法原理與傳統(tǒng)的DNA固相合成原理一致，形式類似于噴墨打印，有多個(gè)噴印頭及墨盒，墨盒里面裝有4種堿基的液體。噴印頭可以在整個(gè)載體上任意移動(dòng)，根據(jù)載體上不同位點(diǎn)探針的序列要求將特定的堿基噴印在特定的位置。2、直接點(diǎn)樣法，是指將人工合成的寡核苷酸片段直接點(diǎn)在固相支持物上。

直接點(diǎn)樣是將合成好的探針、cDNA、基因組DNA片段通過人工或高速點(diǎn)樣器直接點(diǎn)在固相支持物上。根據(jù)點(diǎn)樣方式不同可將直接點(diǎn)樣法分為接觸點(diǎn)樣、非接觸點(diǎn)樣。對(duì)于直接點(diǎn)樣法來(lái)說，點(diǎn)樣器的好壞直接決定了基因芯片的探針密度及結(jié)合強(qiáng)度，點(diǎn)樣裝置質(zhì)量的衡量指標(biāo)有點(diǎn)樣速度、點(diǎn)樣穩(wěn)定性、點(diǎn)樣密度等。五、基因芯片的應(yīng)用

在實(shí)際應(yīng)用方面，生物芯片技術(shù)可廣泛應(yīng)用于疾病診斷和治療、藥物篩選、農(nóng)作物的優(yōu)育優(yōu)選、司法鑒定、食品衛(wèi)生監(jiān)督、環(huán)境檢測(cè)、國(guó)防、航天等許多領(lǐng)域。它將為人類認(rèn)識(shí)生命的起源、遺傳、發(fā)育與進(jìn)化、為人類疾病的診斷、治療和防治開辟全新的途徑，為生物大分子的全新設(shè)計(jì)和藥物開發(fā)中先導(dǎo)化合物的快速篩選和藥物基因組學(xué)研究提供技術(shù)支撐平臺(tái)。丁香通上關(guān)于基因芯片的應(yīng)用：/experiment/430/586/587/1_index.htmAffymetrix的芯片基因表達(dá)芯片：GeneChipHumanTranscriptomeArray2.0全轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)芯片（HTA2.0）基因分型芯片：AxiomHumanOrigins基因分型芯片Axiom中國(guó)人基因分型芯片細(xì)胞遺傳學(xué)芯片：CytoScanHD細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)芯片Affymetrix是基因芯片技術(shù)的先驅(qū)和基因組學(xué)研究領(lǐng)域的領(lǐng)導(dǎo)者，致力于研發(fā)并提供能夠在細(xì)胞、蛋白和基因水平對(duì)生物系統(tǒng)進(jìn)行多重和平行分析的創(chuàng)新技術(shù)，同時(shí)致力于促進(jìn)研究成果的轉(zhuǎn)化，創(chuàng)造更美好的生活。/

OncoScan芯片

Affymetrix全新的OncoScan芯片利用獨(dú)特的分子倒置探針（MolecularInversionProbe,MIP）技術(shù)，能夠快速經(jīng)濟(jì)地分析來(lái)自福爾馬林固定石蠟包埋(Formalin-fixedParaffin-embedded,FFPE)樣本的少量的高度降解的DNA，讓實(shí)體瘤癌癥分析向前邁進(jìn)了一大步。

基因芯片在生物研究中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在：1、基因表達(dá)分析2、DNA測(cè)序3、發(fā)現(xiàn)新基因4、病原檢測(cè)5、繪制圖譜1、基因表達(dá)分析

通過基因芯片檢測(cè)生物不同發(fā)育階段或病原體不同致病階段的基因表達(dá)情況，可以研究基因的功能及病原的致病機(jī)理。

Girke等運(yùn)用基因芯片對(duì)擬南芥種子發(fā)育過程進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)通過基因芯片篩選到的擬南芥2600個(gè)基因中,有25％的基因在種子中的表達(dá)量是葉子及根的2倍。zhou等制備了水稻基因組表達(dá)芯片，經(jīng)過低能N+光束處理后，每30個(gè)與組蛋白相關(guān)的基因中有1個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，每38個(gè)溴結(jié)構(gòu)域蛋白基因中有1個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，1個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。luan等制備了包含有13319個(gè)探針的雞基因芯片，在2周齡小雞感染沙門氏病菌前后，檢測(cè)到了588個(gè)差異表達(dá)基因，其中276個(gè)是已知功能基因，并且通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定驗(yàn)證了4個(gè)基因。2、DNA測(cè)序

利用基因芯片進(jìn)行DNA測(cè)序過程如下:：將包含已知核酸探針的DNA芯片與待測(cè)的DNA樣品進(jìn)行分子雜交，在DNA芯片表面可檢測(cè)到熒光信號(hào)，通過分析形成的圖譜獲知樣品序列。對(duì)已知序列進(jìn)行重測(cè)序是DNA芯片的主要應(yīng)用之一，重測(cè)序指的是某種群或物種完成基因組測(cè)序后，對(duì)個(gè)體或群體的差異性分析，需要進(jìn)行再測(cè)序。

DNA芯片測(cè)序具有快速、高效等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊，主要測(cè)序方法有：

SBH：sequencingbyhybridizationCSH：con-tigousstackinghybridizationCSH技術(shù)測(cè)序的長(zhǎng)度大于SBH測(cè)序的長(zhǎng)度

在測(cè)定植物與病原物基因組突變等方面，基因芯片是強(qiáng)有力的工具。

參照已知基因序列，在載體上合成大量寡核苷酸探針，與待測(cè)樣品進(jìn)行雜交，兩者匹配程度越高，雜交信號(hào)越強(qiáng)?；蛐酒夹g(shù)測(cè)序的準(zhǔn)確率較高，國(guó)外學(xué)者利用包含大量探針的微列陣對(duì)人類線粒體基因組的序列進(jìn)行測(cè)定，準(zhǔn)確率達(dá)99％。3、發(fā)現(xiàn)新基因

利用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)新基因在醫(yī)學(xué)上有極其重要的意義，尤其是致癌基因的發(fā)現(xiàn)。研究人員利用基因芯片技術(shù)，篩選微生物誘導(dǎo)后的成年果蠅差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)數(shù)百個(gè)未知功能的新基因。

Yao等采用基因芯片技術(shù)，設(shè)計(jì)了乳腺癌比較基因組雜交陣列，分析了與擴(kuò)增區(qū)域有關(guān)的每個(gè)基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)2個(gè)致癌新基因，分別為H2AFJ、EPS8。4、病原檢測(cè)

DNA芯片技術(shù)作為一種強(qiáng)有力的檢測(cè)工具，在臨床診斷、環(huán)境檢測(cè)、食品安全檢測(cè)等領(lǐng)域得到了廣泛運(yùn)用。

周鈞等利用日本血吸蟲基因芯片對(duì)江西省#湖南省的釘螺進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，江西省、湖南省感染性釘螺檢出率為100%。

張錦海等根據(jù)瘧原蟲高度保守的基因片段制備了瘧原蟲診斷、分型基因芯片，能快速診斷出瘧原蟲及其分型，對(duì)瘧疾的防治具有重要意義5、繪制圖譜

采用基因芯片探針陣列與相應(yīng)的生物信息方法可以進(jìn)行基因文庫(kù)作圖。張新建等用基因芯片技術(shù)研究了水稻白葉枯病菌的侵染過程，并分析其基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)侵染過程中有5個(gè)基因發(fā)生了明顯變化。趙寶存等采用基因芯片技術(shù)獲得小麥基因的差異表達(dá)圖譜，并分析了在不同鹽脅迫時(shí)間下小麥根部基因表達(dá)的變化，包括鹽誘導(dǎo)、鹽抑制表達(dá)基因。此外：

由于心血管系統(tǒng)生理和病理過程相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是一個(gè)綜合的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，需要借助復(fù)雜系統(tǒng)的研究理論和方法來(lái)完成?；蛐酒夹g(shù)利用高度集成的cDNA/EST片段或寡核苷酸微陣列，可同時(shí)采集到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中多個(gè)節(jié)點(diǎn)的基因表達(dá)信息，因而能更好地滿足研究心血管系統(tǒng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的要求.因此，應(yīng)用基因表達(dá)芯片可全面研究與某一心血管疾病相關(guān)的基因群，有利于發(fā)現(xiàn)更多的心血管病基因表達(dá)水平上的標(biāo)志物。六、基因芯片的優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：快速、高效、自動(dòng)化。

基因芯片不僅能在早期診斷中發(fā)揮作用；與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，它可以在一張芯片上，同時(shí)對(duì)多個(gè)病人進(jìn)行多種疾病的檢測(cè)；利用基因芯片，還可以從分子水平上了解疾病?；蛐酒倪@些優(yōu)勢(shì)，能夠使醫(yī)務(wù)人員在短時(shí)間內(nèi)掌握大量的疾病診斷信息，找到正確的治療措施。除此之外，基因芯片在新藥的篩選、臨床用藥的指導(dǎo)等方面，也有重要作用。不足之處：

盡管基因芯片技術(shù)已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的發(fā)展，得到世人的矚目，但仍然存在著許多難以解決的問題，例如技術(shù)成本昂貴、復(fù)雜、檢測(cè)靈敏度較低、重復(fù)性差、分析泛圍較狹窄等問題。這些問題主要表現(xiàn)在樣品的制備、探針合成與固定、分子的標(biāo)記、數(shù)據(jù)的讀取與分析等幾個(gè)方面。此外價(jià)格昂貴，只有比較大的藥廠或研究所能負(fù)擔(dān)得起，所以仍未廣泛使用。（1）樣品制備：在標(biāo)記和測(cè)定前都要對(duì)樣品進(jìn)行一定程度的擴(kuò)增以便提高檢測(cè)的靈敏度，但仍有不少人在嘗試?yán)@過該問題，這包括MosaicTechnolo